代文東,鐵拿優(yōu),瑪麗亞,張 超 ,唐 容, 王少銘,楊 斌,王璐璐,饒 勇,黃澤素*
(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所,貴州 貴陽 550006;2.蘇蘭拉里理工大學(xué)農(nóng)學(xué)院,泰國 呵叻府 30000)
【研究意義】花青素是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物,是形成植物花和果實(shí)顏色的主要色素[1]。目前,自然界中已發(fā)現(xiàn)的花色苷主要由天竺葵素、矢車菊素等6類花青素衍生而來,不同花色苷種類及環(huán)境條件使植物顯現(xiàn)不同的顏色[2]。研究表明,花青素具有使植物體抵御低溫凍害[3],提升抗旱能力[4],增強(qiáng)抗寒能力[5]的作用。此外,植物花青素還具有抗氧化、抗炎癥、保護(hù)心腦血管、預(yù)防阿爾茲海默病等生物保健功能[6-7]。葉綠素是植物光合作用的重要色素,其含量的高低對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的影響[8]。因此,花青素和葉綠素的遺傳改良在植物高產(chǎn)、抗逆、觀光、保健等多功能新品種選育上具有較大的應(yīng)用前景?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來,受極端氣候的影響,抗逆性成為油菜新品種選育的主攻目標(biāo)之一。同時(shí),隨著油菜的菜用、農(nóng)旅觀光等多用途的推廣應(yīng)用,營養(yǎng)保健價(jià)值高、色彩豐富多樣化的油菜種質(zhì)創(chuàng)新逐漸受到廣大科研人員的重視[9]。植物花青素生物合成受結(jié)構(gòu)基因及轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控[10],“MBW”復(fù)合體(MYB,bHLH和WD40錄因子)調(diào)控花青素生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[11-12],目前在擬南芥[13]、紫菜薹[14]、黑果枸杞[15]、洋蔥[16]、苦蕎[17]等植物花青素相關(guān)合成調(diào)控基因上得到深入研究。在甘藍(lán)型油菜中,除Li等[18]采用圖位克隆定位到位于A03染色體上的BnaA.PL1可能是調(diào)控紫紅葉的主要候選基因外,少有調(diào)控甘藍(lán)型油菜紫紅葉的基因被報(bào)道。Wang等[19]利用甘藍(lán)型油菜葉綠素缺乏突變體“cde1”與中雙11構(gòu)建的分離群體,在C08染色體上定位到22個(gè)候選基因可能與葉綠素含量相關(guān);Zhao等[20]利用黃化突變體“yvl”與綠葉“ZS9”構(gòu)建的分離群體,通過BSA-seq定位發(fā)現(xiàn)BnaA03.CHLH在突變體中單堿基突變導(dǎo)致葉綠體發(fā)育和葉綠素合成受到影響。此外,在甘藍(lán)型油菜中BnaC07.HO1的缺失也會(huì)導(dǎo)致葉綠素的合成受到影響[21],薦紅舉等[22]采用全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選到5個(gè)葉綠素合成途徑相關(guān)的候選基因。綜上可見,油菜葉片中花青素和葉綠素的合成和調(diào)控相對(duì)復(fù)雜。【本研究切入點(diǎn)】針對(duì)甘藍(lán)型油菜多功能應(yīng)用對(duì)葉色、生物保健等特異功能型品種的需求,利用貴州省油料研究所通過遠(yuǎn)緣雜交育成的紫紅葉甘藍(lán)型油菜新品系構(gòu)建遺傳分離群體,對(duì)葉片花青素及葉綠素含量的遺傳機(jī)制開展研究?!緮M解決的關(guān)鍵問題】通過選擇紫紅葉和綠葉油菜品系構(gòu)建遺傳分離群體,定位相關(guān)性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait loci,QTL),為研究甘藍(lán)型油菜葉片花青素和葉綠素的分子遺傳機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
