C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的提取及凋亡模型的建立

余真妍,楊洪賓,紀帥帥,劉 陽,霍 強*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室,蚌埠 233030;2南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:620793985@qq.com)

骨關(guān)節(jié)炎是一種嚴重影響患者生活質(zhì)量的關(guān)節(jié)退行性疾病[1],發(fā)病因素多,過程復(fù)雜,致病機制至今仍未知[2]。雖然發(fā)病機制尚不明確,但是越來越多的證據(jù)表明軟骨細胞的活化及其失調(diào)與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制密切相關(guān)[3]。軟骨細胞是在軟骨中發(fā)現(xiàn)的唯一一種細胞,其具有生成和維持膠原和蛋白聚糖等軟骨基質(zhì)的功能。在關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中,軟骨細胞是分泌炎性因子的主要細胞[4],但是軟骨細胞體外增殖能力有限,容易去分化失去原有表型。目前關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離及體外培養(yǎng)主要見于人[5]、兔[6]、大鼠[7]、豬[8]等,而對于來源于C57BL/6小鼠的軟骨細胞培養(yǎng)報道較少。同時,近年來大量研究表明軟骨細胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)[9]?；诠顷P(guān)節(jié)炎課題研究的需要,我們采用兩步酶消化配合機械吹打法從C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)中提取得到高活力的軟骨細胞,并采用經(jīng)典凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素(staurosporine,STS),構(gòu)建軟骨細胞凋亡模型,為骨關(guān)節(jié)炎藥物的開發(fā)提供可參考的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠10只,SPF級,15-18 g,雄鼠,由常州卡文斯實驗動物有限公司提供;星形孢菌素購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;胎牛血清購自浙江天航生物科技有限公司;0.25%胰蛋白酶、DMEM低糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;4%多聚甲醛固定液、甲苯胺藍購自上海麥克林生化科技有限公司;Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司;增強型CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;牛血清白蛋白、Ⅱ型膠原兔多克隆抗體、Cy3標(biāo)記山羊抗兔lgG、DAPI、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、引物、RNA提取液、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix購自武漢賽維爾生物科技有限公司;超凈工作臺購自德國Heraeus公司;二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司,LX-800酶標(biāo)儀購自美國Bio-tek公司;倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司;IX71倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;熒光定量PCR儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離、提取和培養(yǎng) 將10只15-18 g C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死后,75%酒精浸泡5 min,用手術(shù)刀將皮膚切開,沿髕骨下緣打開關(guān)節(jié)囊,切斷髕韌帶、內(nèi)外副韌帶及前后交叉韌帶,離斷膝關(guān)節(jié),去除股骨和脛骨表面的結(jié)締組織。用手術(shù)刀將各個肢體軟骨層約1/2削下,盡量削薄,放在含雙抗的PBS培養(yǎng)皿中,將取下的軟骨組織剪成1 mm×1 mm的小碎片,移至15 ml離心管中,使用含雙抗的PBS沖洗兩遍,洗去軟骨表面的血液及滑膜組織。加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶,放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱消化20 min。加入培養(yǎng)基終止消化,1 500 r/min,離心5 min,棄上清,加入0.2% Ⅱ型膠原酶重懸后,放至37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中消化8 h,中途每隔2 h拿出來,在超凈臺上用巴氏吸管吹打2 min,使膠原酶與軟骨組織充分接觸。加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化,反復(fù)吹打后過200目濾網(wǎng),收集濾液,1 500 r/min,離心5 min,棄上清,用DMEM完全培養(yǎng)基重懸后放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中。如剩余的軟骨組織呈團塊狀,未呈現(xiàn)出透明纖維狀,可再加入0.2% Ⅱ型膠原酶繼續(xù)消化,但確保消化時間不能超過12 h,否則過度消化會影響軟骨細胞的活性。24 h后初次換液,之后每隔兩天換液一次,待細胞長到80%以上時進行傳代,傳代時加入0.25%胰蛋白酶消化,顯微鏡下觀察細胞消化狀態(tài),待細胞變圓變亮且漂浮在溶液中時,加入與胰蛋白酶等體積的完全培養(yǎng)基終止消化,巴氏吸管吹打制成單細胞懸液,離心后重懸,按1 ∶3傳代培養(yǎng)。顯微鏡下觀察軟骨細胞貼壁生長情況,拍照記錄前5代軟骨細胞形態(tài)變化。

