芽孢桿菌苧麻脫膠動態(tài)過程分析

吳亞 劉一 舒潼 王慧慧 李攀登 楊英 余龍江

（華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430074）

苧麻纖維具有單根纖維長、韌性強、導(dǎo)熱性好、吸濕散熱快、防霉、抗菌、抗紫外線等優(yōu)點，被譽為“天然纖維之王”，廣泛應(yīng)用于紡織、家居、汽車等行業(yè)。我國苧麻纖維產(chǎn)量占世界的95%，所以，苧麻又被稱為“中國草”［1］，是我國特有的天然紡織原料。苧麻韌皮部被稱為原麻，干燥后的原麻中含有多種化學(xué)成分，其主要成分是纖維素，約占70%。剩下的30%的非纖維素成分在紡織工業(yè)中被稱為膠質(zhì)。這些膠質(zhì)主要包括果膠、半纖維素、水溶物、木質(zhì)素、脂蠟脂、灰分。在苧麻紡織工業(yè)中，苧麻脫膠過程稱為“脫膠”［2-3］。目前市面上常用的脫膠方法有化學(xué)脫膠、生物脫膠、微生物脫膠［4-5］。

化學(xué)脫膠是指利用苧麻韌皮中纖維素和膠質(zhì)對酸、堿和氧化劑的穩(wěn)定性差異進行脫膠，國內(nèi)外普遍采用此類方法。由于化學(xué)脫膠工藝過程中需要滿足的條件比較復(fù)雜，纖維素與半纖維素物質(zhì)對化學(xué)反應(yīng)試劑及高溫的穩(wěn)定性沒有嚴格界線。因而苧麻化學(xué)脫膠工藝存在工藝多、耗時長、能耗高、勞動強度大、污染嚴重等缺點，無法滿足綠色環(huán)保的要求［6-7］。而且，苧麻原纖維的酸處理對苧麻纖維的損傷很大，導(dǎo)致苧麻精干麻質(zhì)量下降，不能作為高檔紡織品生產(chǎn)的原料，嚴重影響了苧麻精干麻的價格。

酶脫膠是利用脫膠菌產(chǎn)生的一系列脫膠酶進行脫膠，使原麻上的半纖維素、果膠等物質(zhì)脫離下來，從而達到脫膠的目的［8］。常用的脫膠酶包括半纖維素酶、果膠酶和木質(zhì)素酶三大酶系。Zhang等［9］將果膠酶、半纖維素酶等酶混合作用于苧麻纖維脫膠，脫膠后的纖維舒適度、纖維強度、白度和殘膠率都有了顯著改善，有利于后續(xù)的工業(yè)紡織。Basu等［10］利用從短小芽孢桿菌中克隆得到的果膠裂解酶處理苧麻，使纖維的膠質(zhì)減少了25%。果膠在原麻膠質(zhì)中起到與其他成分膠連的作用，因而對于果膠的去除十分重要。酶法脫膠反應(yīng)條件較溫和，對苧麻纖維損傷較小，但由于酶制劑研發(fā)成本較高，目前未能取得大規(guī)模應(yīng)用。

微生物脫膠是利用能產(chǎn)生多種酶的菌株擴大培養(yǎng)后接種到苧麻上，利用降解后的單糖作為營養(yǎng)物質(zhì)進行生存繁殖。微生物脫膠最關(guān)鍵的是脫膠菌的篩選，一株好的菌株可達到非常好的脫膠效果［11］。Saikia等［12］分別利用枯草芽孢桿菌和霉菌進行苧麻脫膠處理，經(jīng)細菌和真菌處理4 d后，纖維殘余膠量分別下降到10.4%和9.7%。Wang等［13］利用高產(chǎn)果膠酶的蠟樣芽胞桿菌PO5聯(lián)合高產(chǎn)木聚糖酶的假單胞菌X12在開放環(huán)境處理苧麻韌皮60 h，最終脫膠率達79.6%。本團隊樊培和張非等［14-15］通過分析苧麻韌皮纖維膠質(zhì)成分及其與脫膠酶的相互作用，建立了脫膠優(yōu)勢菌株的篩選策略，獲得系列優(yōu)勢脫膠菌株如HG-25、HG-28、HG-49，并建立了苧麻精干麻生物清潔生產(chǎn)技術(shù)，在微生物混合脫膠、發(fā)酵工藝優(yōu)化、廢水循環(huán)利用等方面都取得了不錯的成績，工業(yè)化應(yīng)用已形成一定規(guī)模。微生物脫膠工藝取得了越來越多的突破進展，是目前研究的重點，但是仍存在脫膠時間較長，不同批次菌株脫膠效果不均勻，殘膠率較高等問題，本實驗室保藏的芽孢桿菌LY11含有豐富的果膠、甘露聚糖酶系，能高效利用苧麻韌皮膠質(zhì)增殖，其生物量達到5.63 g/L，生物脫膠過程中，LY11產(chǎn)果膠酶活與甘露聚糖酶活較高，且不產(chǎn)纖維素酶，可作為優(yōu)良的苧麻脫膠菌株。因而需要對其脫膠過程動態(tài)變化進行深入研究，闡明脫膠過程機理，挖掘影響微生物脫膠關(guān)鍵因素，優(yōu)化相應(yīng)的控制方法，最終實現(xiàn)微生物高效穩(wěn)定脫膠。

