SEC11基因的HIGS表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性分析

唐 喆，王光輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【研究意義】稻瘟菌 (Magnaportheoryzae) 是一種重要的植物病原真菌，也是研究植物-病原真菌互作的模式生物之一[1]。由稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻上危害最嚴(yán)重的病害之一，其每年導(dǎo)致水稻產(chǎn)量損失達(dá)10%～30%，造成超過700億美元的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅世界糧食安全[2-3]。因此，稻瘟病的防控已成為水稻生產(chǎn)中的重要內(nèi)容。目前，在水稻生產(chǎn)中稻瘟病的防控主要依賴于施用化學(xué)藥劑和種植抗稻瘟病水稻品種。但是化學(xué)農(nóng)藥防治費(fèi)用較高，且容易造成抗藥性和環(huán)境污染等問題。而稻瘟菌群體易發(fā)生變異的特點(diǎn)，致使新的抗病品種在推廣3～5年后容易丟失抗性。稻瘟病菌基因組測(cè)序工作已于2005年完成并公布[4]，通過生物信息學(xué)分析在稻瘟菌基因組中預(yù)測(cè)到12 841個(gè)基因，這極大地推動(dòng)了稻瘟菌遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)的研究。目前，已鑒定出一大批參與稻瘟菌生長發(fā)育和致病過程的關(guān)鍵基因，這為新型綠色殺菌劑的研發(fā)和新型抗病分子育種提供了新的作用靶標(biāo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，小片段RNA在細(xì)胞內(nèi)能夠引發(fā)RNA干擾現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因的沉默[5-6]。近年來，科學(xué)家利用RNA干擾原理發(fā)展出了寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)技術(shù)，通過在植物細(xì)胞中產(chǎn)生小干擾RNA(siRNA)進(jìn)而靶向并沉默病原菌的關(guān)鍵基因，目前該技術(shù)已在植物與病原菌的互作研究中被廣泛應(yīng)用[7-9]。在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)靶向病原菌關(guān)鍵基因的dsRNA，其經(jīng)植物細(xì)胞Dicer蛋白切割后會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的siRNA。當(dāng)病原菌侵染寄主植物時(shí)，植物寄主能將siRNA轉(zhuǎn)入病原菌細(xì)胞內(nèi)使其與靶基因的mRNA結(jié)合，并將后者進(jìn)行特異性的降解，從而干擾病原菌靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。HIGS技術(shù)不僅可以作為一種反向遺傳學(xué)手段用于研究病原菌關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能，也可以作為一種新型的抗病育種策略以提高植物對(duì)特定病害的抗性。目前，HIGS技術(shù)已在小麥、大麥、水稻、棉花等多種作物的抗病分子育種中得到應(yīng)用[10-14]。信號(hào)肽(Signal Peptide)是分泌蛋白或膜蛋白新生多肽鏈合成過程中位于N末端的一段氨基酸序列，其指導(dǎo)新生蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[15-16]。當(dāng)新生蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，N端信號(hào)肽會(huì)被信號(hào)肽酶(Signal Peptidase)水解去除，隨后新生蛋白再經(jīng)過折疊等一系列加工過程形成成熟的蛋白[17]。信號(hào)肽酶是一類蛋白酶家族，廣泛存在于生物體中，其通過由多個(gè)蛋白亞基組成的信號(hào)肽酶復(fù)合物(Signal Peptidase Complex，SPC)來發(fā)揮功能。在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中，信號(hào)肽酶復(fù)合物由四個(gè)亞基組成，其中僅有SEC11對(duì)細(xì)胞生長、信號(hào)肽切割和信號(hào)肽酶依賴的蛋白質(zhì)降解具有重要作用[18-19]。SEC11基因編碼信號(hào)肽酶復(fù)合物的催化亞基，其介導(dǎo)了分泌蛋白N端信號(hào)肽的切除[20]。另外，SEC家族蛋白的其它成員在信號(hào)肽酶復(fù)合物形成過程中發(fā)揮重要功能，其在調(diào)控病原菌致病過程中也扮演了重要角色[21-24]。例如，在新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)中，SEC6基因的RNAi突變株中多種毒力因子存在缺陷，對(duì)小白鼠的毒力明顯降低[25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】選取稻瘟菌SEC11為靶基因，成功構(gòu)建了SEC11基因的HIGS載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將SEC11基因的HIGS載體導(dǎo)入水稻品種日本晴中，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)稻瘟病菌的抗性水平顯著升高?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究不但創(chuàng)制了新的抗稻瘟病的水稻材料，也為利用HIGS技術(shù)作為新的抗稻瘟病分子育種策略提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌AGL1，質(zhì)粒pDONR221(Kan+)，質(zhì)粒pBDL03(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉文德研究員惠贈(zèng))，稻瘟菌70-15，水稻日本晴(本實(shí)驗(yàn)室保存)。TRIzol?Reagent，Gateway?BPClonaseTMIIEnzymeMix，Gateway?LRClonaseTMIIEnzymeMix購于Invitrogen公司。內(nèi)切酶(EcoR V、KpnI、SacI)購于NEB公司。dNTP和TaqDNA聚合酶購于Fermentas公司。氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)，卡那霉素(Kanamycin，Kan)，潮霉素(HygromycinB，Hyg)和利福平(Rifampicin，Rif)購于Roche公司。質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生物公司，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)化學(xué)純，引物合成和質(zhì)粒測(cè)序均由擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 RNAi干擾序列的選擇與引物設(shè)計(jì)