1.2.2 甲苯胺藍染色鑒定C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞 將軟骨細胞接種于六孔板中,每孔待細胞長滿到80%后,傾去培養(yǎng)液,PBS清洗3次,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min。傾去4%多聚甲醛溶液,PBS清洗3次,加入75%的乙醇固定30 min。傾去75%的乙醇溶液,PBS清洗3次,晾干。加入0.1%甲苯胺藍染色20 min。PBS清洗3次,無水乙醇再迅速清洗1次。晾干,顯微鏡下觀察,拍照。

1.2.3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞 將第3代C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞按照每孔2×104個細胞接種到放有爬片的六孔板中,待細胞長到約80%后,取出細胞爬片。PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗3次,3% BSA室溫封閉30 min,輕輕甩掉封閉液,加入1 ∶200經(jīng)PBS稀釋的一抗(Ⅱ型膠原),放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次,加入Cy3標(biāo)記山羊抗兔(1 ∶300),避光室溫孵育50 min。PBS清洗3次,避光,滴加DAPI染液,避光室溫孵育10 min。PBS清洗3次,爬片晾干后用抗熒光淬滅封片劑封片,倒置熒光顯微鏡下觀察,拍照。

1.2.4 RT-PCR檢測C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA的表達 RT-PCR分別檢測5代C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA的表達情況。根據(jù)Trizol實驗說明提取總RNA,再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄PCR說明書進行操作。反應(yīng)體系在25 ℃反應(yīng)5 min,42 ℃反應(yīng)30 min,85 ℃反應(yīng)5 s,完成cDNA的合成。PCR反應(yīng)體系擴增目的基因及內(nèi)參照β-actin,Ⅱ型膠原引物序列:上游5′-ACGCTACACTCAAGTCACTGAACAAC-3′,下游5′-TCAATCCAGTAGTCTCCGCTCTTC-3′;β-actin引物序列:上游5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,下游5′-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。PCR反應(yīng):95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,40個循環(huán),每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光,最后繪制熔解曲線。待測基因mRNA相對表達量以其擴增物的Ct值表示。

1.2.5 CCK-8法檢測C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖情況 分別將傳代培養(yǎng)的5代C57BL/6小鼠軟骨細胞用0.25%胰蛋白酶消化,900 r/min,離心4 min,DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞制成單細胞懸液,以每孔2×103的密度分別均勻接種于9塊96孔板中,每塊板每代設(shè)置6個復(fù)孔。每隔兩天換一次液,連續(xù)9 d,每天固定時間點取出一塊96孔板加入10 μl的CCK-8試劑,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h,酶標(biāo)儀450 nm處測定各孔OD值,取平均值。

1.2.6 流式細胞儀檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法檢測第3代軟骨細胞凋亡情況,軟骨細胞以2×104/ml接種于6孔板中,24 h后換為無血清培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0,5,10,20 μmol/L的星形孢菌素及200 μmol/L H2O2陽性對照刺激軟骨細胞24 h。細胞凋亡刺激后,先收集細胞培養(yǎng)上清,用不含EDTA的胰酶消化處理貼壁的細胞,用已收集的培養(yǎng)基上清終止消化,1 500 r/min,4 ℃離心5 min收集約1×105個細胞。用預(yù)冷的PBS清洗細胞2次,收集細胞。向收集的細胞中加入100 μl預(yù)冷的1×Binding Buffer,輕柔重懸細胞。向重懸細胞中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,輕柔混勻。室溫條件下避光反應(yīng)10 min后,加入400 μl預(yù)冷的1×Binding Buffer,輕輕搖勻,1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7 AOEB法檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用 為進一步驗證星形孢菌素對軟骨細胞的促凋亡作用,用吖啶橙/溴乙錠(AOEB)法檢測第3代細胞凋亡情況,將軟骨細胞分為正常組和10 μmol/L星形孢菌素作用組,用終濃度為10 μmol/L的星形孢菌素作用軟骨細胞24 h。收集細胞,PBS洗滌細胞2次,并配成2×105/ml細胞懸液,將AO與EB溶液等體積混勻,吸取25 μl的細胞懸液同1 μl的AO與EB混合液輕輕搖勻,吸取上述10 μl的混合液置于一干凈的載玻片上,并用蓋玻片蓋上細胞,熒光顯微鏡510 nm激發(fā)波長觀察細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)學(xué)特征