本實驗旨在通過分析苧麻生物脫膠過程中脫膠微生物、脫膠酶活、苧麻化學(xué)成分變化，揭示生物脫膠過程特征，確定脫膠關(guān)鍵酶系，揭示生物脫膠過程機理，為實現(xiàn)微生物脫膠技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株為華中科技大學(xué)資源生物學(xué)與生物技術(shù)研究所選育并保藏的芽孢桿菌LY11，苧麻原麻產(chǎn)自湖北省咸寧市，由湖北精華紡織集團有限公司提供。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉，1.2%瓊脂粉，pH自然，高壓蒸汽滅菌20 min。菌種的短期保藏用斜面培養(yǎng)基，菌種的純化用平板培養(yǎng)基。

LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉，高壓蒸汽滅菌20 min。LB液體培養(yǎng)基用于菌種的活化。

1.1.3 試劑和儀器 酵母粉，氯化鈉，蛋白胨，瓊脂粉，濃鹽酸，冰醋酸，3，5-二硝基水楊酸，磷酸二氫鉀，羧甲基纖維素鈉，魔芋精粉，葡萄糖，果膠，無水亞硫酸鈉，四水酒石酸鉀鈉，苯酚，木糖，甘露糖，D-半乳糖醛酸，木聚糖，氫氧化鈉，草酸銨，醋酸，次氯酸鈉。Nova NanoSEM450場發(fā)射掃描電子顯微鏡，臺式高速離心機H1650W，F(xiàn)E20實驗室pH計，電熱鼓風干燥箱 101A3ET，紫外分光光度計UV1600PC，低速離心機TDL5A。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備 將保存在-80℃冰箱中的菌株轉(zhuǎn)入一組新鮮固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，然后轉(zhuǎn)入另一組新鮮固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，使菌株充分活化。然后，將菌株接種于液體培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min培養(yǎng)OD600值至0.5左右，約6 h。

1.2.2 苧麻微生物脫膠方法 取原麻5 g左右，將麻樣于105℃烘箱烘至恒重后稱重。浴比為1∶10，接種量10%（針對脫膠體系），轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37℃脫膠16 h，期間每2 h取樣測定pH、酶活、生物量。苧麻化學(xué)成分定量分析方法：苧麻含膠率、脫膠率、殘膠率及各成分含量（脂蠟質(zhì)、半纖維素、果膠、木質(zhì)素、灰分）根據(jù)中華人民共和國國家標準GB/T 5889-86苧麻化學(xué)成分定量分析方法進行測定。

1.2.3 生物脫膠過程脫膠液菌體及還原糖變化的動態(tài)分析 菌體個數(shù)測定，每2 h取0.1 mL脫膠菌液用無菌生理鹽水稀釋適當濃度，于血球計數(shù)板進行計數(shù)，雜菌根據(jù)菌落形態(tài)并結(jié)合鏡檢進行測定。還原糖變化分析，利用分光光度計測定其吸光度，以葡萄糖標準曲線為標準表征其還原糖含量。

1.2.4 酶活測定 采用二硝基水楊酸（DNS）法測定其果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶活力。果膠酶活力測定原理：在果膠酶作用下，果膠可被降解為還原性糖，DNS在堿性條件下可與半乳糖醛酸發(fā)生反應(yīng)，且產(chǎn)物在沸水浴條件下顯色。產(chǎn)物顏色的深淺與生成的還原糖的量成正比，從而通過反應(yīng)液顏色表征脫膠液中果膠酶的活力。

果膠酶活測定：取0.9 mL果膠溶液于試管中，加入0.1 mL脫膠上清液，37℃反應(yīng)10 min，然后加入1.5 mL DNS溶液混合均勻于沸水浴條件下5 min，冰水冷卻10 min后測定吸光值 OD540。酶活性定義：在特定條件（37℃、pH7.0）下，每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1 μmol半乳糖醛酸所需酶量為一個酶活性單位U。甘露聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶活力測定時底物分別為甘露聚糖、木聚糖和羧甲基纖維素鈉，產(chǎn)物分別為甘露糖、木糖和葡萄糖。

