妊娠對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

張洪連，周鑫華，謝 琛，江建香，梅竹君，劉詩(shī)英，胡 凡，曹文鋒

(江西省人民醫(yī)院、南昌大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,南昌 330006)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種免疫介導(dǎo)的具有遺傳易感性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘性疾病，具有時(shí)間多發(fā)、癥狀多發(fā)及空間多發(fā)的臨床特點(diǎn)。流行病學(xué)顯示MS發(fā)病率存在性別差異，全世界男女比例大約為1：2，青春期該比例增至1：4，導(dǎo)致這種性別差異的原因可能為基因易感性、免疫反應(yīng)性別差異及體內(nèi)性激素差異等[1]。MS發(fā)病高峰期為20～40歲，目前國(guó)外學(xué)者開(kāi)展了一些回顧性及前瞻性的臨床研究發(fā)現(xiàn)妊娠期MS患者的病情進(jìn)展及復(fù)發(fā)情況與非妊娠期比較存在差異，但這種差異在不同臨床試驗(yàn)的研究結(jié)論中存在不一致性[2-4]，故至今妊娠對(duì)MS疾病的影響還不明確。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是模擬人類(lèi)MS的經(jīng)典動(dòng)物模型，病理基礎(chǔ)都是主要活化CD4+T細(xì)胞參與免疫損傷的[5]。因此，本文擬研究妊娠后EAE小鼠的神經(jīng)功能缺失及體內(nèi)免疫系統(tǒng)的變化情況，為臨床上探究妊娠對(duì)女性MS患者疾病影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

完全弗氏佐劑FCA(上海源葉生物科技有限公司)；不完全弗氏佐劑FICA(美國(guó)Sigma公司)；Pertussis toxin(百日咳毒素)(美國(guó)List labs公司)、MOG35-55(生工生物工程(上海)股份有限公司)；熒光標(biāo)記的細(xì)胞表面單克隆抗體FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3(美國(guó)Biolegend公司)；小鼠IFN-γ、IL-17、IL-10的ELISA檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；伊紅染色液(北京Solarbio公司)，Scott藍(lán)化液(北京Solarbio公司)，焦油紫(美國(guó)New Jersey公司)，Luxol fast blue(美國(guó)Sigma公司)，高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J鼠30只，雌性，6～8周齡(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004)；C57BL/6J鼠10只，雄性，3月齡(上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0006)。飼養(yǎng)條件：溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。SPF級(jí)繁殖飼料飼養(yǎng)。

1.3 EAE小鼠模型的制作

雌性小鼠適應(yīng)性培養(yǎng)1周后，于背部?jī)蓚?cè)皮下注射誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑，0.2 mL·只-1，MOG35-55多肽劑量為300 μg·只-1。最后腹腔注射百日咳毒素，300 ng·只-1；48 h后再次腹腔注射百日咳毒素400 ng·只-1。建模成功雌性EAE小鼠30只。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

注射完第2針百日咳毒素后第11天雌雄小鼠按2:1比例合籠受孕，次日檢查是否形成陰道栓來(lái)評(píng)估是否受孕，見(jiàn)栓日定為妊娠第1天。以成功妊娠的小鼠為妊娠組(n=10)；未配孕的小鼠為對(duì)照組(n=10)。若妊娠組小鼠死亡，則重新選取雌鼠建模、受孕。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分

采用5分評(píng)分法對(duì)妊娠后EAE小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分時(shí)間點(diǎn)為妊娠后第1、4、7、10、13天(即建模后第12、15、18、21、24天)。評(píng)分細(xì)則為:0分，無(wú)癥狀；1分，輕度步態(tài)笨拙或尾部張力降低；2分，中度姿態(tài)異?；蜃藨B(tài)維持缺乏或尾部無(wú)張力;3分，肢體乏力；4分，肢體無(wú)力；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。

1.6 ELISA法檢測(cè)

妊娠后第13天(妊中期)的EAE小鼠，摘除眼球收集血液，分離提取血清，按照ELISA試劑操作步驟檢測(cè)IFN-γ、IL-17、IL-10濃度，結(jié)果以ng·mL-1表示。