分離培養(yǎng)的原代C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞呈類圓形,懸浮于培養(yǎng)基中,大小均一,具有較強的折光性,倒置顯微鏡顯示,細胞在未貼壁前呈類球形,懸浮于培養(yǎng)基中,12 h內(nèi)逐漸貼壁,貼壁細胞大多數(shù)呈圓形,24 h內(nèi)基本貼壁,貼壁細胞大多數(shù)呈圓形或橢圓形,培養(yǎng)7 d后,原代細胞90%融合,胞體豐滿,胞質(zhì)均勻,核大而圓,細胞緊密排列呈“鋪路石”狀外觀,此時的軟骨細胞為第1代(P1)。消化傳代后,6 h左右可完全貼壁,傳代后細胞增殖速度加快,4 d左右就可見90%細胞融合。細胞隨著培養(yǎng)時間的增加,逐漸分化。不同代數(shù)細胞呈現(xiàn)出不同的形態(tài),由第1代的類圓形,第2代的三角形,到第3代的三角形及短梭形;3代后主要呈長梭形且形態(tài)不規(guī)則,胞核增大,胞質(zhì)邊緣模糊化(見圖1)。隨著傳代次數(shù)增加,細胞中梭形細胞逐漸增多,傳代周期延長,鏡下細胞長而大,折光性差,部分細胞脫落,懸浮于培養(yǎng)液中。

圖1 不同代數(shù)C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的形態(tài)變化Figure 1 Morphological changes of different generations of articular chondrocytes from C57BL/6 mouse

2.2 甲苯胺藍染色鑒定C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞

C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞第1,3,5代甲苯胺藍染色結(jié)果見圖2。第1,3,5代關(guān)節(jié)軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍染色后,胞內(nèi)呈藍色異染顆粒,胞核呈深藍色異染顆粒。并且隨著傳代數(shù)目的增加,細胞內(nèi)的異染顆粒顏色逐漸變淺。因此,甲苯胺藍染色結(jié)果證明提取的細胞為軟骨細胞。

圖2 不同代數(shù)C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞甲苯胺藍染色結(jié)果Figure 2 Toluidine blue staining of different generations of articular chondrocytes from C57BL/6 mouse

2.3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞

C57BL/6小鼠第3代關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色結(jié)果顯示,在細胞的細胞質(zhì)中Ⅱ型膠原染色表達紅色熒光,細胞核經(jīng)DAPI染色表達藍色熒光,圖片重合后藍色熒光位于紅色熒光內(nèi)(見圖3)。因此,Ⅱ型膠原免疫熒光結(jié)果證明培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞。

圖3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色結(jié)果Figure 3 Immunofluorescence staining of type Ⅱ collagen

2.4 RT-PCR法檢測C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達情況

5代C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達情況見圖4。與第1代軟骨細胞相比,第2代和第3代軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而第4代和第5代軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。

與第1代(P1)軟骨細胞相比,***P<0.001圖4 不同代數(shù)軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達Figure 4 The mRNA expression of type Ⅱ collagen in chondrocytes of different generations

2.5 CCK-8法檢測C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖情況

根據(jù)CCK-8法分別測定的5代C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的細胞活力,繪制軟骨細胞生長曲線,結(jié)果見圖5。細胞的生長曲線呈S型,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,3 d后細胞進入對數(shù)生長期,6 d后處于平臺期,細胞生長逐漸緩慢,7 d后細胞增殖能力開始呈下降趨勢。第4代和第5代軟骨細胞生長平緩,增殖高峰低,且這一變化隨著傳代次數(shù)增多愈加明顯,與第1代軟骨細胞相比,第4代和第5代軟骨細胞的細胞活力顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖5)。

2.6 流式細胞儀檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色流式結(jié)果見圖6。0,5,10,20 μmol/L星形孢菌素及H2O2分別作用軟骨細胞24 h后,細胞的凋亡率分別為(10.48±0.18)%,(42.97±2.02)%,(63.97±1.67)%,(64.52±2.55)%,(64.71±1.53)%。與H2O2組相比,0 μmol/L和5 μmol/L組凋亡率降低(均P<0.001),10 μmol/L和20 μmol/L組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此,10 μmol/L的星形孢菌素作用軟骨細胞24 h促凋亡最適宜。

與第1代(P1)軟骨細胞相比,*P<0.05圖5 不同代數(shù)C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞CCK-8檢測結(jié)果Figure 5 Growth curves of different generations of articular chondrocytes from C57BL/6 mice

圖6 流式細胞儀分析檢測軟骨細胞凋亡率Figure 6 Apoptosis of chondrocytes detected by flow cytometry

2.7 AOEB法檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用

吖啶橙/溴乙錠法(AOEB)軟骨細胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果見圖7。正常組細胞核質(zhì)體被吖啶橙(AO)均勻染成綠色,大小形狀單一,壞死細胞呈橢圓形,核質(zhì)體被溴乙錠(EB)均勻染成橙色,大小形狀單一。星形孢菌素10 μmol/L組作用24 h,凋亡早期細胞核質(zhì)體被AO均勻染成綠色,細胞形狀不規(guī)則,如新月形;凋亡晚期細胞,核質(zhì)體被EB均勻染成橙色,染色質(zhì)濃縮,細胞核碎裂成點狀,大小不一,可見胞質(zhì)芽狀突起。