1.2.5 苧麻原麻形態(tài)分析 通過對不同處理時期的苧麻進行取樣，對苧麻硬條、硬塊、夾生、斑疵、碎麻、手感軟硬程度的分析進行表觀判斷。通過掃描電鏡觀察麻纖維的表面形貌。具體操作步驟如下：將苧麻樣品送華中科技大學(xué)國家光電實驗室。將樣品切至0.5 cm左右，貼于銅板上，噴金30 s，在Nova nanosem450場發(fā)射掃描電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 苧麻生物脫膠過程中菌體個數(shù)及還原糖的動態(tài)分析

由圖1可知，菌株LY11在苧麻生物脫膠過程的延滯期較短，4-6 h內(nèi)其生物量迅速增加，還原糖含量也迅速增加，這說明在脫膠過程中，LY11分泌的水解酶使膠質(zhì)大量降解，產(chǎn)生的單糖為其生長提供營養(yǎng)成分從而使其大量繁殖。6-8 h還原糖含量基本不變，8-10 h出現(xiàn)下降，說明此時菌體處于生長期，對糖利用率提高。接種脫膠12 h時，脫膠菌個數(shù)最多，達到21.458×109CFU/mL，12 h后菌體處于衰亡期，還原糖含量由于菌體利用率降低而上升。接種后，雜菌的生長速度相對較慢，直至衰老期，說明菌株LY11比其他菌株有一定的生長優(yōu)勢，雜菌在脫膠過程中不會對其造成太大的影響。

圖1 苧麻生物脫膠過程脫膠液還原糖含量和菌體量變化Fig. 1 Variations in reducing sugar content and bacterial mass in the degumming solution from the biological degumming process of ramie fiber

2.2 苧麻生物脫膠過程中膠質(zhì)成分的動態(tài)分析

2.2.1 苧麻原麻膠質(zhì)成分分析 對原麻進行了成分測定，其包含了多種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化學(xué)成分，如表1所示。纖維素含量占到73.75%。其余物質(zhì)在麻紡工業(yè)中稱其為膠質(zhì)，這些膠質(zhì)主要包括果膠4.27%、半纖維素（木聚糖、甘露聚糖）13.87%、木質(zhì)素0.95%、水溶物5.58%、脂蠟質(zhì)1.58%。由此可知，對于苧麻膠質(zhì)的去除，主要是對于半纖維素和果膠的去除，因此這幾種相對應(yīng)的水解酶對于苧麻脫膠是十分重要的。

表1 苧麻原麻化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of raw ramie fiber

2.2.2 苧麻生物脫膠過程中膠質(zhì)成分動態(tài)分析 由圖2可知，經(jīng)過16 h生物脫膠后，苧麻原麻殘膠量由初始的26.25%降至11.48%，脫膠率達56.27%。2-8 h是脫膠的高峰期，10 h后，脫膠率呈緩慢上升趨勢。

圖2 苧麻生物脫膠過程脫膠率和殘膠量變化Fig. 2 Variation of degumming rate and residual gum amount during the biological degumming process of ramie fiber

由圖3可知，在脫膠初期，水溶性物質(zhì)的去除率較高，在脫膠前6 h，水溶性物質(zhì)的去除率約為60%。脫膠16 h后，果膠去除率高達93.9%，果膠的大量去除，保證了后續(xù)半纖維素的協(xié)同降解。菌株LY11對半纖維素的去除率為39.6%，脫膠后脂蠟質(zhì)的去除率為45.3%，其主要化學(xué)成分為高級脂肪酸和高級醇形成的酯類，木質(zhì)素含量在整個脫膠過程中幾乎沒有變化，因而菌株LY11幾乎不能降解木質(zhì)素。

圖3 苧麻生物脫膠過程各膠質(zhì)成分去除率變化Fig. 3 Variations in the removal rate of various colloid components in the biological degumming process of ramie fiber