在稻瘟菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index)中，查詢并下載SEC11基因(MGG_00114)的CDS(codingsequence)序列。利用BLOCK-iTTMRNAiDesigner在線工具(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)查找SEC11基因中最佳的干擾序列，該序列不包含EcoR V、SacI和KpnI的酶切位點(diǎn)。利用Primer 6.0設(shè)計(jì)干擾區(qū)段的特異引物SEC11-F和SEC11-R，在兩條引物的5′端分別加上Gateway的接頭序列(下劃線所示)。引物設(shè)計(jì)結(jié)果如下：SEC11-F：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAGCACCTCGCCCAAGA-3′；SEC11-R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGC TGGGTCAGCCACCAAACTCCACATCC-3′。根據(jù)潮霉素抗性基因，設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，如下：F1: 5′-TTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAA-3′；R1:5′-GTATTGAC CGATTCCTTGCGGTCCGAA-3′。

1.3 RNA提取與目標(biāo)干擾片段的獲得

用TRIzol試劑(按照試劑提供的操作說明)提取稻瘟菌70-15菌株的總RNA，隨后將稻瘟菌RNA通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以稻瘟菌cDNA為模板，以SEC11-F和SEC11-R為引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SEC11基因的RNAi干擾片段。將獲得的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，驗(yàn)證其條帶大小正確后，使用DNA凝膠回收試劑盒將目的DNA條帶進(jìn)行回收，并測(cè)定其濃度。

PCR擴(kuò)增體系采用50 μL體系：1 μL cDNA(50 μg/μL)，SEC11-F(10 μmol/L)和SEC11-R(10 μmol/L)各2 μL，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.6 μL DNA polymerase(500 U/μL)，5 μL 10 PCR buffer(含MgCl2)和36.4 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 HIGS表達(dá)載體的構(gòu)建

利用GatewayBP試劑盒構(gòu)建入門載體pDONR221-SEC11(圖1)。按照試劑盒說明書，將膠回收的PCR產(chǎn)物與載體pDONR221在BP緩沖液中進(jìn)行重組反應(yīng)。將BP反應(yīng)后得到的產(chǎn)物用無菌水稀釋4倍后取1 μL，采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含有卡那霉素的LB篩選平板(50 mg/L Kan)上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取篩選平板上的單克隆菌落，在LB培養(yǎng)基(50 mg/L Kan))中37 ℃過夜搖培，然后提取質(zhì)粒pDONR221-SEC11。提取的質(zhì)粒用引物SEC11-F和SEC11-R進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定陽性克隆。將陽性克隆質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，保證插入SEC11基因干擾片段的正確性。