1.7 HE染色及Bielshowsky’s-Luxol fast blue staining雙染

采用脫臼法將妊娠第13天EAE小鼠處死，取腦和脊髓固定，包埋蠟塊，制作成切片，再將切片常規(guī)脫蠟并水化后，進(jìn)行HE染色及Bielshowsky’s-Luxol fast blue staining雙染，分別觀察腦和脊髓病灶區(qū)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及神經(jīng)纖維脫髓鞘情況。

HE染色切片半定量評(píng)估方法如下：未見(jiàn)或偶見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為0分；僅血管周?chē)图顾枘び醒装Y細(xì)胞浸潤(rùn)為1分；腦或脊髓內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為2分；腦或脊髓內(nèi)中量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為3分；腦或脊髓內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為4分。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比。分離出EAE小鼠脾臟，研磨提取出淋巴細(xì)胞，反復(fù)洗滌干凈后收集淋巴細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的CD4抗體和APC標(biāo)記的CD25抗體，孵育60 min后將細(xì)胞重懸，并加入固定和通透液，孵育30 min后加入PE標(biāo)記的Foxp3抗體，繼續(xù)孵育30min，洗滌上機(jī)檢測(cè)。用CD4+細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控，檢測(cè)CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分比較

EAE小鼠大約在免疫后第11天開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，首要癥狀主要為尾部張力下降，癥狀逐漸加重，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、肢體無(wú)力等。如圖1所示，妊娠前2組間的神經(jīng)功能評(píng)分比較無(wú)差異，但隨著發(fā)病時(shí)間延長(zhǎng)，雖然兩組的EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均呈進(jìn)行性增加，但妊娠組與對(duì)照組比較更低，且在妊娠后第10、13天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

妊娠后時(shí)間/d

2.2 血清IFN-γ、IL-17、IL-10水平

妊娠組EAE小鼠血清中IL-10水平為(56.89±7.45)ng·mL-1，高于對(duì)照組的(43.78±6.95)ng·mL-1(P<0.05)；IL-17水平[(455.42±23.81)ng·mL-1]與對(duì)照組[(516.22±24.76)ng·mL-1]比較顯著降低(P<0.05)；且IFN-γ水平[(920.12±45.65)ng·mL-1]與對(duì)照組[(1073.67±71.23)ng·mL-1]比較也顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

*P<0.05。

2.3 炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況

妊娠組和對(duì)照組的EAE小鼠脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)都有少到中量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)血管周?chē)市涮讟友装Y細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3A—B)，且妊娠組脊髓病灶區(qū)炎癥細(xì)胞半定量得分為(2.33±0.24)分，低于對(duì)照組的(3.21±0.47)分(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

A：妊娠組；B對(duì)照組。箭頭所示為袖套樣炎癥細(xì)胞。

2.4 神經(jīng)纖維脫髓鞘情況

將腦和脊髓組織切片采用雙染方法染色后髓鞘染成藍(lán)色，軸索染成黑色；且妊娠組和對(duì)照組EAE小鼠的腦和脊髓白質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)神經(jīng)脫髓鞘改變，但妊娠組的脫髓鞘程度較對(duì)照組輕，見(jiàn)圖5。

A：妊娠組；B：對(duì)照組。箭頭所示為神經(jīng)脫髓鞘。

2.5 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)百分比

妊娠組EAE小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)百分比為(9.63±0.47)%，高于對(duì)照組的(5.73±0.39)%(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 2組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)百分比比較