利用甘藍(lán)型紫紅葉油菜10-Zi006與綠葉油菜10-4438雜交,以10-4438回交構(gòu)建包含91個(gè)單株的BC1群體[23],分別測(cè)定群體單株的葉片花青素和葉綠素含量;通過DarT-seq技術(shù)對(duì)BC1群體單株進(jìn)行基因分型并構(gòu)建連鎖遺傳圖譜,圖譜包含1614個(gè)bin(含9212個(gè)SNP和insilicoDarTs多態(tài)性標(biāo)記)、構(gòu)成21個(gè)連鎖群、覆蓋甘藍(lán)型油菜19條染色體、總長(zhǎng)3616.38 cM,標(biāo)記平均遺傳距離2.24 cM。
BC1群體及雙親種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省油料研究所貴陽試驗(yàn)地內(nèi)。采用育苗移栽,行距45 cm,行長(zhǎng)240 cm,每行種植8窩,每窩2株移栽,其中,BC1群體共91個(gè)單株。育苗、移栽、施肥等按大田生產(chǎn)方式管理。
采用分光光度法測(cè)定葉片花青素相對(duì)含量[24],于油菜苗期(6~7葉)取平展頂葉,群體樣品取樣同一天完成;單株取300 mg新鮮樣品加入1 mL的酸性甲醇(1% HCl,w/v),室溫下震蕩18 h后離心1 min,取400 μL上清液加到600 μL 酸性甲醇中,利用UV-7504分光光度計(jì)測(cè)定530和657 nm的吸光度,花青素相對(duì)含量= (吸光度530-0.25×吸光度657)/樣品重量。采用日本柯尼卡美能達(dá)葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502 Plus)測(cè)定葉片葉綠素含量,于苗期6~7葉時(shí)測(cè)定平展頂葉,每個(gè)單株測(cè)定5次取平均值。群體親本花青素相對(duì)含量、葉綠素含量測(cè)定方法同上,每個(gè)親本測(cè)5個(gè)單株取平均值。
采用Windows QTL Cartographer 2.5的復(fù)合區(qū)間作圖(Composite interval mapping,CIM)法進(jìn)行QTL定位[25]。在顯著性水平(P<0.05)的條件下,進(jìn)行1000次排列檢驗(yàn)(Permutation test),窗口大小10 cM,步長(zhǎng)為2 cM,置信區(qū)間設(shè)為95%。QTL命名參照標(biāo)準(zhǔn)命名法[26],即q+性狀英文首字母+連鎖群,若同一條連鎖群上檢測(cè)到多個(gè)QTL,依據(jù)順序進(jìn)行編號(hào)。通過blastn(E-value = 0.0000005,堿基一致性≥90%)將定位到的QTL置信區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記與甘藍(lán)型油菜基因組(Darmor-bzh v4.1)進(jìn)行比對(duì),確定QTL的物理位置和區(qū)段,并根據(jù)參考基因組的基因注釋挖掘QTL區(qū)段內(nèi)與花青素(Anthocyanin Content AC)和葉綠素含量(Chlorophyll Content CC)相關(guān)的候選基因。
表1 雙親及BC1群體葉片花青素及葉綠素(SPAD)含量
從表1可見,親本10-Zi006和10-4438葉片花青素相對(duì)含量分別為2.08和0.19,差異達(dá)極顯著水平。BC1群體91個(gè)單株花青素相對(duì)含量均值為0.35,單株最大值和最小值分別為0.65和0.20,變異系數(shù)為0.32,偏度和峰度值分別為3.22和0.11,群體花青素相對(duì)含量呈連續(xù)性的偏態(tài)分布,且偏向綠葉油菜親本(圖1);群體葉片葉綠素含量(SPAD)均值為54.05,最大值和最小值分別為62.28和43.58,變異系數(shù)為0.08,偏度和峰度值均為-0.73,SPAD值在BC1群體中的分布符合連續(xù)正態(tài)分布(圖1)。