將測(cè)序正確的入門載體pDONR221-SEC11，利用EcoR V內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，隨后用GatewayLR反應(yīng)試劑盒構(gòu)建HIGS表達(dá)載體(圖2)。參照試劑盒說明書，將線性化的入門載體pDONR221-SEC11和pBDL03載體在LR反應(yīng)體系中進(jìn)行同源重組。重組后獲得的反應(yīng)產(chǎn)物用無菌水稀釋4倍后取1 μL，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，操作步驟同上，最終獲得質(zhì)粒pBDL03-SEC11。在質(zhì)粒上的GUSlinker處設(shè)計(jì)測(cè)序引物，GUSLR1：5′-GACCAAAGCCAGTAAAGTAGAAC G-3′，GUSLF2：5′-CGTCGGTGAACAGGTATGGAA-3′，分別測(cè)出Gus linker兩側(cè)插入的靶標(biāo)序列。如測(cè)序結(jié)果顯示Guslinker兩側(cè)分別插入一個(gè)SEC11基因的干擾片段，形成方向相反的串聯(lián)重復(fù)，則表示成功獲得HIGS表達(dá)載體pBDL03-SEC11。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與鑒定

首先利用電轉(zhuǎn)化法，將HIGS載體pBDL03-SEC11轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細(xì)胞，通過LB平板(50 mg/L Kan，50 mg/L Rif)篩選獲得含有HIGS載體的農(nóng)桿菌菌株。參照Hiei等人的方法[26-27]進(jìn)行水稻日本晴的轉(zhuǎn)化：將水稻成熟的愈傷組織與含有HIGS載體的農(nóng)桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，在水稻愈傷組織生長培養(yǎng)基(50 mg/L Amp，50 mg/L Hyg)上進(jìn)行2～3次篩選，得到含有潮霉素抗性的水稻愈傷組織，經(jīng)過愈傷組織分化與再生，得到T0代轉(zhuǎn)基因水稻株系。在HIGS載體pBDL03-SEC11上帶有編碼mCherry紅色熒光蛋白的基因，因而可以在植物活體成像儀下觀察轉(zhuǎn)基因植株中mCherry紅色熒光蛋的表達(dá)情況[28-29]。利用PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中潮霉素抗性基因和RNAi干擾片段是否存在，最終明確含有HIGS載體pBDL03-SEC11的轉(zhuǎn)基因水稻植株。

1.6 轉(zhuǎn)基因水稻植株抗病性分析

收獲T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株的種子后，選取5株轉(zhuǎn)基因水稻的種子在溫室條件下進(jìn)行種植獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株(各種植4株)。采用噴霧法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行稻瘟菌分生孢子接種[30]。收集稻瘟菌野生型菌株70-15的分生孢子，用2.5‰的明膠溶液制備成孢子懸浮液(濃度為1×105個(gè)/mL)，用50 mL噴霧器將分生孢子懸浮液均勻地噴到3葉期的水稻(包括水稻野生型和轉(zhuǎn)基因植株)葉片表面。在保濕箱中25 ℃避光保濕2 d，再轉(zhuǎn)移至28 ℃光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。接種7 d后，對(duì)各組水稻葉片上的稻瘟菌病斑進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)和抗病性分析，明確含有HIGS載體pBDL03-SEC11的轉(zhuǎn)基因水稻植株的抗病性。

圖1 pDONR221載體與SEC11基因干擾片段構(gòu)建入門載體pDONR221-SEC11示意圖Fig.1 Diagram showing the construction of pDONR221-SEC11 by the recombination of pDONR221 plasmid and rice blast SEC11 gene fragment

