基于“腎藏精起亟”理論觀察補(bǔ)腎活血復(fù)方通過干預(yù)klotho改善心梗后心衰大鼠心肌纖維化

劉賢嫻，張艷，徐瑤，孫曉寧，鄒文聰，申欣宜，王雅琴

1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 遼寧沈陽 110847

2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 遼寧沈陽 110032

心力衰竭是一種臨床表現(xiàn)極為復(fù)雜的綜合征，提示心臟作為泵的效率受損[1]。根據(jù)病情發(fā)展的時(shí)間和速度，劃分為急、慢性心衰，臨床上常見患者急性心衰住院治療后癥狀緩解，轉(zhuǎn)歸為慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）[2]。CHF是由各種致病因素的影響下，導(dǎo)致心室充盈和 （或）射血能力受損而引起的一組綜合征，是各種心血管系統(tǒng)疾病的終末階段[3-4]，是全球公共衛(wèi)生的一大難題。已有研究證明引起CHF的最常見原因是心肌梗死（MⅠ），MⅠ主要是由心室重構(gòu)引起的病變，而心室重構(gòu)的基礎(chǔ)病理是心肌纖維化[5]。臨床治療CHF基本依靠藥物，西醫(yī)中的代表藥物是卡托普利，但有研究指出西藥對(duì)心肌梗死后纖維化能夠起到改善的作用，但效果不顯著，且容易反復(fù)發(fā)作[6]。

本研究通過觀察補(bǔ)腎活血復(fù)方對(duì)CHF大鼠干預(yù)后，心功能、心、腎組織蛋白及纖維化的變化，證實(shí)本方對(duì)心梗后心衰大鼠心肌纖維化很好的預(yù)防作用，為中醫(yī)藥治療CHF提供了新的策略。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 補(bǔ)腎活血復(fù)方，主要成分：菟絲子、黃精、黃芪、丹參、人參、紅花、益母草、三七，成品由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑中心提供?？ㄍ衅绽?，規(guī)格：25mg*100片（旭東海普藥業(yè)，H31020564）。

1.2 動(dòng)物 12周齡雄性WKY大鼠60只，體重（200±20）g（遼 寧 長 生 生 物，SCXK（遼）2015-0001）。嚴(yán)格按照SPF級(jí)別飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑及儀器 RⅠPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶）；蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)印緩沖液（北京酷來搏）；ECL顯色試劑盒（美國GE公司）；Klotho一抗、內(nèi)參GAPDH一 抗、Col 1a1一 抗、二 抗 羊 抗兔ⅠgG-HRP（美國Abcam公司）；德國LeicaPJ-1A型烤片機(jī)（天津天利航空機(jī)電有限公司）；MS-2000多媒體化生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)（龍飛達(dá)科技有限公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CHF大鼠造模 大鼠麻醉成功后，連接心電圖，并記錄術(shù)前心電圖（圖1）。再行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)，我們可以看到局部收縮力降低，且心肌由紅色變?yōu)榘咨?，心電圖顯示ST段明顯抬高[7， 8]（圖2），證明成功造成心梗模型。Sham組顯露冠脈后僅掛線不結(jié)扎。術(shù)后7d內(nèi)，每天都予以4組常規(guī)飼料喂養(yǎng)，同時(shí)予以青霉素鈉5萬單位，預(yù)防感染。從第14～28天的飼料減至常規(guī)喂養(yǎng)量1/2，配合每天1次的力竭式游泳訓(xùn)練。造模結(jié)束后要及時(shí)做檢測心臟彩超，射血分?jǐn)?shù)≤60，則代表造模成功[9]。

圖1 大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前心電圖

圖2 大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后心電圖

2.2 分組與藥物治療 造模成功后，Sham組死亡4只，剩余11只，實(shí)驗(yàn)組45只大鼠死亡16只，剩余29只，將29只大鼠隨機(jī)分為Model組9只，BSHX組10只，Captopril組10只。每組灌胃劑量為3 mL·（2次）-1·天-1，Sham組和Model組予等容積去離子水灌胃。BSHX組給予補(bǔ)腎活血復(fù)方，劑量為9.2g·kg-1·d-1（因本課題前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)探究出此劑量的中藥制劑治療CHF效果最佳，故使用此劑量）。Captopril組給予卡托普利片配置成的混懸液灌胃，劑量為12.5 mg·kg-1·d-1。以上4組均連續(xù)用藥或蒸餾水4周。