從表2和圖2看出,在BC1群體中共檢測(cè)到14個(gè)甘藍(lán)型油菜葉片花青素含量QTL,分別位于a03、a04、a05、a06、c02和c04連鎖群上,其中,在a03連鎖群中上部共檢測(cè)到4個(gè)花青素含量相關(guān)QTL“qAC-a03-1、qAC-a03-2、qAC-a03-3、qAC-a03-4”,貢獻(xiàn)率分別為19.13%、11.47%、13.77%及9.17%,加性效應(yīng)值分別為0.25、-0.22、-0.24及-0.20;在a04連鎖群中部檢測(cè)到1個(gè)花青素QTL,為qAC-a04,貢獻(xiàn)率為12.21%,加性效應(yīng)值為0.18;在a05連鎖群的尾部區(qū)域檢測(cè)到3個(gè)QTL,分別為qAC-a05-1、qAC-a05-2、qAC-a05-3,貢獻(xiàn)率分別為17.86%、12.19%及9.35%,加性效應(yīng)值分別為0.30、-0.22和-0.14;在a06連鎖群尾部區(qū)域檢測(cè)到2個(gè)QTL,分別為qAC-a06-1和qAC-a06-2,貢獻(xiàn)率分別為14.32%和12.76%,加性效應(yīng)值分別為0.15和-0.21;在c02連鎖群中上部檢測(cè)到1個(gè)QTL,為qAC-c02,貢獻(xiàn)率為9.58%,加性效應(yīng)值為-0.19;在c04連鎖群中上部區(qū)域檢測(cè)到3個(gè)QTL,貢獻(xiàn)率分別為14.11%、13.05%和12.68%,加性效應(yīng)值分別為-0.16、-0.16和0.20。
花青素相對(duì)含量QTL與甘藍(lán)型油菜參考基因組比對(duì)結(jié)果顯示:qAC-a03-1定位在甘藍(lán)型油菜chrA03染色體14 375 878~14 531 029 bp或7974 055~9494 481 bp處;qAC-a03-2定位在chrC03染色體15 157 498~15 305 606 bp或chrA03染色體15 241 024~15 451 083 bp處;qAC-a03-3定位在chrC3染色體23 258 741~23 290 766 bp處;qAC-a03-4定位在chrC03染色體23 290 766~23 961 992 bp或chrA03染色體23 378 247~23 894 826 bp處。qAC-a04定位在chrAnn_random染色體24 108 187~24 334 179 bp處;qAC-a05-1定位在chrA05染色體20 836 827~20 860 866 bp處、qAC-a05-2和qAC-a05-3分別定位在chrA05染色體的21 076 461~21 273 466和21 468 153~21 958 297 bp處;qAC-a06-1定位在chrC07染色體26 581 773~27 205 442 bp或chrAnn_random 26 119 902~26 408 031 bp處、qAC-a06-2分別定位在chrC07染色體32 973 868~32 976 167 bp處;qAC-c02定位到chrC02染色體的39 004 304~397 809 943 bp處;qAC-c04-1、qAC-c04-2及qAC-c04-3分別定位在chrC04、chrA05和chrC04_random的41 372 213、13 208 159和3672 853 bp處。
圖1 BC1群體花青素相對(duì)含量及葉綠素含量(SPAD值)的頻次分布Fig.1 Frequency distribution of leaf anthocyanin and chlorophyll content in BC1 population
表2 甘藍(lán)型油菜葉片花青素含量QTL
圖2 花青素QTLs在遺傳連鎖圖譜上的位置Fig.2 The location of anthocyanin QTLs on genetic linkage map
表3 甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素素含量QTL
圖3 葉綠素QTLs在遺傳連鎖圖譜上的位置Fig.3 The location of chlorophyll QTLs on genetic linkage map
表4 甘藍(lán)型油菜葉片花青素含量QTL置信區(qū)間的候選基因