圖2 HIGS表達(dá)載體pBDL03-SCE11構(gòu)建示意圖Fig.2 Diagram showing the construction of HIGS expression vector pBDL03-SEC11

2 結(jié)果與分析

2.1 SEC11基因干擾片段的獲得

在稻瘟菌基因組數(shù)據(jù)庫中下載SEC11的CDS序列，利用RNAiDesigner工具尋找最優(yōu)的RNAi干擾片段。通過Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物SEC11-F和SEC11-R。以稻瘟菌70-15的cDNA為模板，用引物SEC11-F和SEC11-R，擴(kuò)增獲得SEC11基因的特異干擾片段。用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示，SEC11基因干擾片段大小為348 bp。

2.2 入門載體pDONR221-SEC11的構(gòu)建及鑒定

將SEC11基因的最優(yōu)RNAi干擾片段與入門載體pDONR221進(jìn)行BP重組反應(yīng)。SEC11基因干擾片段會(huì)將載體pDONR221上的ccdB基因通過同源重組進(jìn)行替換，從而獲得入門載體pDONR221-SEC11。在pDONR221載體上含有ccdB基因，而該基因產(chǎn)生的ccdB毒性蛋白可導(dǎo)致大腸桿菌DH5α的死亡，因而含有未重組pDONR221載體的陰性克隆不能生長。在篩選平板上隨機(jī)選擇4個(gè)單克隆菌株，搖培擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒。以SEC11-F和SEC11-R為引物，用PCR對(duì)pDONR221-SEC11質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可以檢測(cè)到陽性克隆中含有348 bp的SEC11基因干擾片段。將PCR檢測(cè)為陽性的質(zhì)粒pDONR221-SEC11，送往擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示插入的SEC11干擾片段完全正確(圖4)，表明SEC11基因干擾片段成功連接到入門載體pDONR221上。

M: DNAMarker DS2000；1: SEC11基因干擾片段 M: DNAMarker DS2000; 1: The fragment of SEC11gene圖3 稻瘟菌基因SEC11片段檢測(cè)Fig.3 Agarose electrophoresis of SEC11 fragment from rice blast fungus

圖4 構(gòu)建的質(zhì)粒pDONR221-SEC11與SEC11基因序列的比對(duì)Fig.4 Sequencing result of vector pDONR221-SEC11alignment with SEC11gene

2.3 HIGS表達(dá)載體pBDL03-SEC11的構(gòu)建及鑒定

將線性化的入門載體pDONR221-SEC11與pBDL03載體進(jìn)行LR 重組反應(yīng)，入門載體上的SEC11干擾片段會(huì)通過同源重組機(jī)制分別插入到pBDL03載體上Guslinker的兩側(cè)，形成反向重復(fù)序列。將得到的重組HIGS表達(dá)載體pBDL03-SEC11經(jīng)SacI和KpnI雙酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳可檢測(cè)到10和2 kb左右的兩條電泳條帶。將雙酶切鑒定正確的HIGS質(zhì)粒pBDL03-SEC11送擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒。

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得與鑒定

將測(cè)序正確的HIGS表達(dá)載體pBDL03-SEC11通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1菌株中，經(jīng)過PCR檢測(cè)獲得含有HIGS載體的農(nóng)桿菌陽性菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，將HIGS載體pBDL03-SEC11轉(zhuǎn)入水稻日本晴品種中，獲得28株含有HIGS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因水稻T0代植株。T0代轉(zhuǎn)基因水稻經(jīng)過種植后收獲種子，選取其中5株T0代轉(zhuǎn)基因水稻的種子進(jìn)行種植得到T1代轉(zhuǎn)基因水稻植株(每個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻分別種植4株)。為了驗(yàn)證T1代轉(zhuǎn)基因水稻中是否含有HIGS表達(dá)載體，提取了T1代轉(zhuǎn)基因水稻葉片的基因組DNA，使用潮霉素抗性基因和SEC11基因干擾片段的特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在5個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻中均可以檢測(cè)到特異的潮霉素抗性基因片段(圖5)和SEC11基因干擾片段(圖6)，而野生型水稻日本晴植株中檢測(cè)不到這兩個(gè)條帶。在陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株中，潮霉素抗性基因擴(kuò)增條帶大小為487 bp，SEC11基因干擾片段大小為348 bp，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，表明檢測(cè)的5株轉(zhuǎn)基因水稻中均含有HIGS表達(dá)載體pBDL03-SEC11。