3 討論

妊娠是育齡期女性最重要的任務(wù)之一，但作為MS的高發(fā)人群，處于妊娠期時(shí)MS女性患者其臨床癥狀如何變化目前仍不明確。RUOLLET等[2]在1993年首次針對(duì)這個(gè)問(wèn)題進(jìn)行了研究，未發(fā)現(xiàn)妊娠期復(fù)發(fā)率減低，但分娩后3個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率比妊娠前升高了3倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有過(guò)妊娠史的MS患者總體復(fù)發(fā)率低于無(wú)妊娠史者。CONFAVREUX等[3]分析MS患者妊娠前1年、妊娠期、分娩后1年的復(fù)發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)MS患者懷孕期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)下降，尤其是孕晚期，但分娩后3個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率顯著增加，然后逐漸恢復(fù)懷孕前狀態(tài)。FARES等[4]的試驗(yàn)結(jié)果顯示在懷孕期和分娩后第1年MS無(wú)復(fù)發(fā)，但分娩后第2年復(fù)發(fā)率稍增加，第3年后復(fù)發(fā)率回歸于普通MS患者。根據(jù)目前臨床試驗(yàn)結(jié)果提示妊娠時(shí)MS女性患者的復(fù)發(fā)率呈降低趨勢(shì)，并且還存在妊娠早、中晚期及分娩后的差異。同時(shí)有少量國(guó)外學(xué)者采用EAE小鼠模型進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，GEIKO等[6]發(fā)現(xiàn)妊娠期EAE大鼠模型其神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯低于對(duì)照組。GATSON等[7]研究發(fā)現(xiàn)妊娠期的EAE小鼠模型通過(guò)低表達(dá)TNF-a、IL-17等炎性因子減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)繼而使其神經(jīng)功能緩解。本實(shí)驗(yàn)同樣研究發(fā)現(xiàn)妊娠中期(妊娠周期為20～21 d，第13天處于妊娠中期)EAE小鼠的神經(jīng)功能缺失癥狀與對(duì)照組比較減輕。結(jié)合目前臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示妊娠期MS/EAE的復(fù)發(fā)率呈下降趨勢(shì)，臨床癥狀相對(duì)較輕。

MS妊娠期復(fù)發(fā)率下降及臨床癥狀相對(duì)緩解的作用機(jī)制目前仍不確定。目前研究發(fā)現(xiàn)可能機(jī)制為妊娠期母體激素包括雌激素、孕激素及雄激素大量合成后具有免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)作用[8-11]。MS是主要以CD4+Th1參與的細(xì)胞免疫為主的自身免疫性疾病，研究發(fā)現(xiàn)妊娠期母體高濃度雌激素能促使Th1型細(xì)胞免疫體系向Th2型體液免疫的明顯偏倚，繼而抑制促炎性Th1/Th17細(xì)胞的活化，從而下調(diào)MS患者Th1介導(dǎo)的慢性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕中樞神經(jīng)脫髓鞘和神經(jīng)退行性改變[12]，本研究采用組織學(xué)染色同樣發(fā)現(xiàn)妊娠期EAE小鼠脊髓實(shí)質(zhì)的脫髓鞘病理變化較對(duì)照組減弱。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)潛在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖，從而維持機(jī)體的免疫耐受[13]。Treg細(xì)胞能調(diào)節(jié)Th1、Th2及Th17免疫細(xì)胞的整體平衡，從而降低IFN-γ和IL-17等促炎性細(xì)胞因子的分泌，緩解MS/EAE臨床癥狀[14]。同時(shí)激活的Treg細(xì)胞可分泌IL-35和IL-10等抗炎性細(xì)胞因子，具有免疫抑制功能，繼而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和避免免疫反應(yīng)過(guò)度，故Treg細(xì)胞數(shù)量升高有利于自身免疫性疾病的病情緩解[9,15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，妊娠期EAE小鼠脾臟內(nèi)CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)百分比顯著增多，且血清中促炎性因子IFN-γ、IL-17降低和抗炎性細(xì)胞因子IL-10升高，而且采用HE染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)妊娠EAE小鼠脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減弱。因此，妊娠期MS/EAE的免疫系統(tǒng)可能通過(guò)分化和激活更多的Treg細(xì)胞來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，妊娠期EAE的臨床癥狀改善、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和脫髓鞘程度減輕；其可能的作用機(jī)制為增加機(jī)體分化更多的Treg細(xì)胞，并提高其分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-10的能力，同時(shí)抑制促炎性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17的分泌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后期研究提供一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。