微小RNA-4530通過靶向TRIB1抑制肝癌細胞增殖

程兆瑞，程小平，李福堂，陽建超，孫誠誼，喻 超

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽 550004；2.南昌大學第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006)

肝癌是世界第五大常見癌癥，是導致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。有研究[2]顯示，晚期肝癌患者總體5年生存率<5%。miRNAs是一類長度在21～23個核苷酸長度的非編碼RNA[3]。通過與靶基因結(jié)合減少靶基因的表達，miRNAs可調(diào)控細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和分化等多種生物學行為[4]。目前，已有多種miRNAs被發(fā)現(xiàn)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系：KE等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148b在肝癌中呈低表達且通過介導腫瘤相關(guān)巨噬細胞的浸潤，促進肝癌的生長和轉(zhuǎn)移；WANG等[6]研究顯示，miR-383可通過靶向IL-17激活STAT3信號通路，從而抑制肝癌細胞的增殖并促進肝癌細胞的凋亡；XU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-885-5p在肝癌細胞中表達顯著減少，直接靶向HK2調(diào)節(jié)肝癌代謝重編程從而抑制肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究探討miR-4530對肝癌細胞增殖的影響及其機制，為肝癌的治療提供可能的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco生物公司；miR-4530模擬物及陰性對照模擬物購自武漢聚能慧達生物有限公司；TRIB1(tribbles pseudokinase 1)過表達質(zhì)粒購自山東維真生物科技有限公司；RT試劑盒、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)相關(guān)SYBRP、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本Takara生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega公司；脂質(zhì)體2000、制膠試劑盒、脫脂奶粉和山羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；單克隆兔源性TRIB1抗體和鼠源性GAPDH購自美國CST公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 qRT-PCR檢測

收集人肝癌細胞MMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7細胞及正常肝細胞LO2，加入1 mL Trizol，裂解10 min。先后加入氯仿、異丙醇，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清。沉淀經(jīng)70%乙醇洗滌后，加入30 mL無酶水，測量RNA濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄；加入SYBR Green熒光染料，檢測miR-4530和TRIB1的表達。其中，miR-4530以U6為內(nèi)參，TRIB1以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔct法計算其在細胞中的相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 細胞培養(yǎng)及分組

人肝癌細胞MMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7細胞及正常肝細胞LO2均培養(yǎng)在含10% FBS和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，匯合度達80%時傳代并進行后續(xù)實驗。miR-4530陰性模擬物(NC mimic組)、miR-4530模擬物(miR-4530 mimic組)、TRIB1過表達質(zhì)粒(TRIB1-U組)以及miR-4530過表達模擬物聯(lián)合TRIB1過表達質(zhì)粒(miR-4530 mimic+TRIB1-U組)均以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染24 h，qRT-PCR檢驗轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細胞增殖能力檢測

肝癌細胞以每孔1000個鋪入96孔板中，每組設(shè)置5個復孔。分別于6、24、48及72 h加入10 μL CCK-8檢測試劑液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標儀450 nm處檢測各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值描繪生存曲線。實驗重復3次。

1.5 細胞克隆形成能力檢測

取對數(shù)生長期的Hep3B和Huh-7細胞(1×103個·孔-1)接種于六孔板中，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)的過夜細胞完全貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，清洗殘余結(jié)晶紫染液，干燥后拍照。實驗重復3次取平均值。

1.6 雙熒光素酶報告實驗檢測

利用在線數(shù)據(jù)庫targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)鑒定出TRIB1為miR-4530的靶基因之后，構(gòu)建野生型WT-TRIB1和突變型MUT-TRIB1的TRIB1的3′-UTR熒光素酶報告載體。Hep3B和Huh-7分別以1×104個鋪于24孔板中，共轉(zhuǎn)染含TRIB1 3′-UTR野生/突變序列的過表達質(zhì)粒和陰性對照/miR-4530模擬物。轉(zhuǎn)染24 h后，收集Hep3B和Huh-7細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告試劑盒說明書，在熒光定量儀中分別測定Hep3B和Huh-7細胞的熒光素酶活性。