2.3 苧麻生物脫膠過程中脫膠酶活性的動態(tài)分析

由圖4可知，在LY11生物脫膠過程中，一直檢測不到纖維素酶酶活，這對于苧麻脫膠十分有利，避免了其有利成分（纖維素）的損失。果膠酶與甘露聚糖酶活性在0-8 h內(nèi)先升高，8-16 h緩慢降低，二者均在脫膠8 h時酶活最高，通過圖2從脫膠率和殘膠量的變化趨勢可以看出，菌株LY11的脫膠效率與果膠酶、甘露聚糖酶的酶活變化趨勢基本一致。果膠酶達到116.4 U/mL，反應(yīng)16 h后酶活為77.73 U/mL，其較高酶活保證了黏連膠質(zhì)的順利去除，使其去除率達到了93.9%。甘露聚糖酶酶活也較高，最高酶活達到96.72 U/mL。同時在脫膠過程中檢測到木聚糖酶活性，但其酶活力很低。

圖4 苧麻生物脫膠過程菌株LY11酶活變化Fig. 4 Variations of enzyme activity of strain LY11 in the biological degumming process of ramie fiber

2.4 苧麻生物脫膠過程中苧麻形態(tài)動態(tài)分析

為直觀感受菌株LY11苧麻脫膠效果，對0-16 h脫膠苧麻的手感柔軟程度、外觀色澤、硬塊、硬條、斑疵、夾生、碎麻等指標進行評定。如圖5所示，苧麻原麻呈黃褐色，手柄硬脆，其中硬塊條較多，纖維相互纏繞，苧麻皮、殼等雜質(zhì)較多。菌株LY11的苧麻外觀和手感隨脫膠時間呈顯著差異。如表2所示，在脫膠初期，苧麻纖維的手感仍然是硬而直的，外觀與原麻相似。脫膠8 h后，開始出現(xiàn)絲狀纖維，整個纖維開始變軟。脫膠8-16 h后，析出大量有光澤的白色纖維，手感柔軟，無硬塊、硬條、斑點疵點和斷麻。苧麻精干麻呈純白色，光澤絲狀，非常柔軟，觸感溫和，毛刺少，可作為優(yōu)良的紡織原料。

表2 苧麻生物脫膠過程不同時段苧麻外觀評定Table 2 Appearance evaluation of ramie at different periods during the biological degumming process of ramie fiber

圖5 苧麻生物脫膠過程不同時段苧麻外觀Fig. 5 Appearance of ramie at different periods during the biological degumming process of ramie fiber

由圖6的掃描電鏡觀察結(jié)果可知，菌株LY11生物脫膠4 h后，苧麻纖維表面的膠質(zhì)有所減少，纖維之間的黏連程度降低。脫膠8 h后，苧麻纖維表面的膠質(zhì)成分明顯減少，纖維有分散的趨勢。脫膠12 h后，部分相鄰纖維開始分離，纖維表面變得光滑。脫膠結(jié)束時，大部分非纖維素成分被去除，苧麻纖維表面光滑，僅有少量膠質(zhì)殘留，苧麻單纖維基本分離?？梢?，菌株LY11對苧麻原麻脫膠16 h后，大部分果膠、半纖維素等膠質(zhì)成分被去除，苧麻單纖維分離度好，表面光滑。結(jié)果表明，脫膠菌株能有效、均勻地滲透到苧麻纖維內(nèi)部，完成脫膠。

圖6 苧麻生物脫膠過程不同時段苧麻掃描電鏡觀察Fig. 6 Scanning electron microscope observation of ramie at different periods during the biological degumming process of ramie fiber

3 討論

通過對脫膠過程中菌體數(shù)量、酶活以及還原糖變化分析可知，在脫膠初期0-4 h內(nèi)，苧麻中大量的水溶性糖溶解，導(dǎo)致脫膠液中還原糖含量迅速增加。此時，菌株仍還不能大量使用還原糖，果膠酶、甘露聚糖酶活性也不斷增強，從而使還原糖含量上升。進入對數(shù)生長期6-10 h后，細菌大量繁殖，迅速消耗還原糖，還原糖含量呈現(xiàn)下降趨勢，果膠酶、甘露聚糖酶酶活達到較高水平，說明菌株LY11分泌的果膠酶、甘露聚糖酶能夠有效降解膠質(zhì)，產(chǎn)生大量還原糖，還原糖作為營養(yǎng)物質(zhì)供菌體生長繁殖和代謝，從而還原糖含量降低。而在脫膠后期10-12 h，菌體雖然還在生長，但速度緩慢，已經(jīng)處于穩(wěn)定期，此時對還原糖的消耗降低，然而酶促反應(yīng)仍在進行，從而使得還原糖含量升高。12-14 h，細菌處于衰老期，且半纖維素酶酶活降低，可能是由于其酶穩(wěn)定性較差，使菌體對還原糖利用率下降，還原糖含量逐漸增加。本研究也進一步豐富了孫慶祥研究團隊［16］提出的菌產(chǎn)酶、酶脫膠、膠養(yǎng)菌的理論。