2.5 HIGS轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析

將野生型水稻日本晴及T1代陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株培養(yǎng)至3葉期，用噴霧法接種濃度為1×105個(gè)/mL的稻瘟菌70-15菌株的分生孢子，接種7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況(5個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻每個(gè)種植4株，3次生物學(xué)重復(fù))。如圖7所示，與野生型水稻日本晴相比，5株SEC11基因的HIGS轉(zhuǎn)基因水稻葉片上的總病斑和大病斑數(shù)量都明顯減少。以Hayashi等[31]提出的稻瘟菌單基因抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為參考，對(duì)野生型水稻和轉(zhuǎn)基因植株上的稻瘟菌病斑數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示以稻瘟菌SEC11基因?yàn)榘袠?biāo)的5株HIGS轉(zhuǎn)基因水稻葉片上的病斑數(shù)較野生型水稻日本晴減少了12%～60%(圖8)，不同轉(zhuǎn)基因株系之間的抗病性存在不同程度的差異。綜上所述，靶向稻瘟菌SEC11基因的HIGS轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)稻瘟菌具有顯著的抗病性。

3 討 論

RNAi技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、周期短、成本低、效率高、特異性高等特點(diǎn)，已成為原生生物、動(dòng)物和植物等生物功能基因組學(xué)研究的重要工具[32-35]。近年來，基于RNAi干擾原理發(fā)展起來的HIGS技術(shù)發(fā)展迅猛，其不但成為病原真菌與植物互作研究領(lǐng)域中的重要研究手段，也在一些植物的抗病實(shí)踐中取得了顯著成果。HIGS技術(shù)作為一種新興的抗病育種策略，已成功運(yùn)用到小麥[10-12]、水稻[13]和棉花[14]等重要經(jīng)濟(jì)作物的抗病研究和生產(chǎn)實(shí)踐中。HIGS轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生以病原菌關(guān)鍵基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA，dsRNA被細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶識(shí)別，切割成為21～25 nt大小的siRNA。當(dāng)病原菌侵染寄主時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物能夠?qū)iRNA轉(zhuǎn)移至病原菌細(xì)胞中，特異的識(shí)別病原菌的靶基因mRNA并將其降解，從而抑制病原菌的生長和致病過程。HIGS技術(shù)可以顯著提高寄主植物的抗病性，表明在受到病原菌侵染時(shí)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的siRNA可以轉(zhuǎn)移至病原菌中并沉默相應(yīng)的靶基因。然而，這些siRNA分子通過何種途徑和分子機(jī)制進(jìn)入到病原菌細(xì)胞內(nèi)的，尚不清楚。

M: DS2000DNAMarker；1～5：轉(zhuǎn)化pBDL03-SEC11的水稻陽性植株；WT: 野生型水稻日本晴 M: DS2000DNAMarker; 1-5: Transgenic plant carrying BDL03-SEC11; WT: Wild-type rice cultivar Nipponbare圖5 轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素片段PCR檢測(cè)Fig.5 PCR detection of HYG fragment in transgenic rice plants

1～5: 轉(zhuǎn)化pBDL03-SEC11的陽性植株；M: DS2000DNA Marker；WT: 野生型水稻日本晴 1-5: Transgenic plant carrying pBDL03-SEC11; M: DS2000 DNA Marker; WT: Wild-type rice cultivar Nipponbare圖6 轉(zhuǎn)基因水稻SEC11基因片段PCR檢測(cè)Fig.6 PCR detection of SEC11 fragment in transgenic rice plants