表3和圖3顯示,在BC1群體中,共檢測(cè)到8個(gè)甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素含量QTL,分別位于a01、a03、a06、a07、c01、c03和c04連鎖群上,其中,在a01連鎖群中下部檢測(cè)到1個(gè)QTL,為qCC-a01,貢獻(xiàn)率為11.87%,加性效應(yīng)值為-9.20;在a03連鎖群尾部檢測(cè)到2個(gè)QTL,為qCC-a03-1和qCC-a03-2,貢獻(xiàn)率分別為11.35%和13.07%,加性效應(yīng)值分別為7.89和-7.38;在a06、a07、c01、c03和c04連鎖群上各檢測(cè)到1個(gè)QTL,分別為qCC-a06、qCC-a07、qCC-c01、qCC-c03和qCC-c04,貢獻(xiàn)率分別為10.67%、12.44%、8.56%、4.45%和11.15%,加性效應(yīng)值為分別為7.85、-4.99、-5.50、8.86和-5.32。
qCC-a03-1定位在chrC07或chrA03或chrAnn_random染色體的40 195 918~42 813 040、8514 969~9503 464和40 416 892~43 532 944 bp間;qCC-a03-2定位在chrA03或chrAnn_random染色體5844 483~9288 940和45 167 243~48 597 583 bp間;qCC-a06定位在chrA06或chrAnn_random染色體16 524 327~16 746 972和21 398 996~21 398 996 bp間;qCC-a07定位在chrA07或chrCnn_random或chrC06染色體17 713 130~17 879 685、16 027 129~16 069 799 bp或26 172 817~26 326 124 bp間;qCC-c01定位在chrC01或chrAnn_random染色體10 969 542~11 114 856 bp或32 703 675~40 769 451 bp間;qCC-c03定位在chrC03或chrA08或chrC03_random染色體49 137 343~50 108 660、12 916 728~13 809 226 bp或4729 273~5064 423 bp間;qCC-c01緊密連鎖標(biāo)記分別比對(duì)到不同的染色體上;qCC-c04緊密連鎖標(biāo)記未能比對(duì)到甘藍(lán)型油菜染色體的相關(guān)位置。
表5 甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素含量QTL置信區(qū)間的候選基因
貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省油料研究所通過遺傳改良,已育成一批雙低紫紅葉甘藍(lán)型油菜品系[27],可在油菜標(biāo)記雜種識(shí)別,提高種子純度等方面發(fā)揮作用[28]。該紫紅葉油菜材料苗期自子葉開始,葉片呈現(xiàn)紫紅色,因品系不同葉色紫紅程度有較大差異,于油菜抽薹期開始葉色逐漸退成正常綠色,與綠葉油菜相比,紫紅葉油菜葉片花青素顯著高于綠葉油菜,利用紫紅葉品系與綠葉油菜品系雜交,雜種F1葉片葉綠素與花青素含量呈不顯著的正相關(guān)[29],說明該紫紅葉油菜材料可應(yīng)用在雜交油菜品種的選育上。為了促進(jìn)該油菜與農(nóng)旅觀光和蔬菜產(chǎn)業(yè)相結(jié)合,開展葉片花青素含量、葉綠素含量等性狀分子遺傳基礎(chǔ)研究,為材料的遺傳改良奠定基礎(chǔ)具有重要的意義。
近年來,有關(guān)花青素合成調(diào)控基因的研究重點(diǎn)植物集中在食用水果、蔬菜、糧食和觀賞花卉類,如梨[30]、桑椹[31]、青花菜[32]、蘭科植物[1]等。目前,在白菜1號(hào)染色體[33]、R07連鎖群[34]、白菜基因組A07染色體[35]及A03連鎖群r[36]均定位到與紫葉相關(guān)的基因或QTL;采用同源克隆的方法,王建軍等[14]在紫菜薹中克隆BrbHLH49基因,并在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中發(fā)現(xiàn)顯著提高花青素的合成;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)研究也表明,轉(zhuǎn)錄因子TT8調(diào)控蕓薹屬植物花青素合成基因上調(diào)表達(dá),具有重要的調(diào)控功能[37]。由此表明在十字花科蕓薹屬作物中,花青素的生物合成普遍存在,但在甘藍(lán)型油菜中花青素的合成機(jī)制知之甚少。