1.7 Western blot實驗

收集細胞用含1：50的PMSF的RIPA在冰上裂解。4 ℃預冷離心機后，以12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清蛋白液。用BCA法定量蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸10 min。每孔取30 μg蛋白樣品上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳120 min，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜120 min，用5%脫脂牛奶封閉120 min，加入TRIB1和GAPDH一抗(1：1000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次(15 min·次-1)；分別加入相應(yīng)HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗(1：2000)室溫孵育120 min，TBST清洗3次(15 min·次-1)；在暗室中滴加曝光液，曝光顯影，用Image J軟件分析目的條帶。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 miR-4530在肝癌細胞系和正常肝細胞中的表達

miR-4530在LO2、SMMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7細胞中的相對表達量分別為1.00±0.06、0.64±0.12、0.57±0.11、0.43±0.08和0.38±0.04，呈依次降低趨勢(P<0.05)。選取Hep3B和Huh-7細胞作為后續(xù)功能實驗研究。見圖1。

*P<0.05與LO2比較，#P<0.05與Huh-7比較，△P<0.05與SMC7721比較。

2.2 miR-4530轉(zhuǎn)染效率的驗證

與轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物的Hep3B和Huh-7細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-4530模擬物的Hep3B和Huh-7細胞中miR-4530的表達明顯增加(P<0.01)，證明構(gòu)建miR-4530過表達模擬物成功。見圖2。

*P<0.01與NC mimic組比較。

2.3 過表達miR-4530對肝癌細胞增殖的影響

CCK-8實驗測定miR-4530對肝癌細胞增殖的影響，分別于6、24、48和72 h時間點下測得吸光度值繪制細胞生長曲線見圖3。結(jié)果表明，與NC mimics組相比，24、48及72 h，miR-4530 mimics組顯著抑制肝細胞Hep3B和Huh-7的增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

*P<0.05與NC mimics組比較。

2.4 過表達miR-4530對肝癌細胞克隆形成的影響

平板克隆實驗結(jié)果顯示，陰性對照(NC mimic組)和miR-4530(miR-4530 mimic組)過表達Hep3B和Huh-7細胞，克隆數(shù)分別為(365±37)、(172±34)個和(387±18)、(198±23)個，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，這提示過表達miR-4530明顯抑制Hep3B和Huh-7細胞的克隆形成能力。見圖4。

*P<0.05。

2.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-4530與TRIB1靶向關(guān)系

在線軟件Targetscan的預測結(jié)果顯示，TRIB1的3′-UTR能夠與miR-4530相結(jié)合，被鑒定為miR-4530的作用靶點，見圖5A。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-4530能夠顯著減少含野生型3′-UTR的TRIB1質(zhì)粒的熒光表達量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5B。

A:TRIB1的3′-UTR含有miR-4530的互補序列；B:雙分子熒光素酶實驗，*P<0.01與NC mimic組比較。

2.6 過表達miR-4530對TRIB1 mRNA和蛋白水平的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-4530 mimic組明顯減少TRIB1的mRNA水平，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見圖6A。Western blot結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-4530 mimic組明顯減少TRIB1的蛋白水平，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)(圖6B)。

A:miR-4530調(diào)控TRIB1的表達，*P<0.01與NC mimic組比較；B:TRIB1蛋白的表達。

2.7 過表達TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對肝癌細胞中TRIB1的抑制作用

構(gòu)建陰性對照、TRIB1過表達、miR-4530以及兩者共同過表達Hep3B和Huh-7細胞。qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，TRIB1過表達組細胞的TRIB1表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與miR-4530 mimics組相比，miR-4530+TRIB1共同過表達組細胞中TRIB1表達量明顯增加(P<0.01)。見圖7。

A:過表達TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對肝癌細胞TRIB1 mRNA表達的影響，*P<0.01；B:過表達TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對肝癌細胞TRIB1蛋白表達的影響。