圖7 熒光顯微鏡觀察第3代軟骨細胞AOEB染色情況Figure 7 AOEB staining of the third generation chondrocytes under fluorescence microscope

3 討論

正常的軟骨是一種特殊的結(jié)締組織,其主要成分是軟骨細胞和基質(zhì),不含纖維血管組織[10]。體外培養(yǎng)軟骨細胞是研究正常軟骨細胞生物學(xué)特性及骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的重要手段。長久以來,由于人們認為軟骨細胞不具備分裂增殖的能力[11],所以未進行軟骨細胞體外培養(yǎng)研究。自1967年Manning和Bonner使用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合來消化關(guān)節(jié)軟骨,把軟骨細胞從軟骨基質(zhì)中分離出來,獲得了數(shù)量多、活性好的軟骨細胞,改變了軟骨細胞不能分裂的傳統(tǒng)觀點[12]。本研究采用兩步酶消化法配合機械吹打提取C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞,通過兩步酶消化法分離出大量高活力的小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞,配合適當(dāng)?shù)臋C械吹打,有助于Ⅱ型膠原酶與軟骨細胞的充分接觸,分離出更多數(shù)量的C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞。

軟骨細胞是在軟骨中發(fā)現(xiàn)的唯一一種細胞,具有生成和維持膠原和蛋白聚糖等軟骨基質(zhì)的功能,主要包括Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖,是軟骨基質(zhì)的主要成分,Ⅱ型膠原表達陽性是軟骨細胞的特征性標(biāo)志[13]。本研究中對軟骨細胞的特征性標(biāo)志Ⅱ型膠原及蛋白聚糖進行檢測,表明培養(yǎng)的細胞是軟骨細胞。正常的軟骨細胞隨著傳代次數(shù)的增加Ⅱ型膠原逐漸轉(zhuǎn)化成Ⅰ型膠原,且分泌蛋白聚糖的水平也會降低,從而出現(xiàn)去分化現(xiàn)象[14]。軟骨細胞甲苯胺藍著色深淺程度及Ⅱ型膠原mRNA的表達量與傳代次數(shù)呈正相關(guān)。根據(jù)趙明等[15]的形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表示,體外培養(yǎng)3代以內(nèi)的軟骨持表型的穩(wěn)定,而3代后的軟骨細胞呈現(xiàn)出增殖緩慢及衰老的現(xiàn)象。因此,本研究主要考察3代內(nèi)的軟骨細胞的形態(tài)變化,并利用3代內(nèi)的軟骨細胞用于后續(xù)的實驗研究。

星形孢菌素是一種強效的ATP競爭性激酶抑制劑,能夠有效抑制蛋白激酶活性,抑制多種人癌細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡方法是激活胱天蛋白酶-3[16]。以往學(xué)者進行軟骨細胞的凋亡誘導(dǎo)時,使用的星形孢菌素濃度各不相同。Ahmed等[17]利用1 μmol/L星形孢菌素處理肥大軟骨細胞24 h誘導(dǎo)凋亡;Mukherjee等[18]發(fā)現(xiàn)軟骨細胞的活力依賴于星形孢菌素的濃度與作用時間,當(dāng)隨著星形孢菌素濃度(0.1,1,10 μmol/L)和作用時間(2,4,8 h)的增加,軟骨細胞的活力逐漸降低。上述研究結(jié)果均以軟骨細胞作為研究對象,尚未對軟骨細胞的代數(shù)進行篩選。因此,基于實驗研究的需要,本實驗以3代內(nèi)高活力表型良好的軟骨細胞為實驗基礎(chǔ),設(shè)置了0-20 μmol/L的星形孢菌素濃度梯度,而由于不能確定實驗加藥組的凋亡程度,因此采用H2O2作為一個誘導(dǎo)較強凋亡的陽性對照組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0-10 μmol/L的濃度范圍內(nèi),星形孢菌素對軟骨細胞的凋亡作用并不顯著,而超過10 μmol/L后,軟骨細胞的凋亡作用與H2O2陽性對照比無顯著差異。

本研究以3代內(nèi)高活力表型良好的C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞為主要研究對象,流式結(jié)果證明星形孢菌素可以誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡,同時利用AOEB法進一步驗證,10 μmol/L星形孢菌素作用于軟骨細胞24 h最適宜建立軟骨細胞的凋亡模型,為骨關(guān)節(jié)炎藥物的開發(fā)提供可參考的實驗方法。