4 結(jié) 論

本研究利用Gateway基因重組技術(shù)，成功構(gòu)建了稻瘟菌SEC11基因的HIGS表達(dá)載體。Gateway基因重組技術(shù)的應(yīng)用，使得HIGS載體的構(gòu)建過程更加的快捷方便，只需兩次體外同源重組反應(yīng)即可獲得最終的HIGS載體。尤其是在pBDL03載體上存在兩個(gè)方向相反的attR同源重組位點(diǎn)，因而通過一次同源重組反應(yīng)就可以將兩個(gè)SEC11干擾片段分別插入到這兩個(gè)attR位點(diǎn)上，最終得到由GUSlinker連接的兩個(gè)方向相反的SEC11干擾片段。這兩個(gè)反向串聯(lián)重復(fù)的SEC11干擾片段可以被UBi啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA并形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生dsRNA。另外，在pDONR221和pBDL03載體上都含有ccdB基因作為負(fù)篩選標(biāo)記，ccdB基因編碼的毒性蛋白對(duì)于DH5α大腸桿菌是致死的，因而未發(fā)生正確同源重組的陰性克隆不能存活，從而顯著地提高篩選平板上陽性克隆的比例。

WT: 野生型水稻日本晴；1～5: 轉(zhuǎn)基因水稻 WT: Wild-type rice cultivar Nipponbare; 1-5: Transgenic rice carrying pBDL03-SEC11圖7 稻瘟菌70-15在野生型和HIGS轉(zhuǎn)基因水稻上的發(fā)病情況Fig.7 Disease symptom developed on the wild type and transgenic rice inoculated by Magnaporthe oryzae strain 70-15

WT: 野生型水稻日本晴；1～5: 轉(zhuǎn)基因水稻*,P<0.05,**,P<0.01，單邊t檢驗(yàn) WT: Wild type rice; 1-5: Transgenic rice carrying pBDL03-SEC11,*,P<0.05,**,P<0.01，t test圖8 野生型和轉(zhuǎn)基因水稻葉片上相對(duì)病斑數(shù)Fig.8 Relative number of lesion spots on leaves of the wild type and transgenic rice

由于水稻大部分基因與稻瘟菌的基因序列不存在同源性，因而HIGS轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的siRNA一般不會(huì)對(duì)水稻本身造成危害，表明HIGS技術(shù)在水稻抗病分子育種方面具有巨大的應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果顯示，以稻瘟菌SEC11為靶標(biāo)的HIGS轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻相比，總病斑數(shù)和病斑大小都顯著降低，表明該HIGS轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)到稻瘟菌具有顯著的抗病性。然而，相比于HIGS技術(shù)在抗小麥白粉菌[10]、黃色鐮刀菌[7]、條銹菌[11-12]和灰霉菌[36]應(yīng)用的研究，本研究獲得的轉(zhuǎn)基因水稻的抗性水平仍需要進(jìn)一步提高。據(jù)報(bào)道，不同HIGS表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物的沉默效果也不盡相同，甚至有HIGS載體隨機(jī)插入到寄主的關(guān)鍵性基因中[37]，導(dǎo)致寄主植株出現(xiàn)嚴(yán)重的表型缺陷。如何安全有效的選擇靶標(biāo)基因干擾片段，以及如何構(gòu)建穩(wěn)定的且不影響植物表型的HIGS表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)于研究植物與真菌互作關(guān)系以及獲得穩(wěn)定安全的轉(zhuǎn)基因抗病植物都具有重要的指導(dǎo)意義。未來的不斷嘗試和探索將會(huì)推動(dòng)HIGS技術(shù)的不斷發(fā)展和更新，這些問題也將會(huì)得到更好的解決，使得HIGS技術(shù)在抗病作物分子育種方面具有更廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景[38]。