2.8 過表達TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對肝癌細胞的增殖抑制

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，24、48和72 h時，TRIB1過表達組增殖能力明顯增強(P<0.05)；同樣與miR-4530過表達組相比，24、48和72 h時，miR-4530+TRIB1共同過表達組的增殖能力明顯增強，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖8。提示，過表達TRIB1明顯逆轉(zhuǎn)miR-4530介導的增殖抑制。

*P<0.05與NC mimic組比較，#P<0.05與miR-4530+TRIB1共同過表達組比較。

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年攀升。因早期缺乏特異性臨床癥狀導致多數(shù)肝癌患者確診已處于晚期，因此尋找一個新的診斷及治療方法顯得十分重要[8]。miRNAs為一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA,可通過直接結(jié)合其mRNA對其靶基因進行負調(diào)節(jié)[9]。miRNAs的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程有著密切的關(guān)系。miR-4530可被視為多種腫瘤的致癌基因或抑癌基因，包括胰腺癌[10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]、肺腺癌[13]等。SHAMS等[10]研究表明miR-4530在胰腺癌組織中表達減少，低表達miR-4530往往與胰腺癌患者不良預后相關(guān)；WANG等[11]研究表明miR-4530在人腦膠質(zhì)瘤中顯著下調(diào)，且通過靶向RTEL1來抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞的惡性生物學行為；此外，WANG等[12]證明miR-4530通過直接靶向RUNX2的表達增強乳腺癌細胞對新輔助化療的敏感性。KANG等[13]研究顯示，miR-4530可作為長鏈非編碼GATA6-AS1的ceRNA來調(diào)控肺腺癌的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

本研究通過qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)：與正常肝細胞LO2相比，肝癌細胞SMMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7中miR-4530的表達顯著減少。通過構(gòu)建miR-4530過表達肝癌Hep3B和Huh-7細胞后，應(yīng)用CCK-8和平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-4530能明顯抑制Hep3B和Huh-7細胞的增殖能力。提示，miR-4530在肝癌中可能扮演著抑癌因子的角色。

TRIB1屬于Trib家族，被歸為假激酶，影響著多種細胞過程，如增殖、分化、細胞周期和細胞死亡[14]，同樣在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用，如結(jié)直腸癌[15]、肝癌[16]和前列腺癌[17]等中TRIB1已被鑒定為致癌基因。WANG等[18]研究表明TRIB1在結(jié)腸癌中通過FAK/Src和ERK途徑激活MMP-2來促進結(jié)直腸細胞的運動。TRIB1在非小細胞癌中表達增高，高表達TRIB1往往預示著不良預后[19]；TRIB1在前列腺癌細胞中表達增多，且促進前列腺細胞分泌細胞因子并誘導單核細胞/巨噬細胞向M2巨噬細胞分化[20]。YOSHINO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TRIB1在急性髓系白血病(AML)中表達上調(diào)，且通過影響Hoxa9的轉(zhuǎn)錄從而加速AML的發(fā)展。本研究通過生物信息學方法分析發(fā)現(xiàn)，TRIB1被預測為miR-4530的可能的靶基因。在肝癌細胞中過表達miR-4530能顯著下調(diào)TRIB1的表達。最后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-4530能與TRIB1 3′-UTR直接結(jié)合。同時，在肝癌細胞中共同過表達miR-4530和TRIB1能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-4530對肝癌細胞的增殖抑制。由此提示，miR-4530抑制肝癌細胞Hep3B和Huh-7的增殖能力可能是通過減少TRIB1的表達介導的。本研究中沒有對miR-4530可能的抑癌機制進行深入探索，而是關(guān)注miR-4530對TRIB1的直接調(diào)控作用。

綜上所述，本研究表明miR-4530在肝癌細胞中表達減少，過表達miR-4530可以通過降低TRIB1的表達顯著抑制肝癌細胞的增殖能力。miR-4530和TRIB1可能是診斷肝癌的新的生物標志物，也是治療肝癌的有效靶點。尚需進一步深入研究miR-4530在其中可能的作用機制。