本研究中,檢測(cè)到14個(gè)調(diào)控甘藍(lán)型油菜合成的QTL,通過與甘藍(lán)型油菜基因組比對(duì),分別定位在甘藍(lán)型油菜A03、C03、A04、A05、C07、C02和C04染色體上,其中5個(gè)QTL具有正向加性效應(yīng),來源于紫紅葉油菜品系。在定位的葉片花青素相關(guān)的QTL區(qū)段內(nèi),根據(jù)基因功能注釋,找到了可能與花青素相關(guān)的候選基因,這些候選基因中有較多的轉(zhuǎn)錄因子,如BnaC03g26620D(擬南芥同源基因AT2G26960,MYB81)、BnaC02g36230D和BnaC03g38310D(擬南芥同源基因AT3G26660,LBD24)、BnaA03g46550D(擬南芥同源基因AT4G24240,WRKY7)等,而bZIP家族、MYB家族、LOB家族、MADS家族、zf-HD家族和C2H2等家族轉(zhuǎn)錄因子均與花青素的轉(zhuǎn)化顯著相關(guān)[38-39],MYB-bHLH-WD轉(zhuǎn)錄因子還能形成復(fù)合體協(xié)同調(diào)控花青素的形成[40]。此外,在A03染色體上的候選基因BnaA03g17120D/BnaA03g17130D對(duì)應(yīng)擬南芥的同源基因?yàn)锳T2G37260(Transparent testa glabra 2,TTG2),TTG2與TTG1高度相似,均屬于WD-40蛋白家族[41],而TTG1已被證實(shí)在種皮類黃酮和花青素的合成中具有重要的作用[42]。花青素相對(duì)含量QTL區(qū)段內(nèi)細(xì)胞色素蛋白P450也較多,該蛋白在花色的形成中具有重要的功能[43],暗示這些蛋白也可能參與調(diào)控了甘藍(lán)型油菜葉片花青素的合成。UGT-糖基轉(zhuǎn)移酶也對(duì)花青素的合成具有促進(jìn)作用[44],可見花青素的修飾加工相關(guān)的基因(如:BnaC03g26760D、BnaA05g30520D等)也值得關(guān)注。
葉綠素主要參與植物的光合作用,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[8]。研究表明葉綠體的發(fā)育、葉綠素的合成及降解等均能影響葉綠素含量[19-21],葉綠素含量性狀也是多基因調(diào)控[19,22]。共檢測(cè)到8個(gè)甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素含量QTL,根據(jù)QTL區(qū)段內(nèi)基因的功能注釋篩選43個(gè)基因可能與葉片葉綠素含量相關(guān),其中,BnaC07g40900D對(duì)應(yīng)的擬南芥同源基因?yàn)锳T4G27440(Protochlorophyllide oxidoreductase B,PORB),該酶是葉綠素的合成的關(guān)鍵酶[45]。葉綠素含量相關(guān)的QTL區(qū)段內(nèi)還篩選出了BnaC07g41520D(AT3G24430,HCF101)和BnaC07g43330D(AT4G31560,HCF153)等基因,在玉米中HCF60的突變會(huì)導(dǎo)致植株溫度、光照依賴型的葉綠素缺陷[46],可見高葉綠素?zé)晒忸惖牡鞍讓?duì)葉綠素含量也具有重要的影響。另外,在水稻中Non-yellowcoloring3(NYC3)的功能缺失會(huì)導(dǎo)致水稻葉片衰老過程中持綠性加強(qiáng)[47],暗示葉綠素含量QTL內(nèi)基因BnaAnng41980D(擬南芥同源基因AT4G13250,NYC1)也可能與葉綠素含量相關(guān)。
本研究定位了14個(gè)花青素相對(duì)含量的QTL和8個(gè)葉綠素含量的QTL。對(duì)QTL物理區(qū)間的基因功能注釋,發(fā)現(xiàn)了部分轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞色素P450蛋白及UGT-糖基轉(zhuǎn)移蛋白等可能參與調(diào)控葉片花青素的合成,PORB,HCF,NYC等基因可能與葉綠素含量相關(guān)。篩選上述染色體相關(guān)區(qū)域內(nèi)可能存在調(diào)控甘藍(lán)型油菜葉片花青素和葉綠素合成的相關(guān)候選基因,是進(jìn)一步開展基因功能驗(yàn)證,明確該性狀遺傳機(jī)制的基礎(chǔ)。