2.3 標(biāo)本采集

2.3.1 超聲檢測大鼠心功能 各組大鼠用藥或去離子水28d后行心臟超聲檢測。將大鼠麻醉固定后，用超聲機(jī)的探頭置于大鼠心前區(qū)，測出LVDD和LVDS值并算出EF和FS值。

2.3.2 Wb法檢測心、腎組織中klotho及Col 1a1蛋白的表達(dá) 所有大鼠處死后立即取出200μg心肌及100μg腎組織，將其充分剪碎后加入RⅠPA裂解液，從中提取蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上。漂洗后封閉1h，洗膜3次；洗滌后加入分別加入klotho及Col 1a1一抗稀釋液，4℃孵育過夜后洗膜3次；加入二抗稀釋液后重復(fù)以上步驟，最后通過ECL觀察并分析結(jié)果。

2.3.3 心肌細(xì)胞形態(tài)觀察 將每組大鼠的心肌組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、脫蠟、HE染色等步驟，鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)都表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果中P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 補(bǔ)腎活血復(fù)方對(duì)大鼠心臟超聲的影響

與Model組 比 較，Sham組 大 鼠LVDD、LVSD、EF、FS有顯著性差異（P＜0.05）。BSHX組和Captopril組經(jīng)治療后，LVDD、LVSD、FS均有顯著改善，EF值高于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1，圖3、4。

圖3 Sham組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)4周后心臟彩超

表1 BSHX對(duì)大鼠心臟超聲的影響（±s）

表1 BSHX對(duì)大鼠心臟超聲的影響（±s）

注：與Sham組比較aP＜0.05；與Model組比較bP＜0.05。

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3.2 補(bǔ)腎活血復(fù)方對(duì)大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表達(dá)的影響 與Sham組相比，Model組心、腎組織中klotho蛋白含量減少，心肌中Col 1a1蛋白含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Model組比較，BSHX組和Captopril組心、腎組織中klotho蛋白含量增多，心肌中Col 1a1蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2，圖5。

圖5 大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白的表達(dá)

表2 BSHX對(duì)大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 BSHX對(duì)大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與Sham組相比aP＜0.05；與Model組相比bP＜0.05。

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圖4 Model組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)4周后心臟彩超

3.3 補(bǔ)腎活血復(fù)方對(duì)大鼠心肌細(xì)胞纖維化的結(jié)果在HE染色中顯示，Sham組心肌細(xì)胞排列整齊，纖維走行正常。但Model組心肌纖維走行混亂，纖維斷裂、缺失，表明心肌嚴(yán)重?fù)p傷；BSHX組和Captopril組緩解了以上的癥狀，走行逐漸有序，纖維重組。見圖6。

圖6 大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)

討 論

在實(shí)驗(yàn)中我們采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)，因?yàn)榇私Y(jié)扎術(shù)實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，手術(shù)要求較高，但展現(xiàn)的結(jié)果與人類的心肌纖維化最相似，是現(xiàn)在較為公認(rèn)的CHF模型[10]，本課題增加了配合力竭式運(yùn)動(dòng)，加重了心衰程度，并加快了病程發(fā)展，經(jīng)心電圖可以看到ST段明顯抬高，并且觀察到大鼠活動(dòng)狀態(tài)變差，甚至伴有明顯的哮鳴音，判斷成功給大鼠建立了CHF模型。在我們課題的前期研究中也證實(shí)，補(bǔ)腎活血復(fù)方可以通過上調(diào)心、腎中klotho蛋白的表達(dá)，達(dá)到阻止心衰發(fā)展的目的[11]，所以此次實(shí)驗(yàn)加用了wb法檢測ColⅠ蛋白，來進(jìn)一步觀察心肌纖維化的程度，并聯(lián)系“腎藏精起亟”理論進(jìn)一步理解補(bǔ)腎活血復(fù)方在慢性心衰中的治療思路，為中西醫(yī)在治療CHF上提供新的治療靶點(diǎn)。

心臟纖維化定義為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生和降解的失衡，從而在許多心臟病理生理狀況中導(dǎo)致心臟功能障礙[12]。CHF引起了異常的容量和壓力負(fù)荷，導(dǎo)致了心肌細(xì)胞長期缺血，發(fā)生了順應(yīng)性改變，還有研究證明心肌纖維化會(huì)加重心力衰竭的程度[13-14]，所以改善心肌細(xì)胞纖維化對(duì)CHF患者預(yù)后的關(guān)鍵一步。而心肌纖維化是由成纖維細(xì)胞對(duì)纖維膠原蛋白轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)改變而引起的，這促進(jìn)了心肌間質(zhì)內(nèi)和心肌內(nèi)血管周圍的Ⅰ型膠原蛋白（Col 1a1）纖維的過度沉積[15]。