對比苧麻原麻生物脫膠過程各膠質(zhì)成分去除率可知，在脫膠16 h后，果膠去除率高達93.9%，結(jié)合果膠種類多樣性，說明菌株LY11分泌的果膠酶系足夠豐富；然而，半纖維素的脫除率在脫膠結(jié)束后僅為39.6%，仍殘留60.4%的半纖維素，表明菌體所含半纖維素酶系有待進一步豐富，同時，苧麻原麻所含木聚糖、甘露聚糖側(cè)鏈會被乙酰基、半乳糖、葡萄糖醛酸所取代［17］，因而LY11中木聚糖酶、甘露聚糖酶系可能對其原位降解效果較差。脫膠后脂蠟質(zhì)的去除率為45.3%，其主要化學(xué)成分為高級脂肪酸和高級醇形成的酯類，芽孢桿菌LY11基因組不存在降解脂蠟質(zhì)的基因，可能是由于該菌株降解了苧麻中的其他膠質(zhì)成分后，脂蠟質(zhì)從苧麻中脫落，從而使其脫除。在本次實驗中甘露聚糖酶始終保持較高酶活，而木聚糖酶活較低，最高酶活＜5 U/mL。本課題組前期對高效脫膠菌株HG-49進行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其缺少半纖維素酶系［18］，后構(gòu)建了木聚糖酶組成型分泌表達載體p213，并轉(zhuǎn)入脫膠菌HG-49，使其木聚糖酶活性得到顯著提高，后進行脫膠實驗，使苧麻脫膠率提高了3.9%［19］，證實木聚糖酶在苧麻半纖維素降解中起到相當重要的作用。當前有研究指出在苧麻半纖維素中甘露聚糖含量高于木聚糖含量［20］，因而推測菌株LY11脫膠過程中半纖維素膠質(zhì)的降解可能主要是由于甘露聚糖酶的作用，使其40%左右的半纖維素被降解。先前研究認為果膠酶和木聚糖酶在降解苧麻膠質(zhì)時具有關(guān)鍵作用，而忽略了甘露聚糖酶。本課題組王亞偉［21］從數(shù)據(jù)庫中挖掘到甘露聚糖酶ManB，后將異源表達的不同濃度的 ManB蛋白酶與HG-49菌株聯(lián)合使用對苧麻韌皮進行原位脫膠處理，發(fā)現(xiàn)添加400 IU/mL ManB時苧麻韌皮脫膠率從82.2%提高到85.6%。該研究也表明甘露聚糖酶在降解半纖維素過程中同樣發(fā)揮非常重要的作用，進一步豐富了對苧麻關(guān)鍵脫膠酶體系的認識。

芽孢桿菌LY11雖對果膠具有優(yōu)異的去除能力，但去除半纖維素的能力有待進一步加強，相關(guān)半纖維素酶系有待豐富。有研究表明，部分木聚糖酶對純底物，例如玉米芯木聚糖進行降解時，雖表現(xiàn)出較高活性，但其在植物組織背景下進行原位降解木聚糖時，效率卻大大降低。因此，在選擇半纖維素酶系相關(guān)種類酶時，需注意選擇具有高效原位降解能力的酶?？衫卯斍耙阎哂懈咝г幻撃z能力的半纖維素酶的菌株，與芽孢桿菌LY11進行復(fù)合脫膠，也可從此類菌種克隆相關(guān)基因，構(gòu)建重組工程菌。另一方面，研究在植物組織背景下原位處理時半纖維素酶活性降低的機制，將為提高苧麻微生物脫膠效率提供更加豐富的理論指導(dǎo)。同時，本菌株分泌的甘露聚糖酶和果膠酶進行原位脫膠時，能夠有效的降解果膠和甘露聚糖等膠質(zhì)成分，表明本菌株中相關(guān)的果膠酶、甘露聚糖酶基因可作為苧麻脫膠關(guān)鍵基因來源，用于構(gòu)建重組工程菌，為苧麻膠質(zhì)的降解提供強力支持。

4 結(jié)論

本文通過分析菌株LY11生物脫膠過程中菌體數(shù)量變化、酶活變化、單糖含量變化、膠質(zhì)去除率等數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)微生物脫膠遵循“菌產(chǎn)酶、酶脫膠、膠養(yǎng)菌”理論，兼具高活性的果膠酶和半纖維素酶是實現(xiàn)微生物徹底脫膠的核心要素，維持其酶促動力學(xué)穩(wěn)定性是提高脫膠效率的關(guān)鍵因素。