Klotho基因（又稱α-klotho）首次被Kuroo， M.等人（1997）確定為小鼠抗衰老基因[16]。但其實(shí)Klotho家族是由α-klotho、β-klotho和γ-klotho三類基因組成，其中α-klotho和β-klotho基因都編碼膜結(jié)合蛋白和分泌蛋白[17]，本文章內(nèi)所研究的klotho即為α-klotho。大量先前的研究已經(jīng)表明，klotho基因參與了發(fā)生與多種人類疾病的發(fā)展，包括慢性腎臟疾病、動(dòng)脈硬化癥、心肌肥大、糖尿病和肥胖、以及各種類型的癌癥[18]。LV等[19]研究發(fā)現(xiàn)Klotho是一種具有腎臟和心臟保護(hù)作用的抗衰老蛋白，Klotho過表達(dá)可通過滅活NF-kB通路減輕心衰和腎損傷。Chen等[20]則認(rèn)為分泌的Klotho通過激活Nrf2促進(jìn)谷胱甘肽還原酶（GR）的表達(dá)，GR心臟特異性過表達(dá)減弱了心肌纖維化。已有實(shí)驗(yàn)證明在慢性心衰大鼠中，Klotho mRNA的表達(dá)與Col 1a1 mRNA的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，兩者可能存在互相調(diào)節(jié)的關(guān)系[21]。Klotho通過減少TGF-β1的數(shù)量，間接抑制microRNA-132的表達(dá)[22]，它抑制atrogin-1表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄因子FOXO3。這個(gè)F-box蛋白激活了心肌細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的泛素化和降解，而過量的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶刺激NFAT，激活了NFAT的下游基因促纖維化基因的表達(dá)。因此，klotho通過抑制microRNA-132來限制心肌纖維化的發(fā)展[23]。

中醫(yī)認(rèn)為CHF屬于“胸痹”“心悸”“怔忡”等范疇，臨床中常有胸痛、胸悶、氣短、心悸、下肢浮腫等臨床表現(xiàn)[24-25]。張艷教授提出了“腎藏精起亟”理論治療CHF，《中醫(yī)基礎(chǔ)理論》中也提到，“精”是人體的原始物質(zhì)，是生命活動(dòng)的本原。同時(shí)在《素問·六節(jié)藏象論》中也提及：“腎者， 主蟄， 封藏之本， 精之處也?！背浞终f明了腎對(duì)精的蟄伏和閉藏作用。程士德：“亟，急也。又頻數(shù)也?！痹诠牛瑯O通亟，如今部分學(xué)者認(rèn)為“起亟”即為應(yīng)付各種緊急或極端的變化，應(yīng)激反應(yīng)時(shí)人體會(huì)分泌大量的腎上腺皮質(zhì)激素來應(yīng)對(duì)緊急情況[26]。腎精虧虛時(shí)，一方面血化失源，心主身之血脈，化赤行血；另一方面無以生血，心血不足，心脈失于濡養(yǎng)，出現(xiàn)心悸、胸痛、氣短等癥狀。王長江等[27]人從“腎藏精”角度論證了Klotho基因的表達(dá)與腎精的興衰成相關(guān)性，認(rèn)為Klotho是腎精的組成部分。張艷教授正是從補(bǔ)腎益精、活血利水的治療原則出發(fā)，擬出補(bǔ)腎活血復(fù)方，方中以人參、黃芪為君藥，正反、陰陽互用，共奏扶正、補(bǔ)血、行氣之功；丹參、紅花、三七為臣，活血化瘀；菟絲子、黃精補(bǔ)益腎精；益母草活血利尿。

綜上所述，治療心肌纖維化對(duì)慢性心力衰竭患者是極其關(guān)鍵的一步，在西醫(yī)上主要是運(yùn)用沙坦類、他汀類等降壓降脂方式來緩解纖維化程度，并沒有公認(rèn)的抗纖維化的藥物。對(duì)比之下，補(bǔ)腎活血復(fù)方提高了klotho蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低了心肌纖維化的程度，以達(dá)到改善CHF的目的，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。