諾如病毒病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的體液和黏膜免疫應(yīng)答

劉悅越,趙榮榮,趙一榮,張韻祺,杜加亮

(1中國(guó)食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室,北京 102629;2云南大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院;3中國(guó)食品藥品檢定研究院?jiǎn)慰寺】贵w產(chǎn)品室;*通訊作者,E-mail:dujialiang@nifdc.org.cn)

諾如病毒(Norovirus,NoV)是全球非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)的最重要病因[1],可引起低齡兒童、老年人和慢性病患者嚴(yán)重脫水,導(dǎo)致住院甚至死亡[2],造成沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)強(qiáng)調(diào)NoV是疫苗開(kāi)發(fā)的優(yōu)先事項(xiàng)。然而,用于諾如病毒培養(yǎng)的動(dòng)物或細(xì)胞模型的缺乏阻礙了疫苗的發(fā)展。NoV主要衣殼蛋白VP1具有自組裝能力,可形成無(wú)遺傳物質(zhì)的病毒樣顆粒(virus like particle,VLP),其在形態(tài)和抗原上類似于天然病毒[3]。已有研究表明,人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)[4]、流感病毒[5]、腸道病毒71[6]等的VLP候選疫苗具有安全性、免疫原性和有效性,HPV VLP疫苗的上市許可證明了VLP作為疫苗抗原的可行性。因此,VLP成為目前諾如病毒疫苗研發(fā)領(lǐng)域中理想的疫苗抗原。

根據(jù)病毒VP1基因序列差異,NoV可被分為10個(gè)基因組(GⅠ-GⅩ),其中GⅠ和GⅡ基因組是引起胃腸炎暴發(fā)的主要原因[7],而GⅡ.4毒株是全球流行的主要基因型,造成50%-70%的暴發(fā)[8]。我國(guó)的GⅠ.1/GⅡ.4型二價(jià)NoV疫苗正在臨床開(kāi)發(fā)中。有研究表明,漢遜酵母表達(dá)的重組NoV GⅠ.1和GⅡ.4型VLP可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)[9]。了解疫苗接種后抗體水平的變化規(guī)律,對(duì)合理評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果至關(guān)重要。本研究旨在通過(guò)血清型特異性IgG、IgM、IgA、組織血型抗原(histoblood group antigen,HBGA)阻斷抗體和糞便IgA等指標(biāo)探索NoV GⅠ.1/GⅡ.4 VLP候選疫苗在BALB/c小鼠體內(nèi)的抗體應(yīng)答。

1 材料和方法

1.1 疫苗

重組二價(jià)諾如病毒疫苗由國(guó)藥中生生物技術(shù)研究院有限公司提供,為GⅠ.1和GⅡ.4兩種基因型的NoV VP1組成的類病毒顆粒,每劑0.5 ml,含GⅠ.1和GⅡ.4型VP1蛋白各50 μg。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)雌性BALB/c小鼠,7周齡,18-22 g,購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0005。

1.3 主要試劑

中性親和素包被微孔板購(gòu)自Thermo Scientific公司,酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)costar公司,H(3型)-PAA-生物素和Leb-PAA-生物素購(gòu)自Glycotech公司,GⅠ.1型和GⅡ.4型NoV VLP由國(guó)藥中生生物技術(shù)研究院有限公司提供,GⅠ.1型、GⅡ.4型特異性抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,TMB購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及免疫

將20只BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組,每組10只。疫苗組每只小鼠接種0.1 ml二價(jià)諾如病毒疫苗,含GⅠ.1和GⅡ.4型VP1蛋白各10 μg及0.08 mg氫氧化鋁佐劑,對(duì)照組接種0.1 ml氫氧化鋁佐劑(0.08 mg),免疫程序?yàn)榈?,21天免疫。首次免疫后第7,14,21,28,35天,小鼠內(nèi)眥采血,分離血清-20 ℃保存,首次免疫第7,14,21,28天采集每組小鼠糞便,-20 ℃保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS以10%(W/V)比例制備糞便混懸液,2 300g離心10 min,取上清。

1.5 NoV型特異性血清IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA分析

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定血清中NoV型特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA[10]。分別用1 μg/ml GⅠ.1型和GⅡ.4型VLP包被96孔酶標(biāo)板,4 ℃過(guò)夜。洗板后每孔加入200 μl含2% BSA的PBS封閉液,4 ℃過(guò)夜。將200倍稀釋的血清加入酶標(biāo)板中,37 ℃孵育1 h。洗板后分別加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA,其中IgG、IgG1、IgG2a、IgA均為1 ∶6 000稀釋,IgM為1 ∶3 000稀釋,37 ℃孵育1 h。洗板后加入TMB底物20-25 ℃避光顯色15 min,終止液終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀450/630 nm讀板。以陰性對(duì)照小鼠血清孔的光密度值(optical density,OD)均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)為臨界值,如低于0.1,則以0.1為臨界值,血清樣品的OD值≥臨界值即為陽(yáng)性。

1.6 NoV型特異性血清和糞便IgA水平定量測(cè)定

采用ELISA測(cè)定血清和糞便中NoV型特異性IgA水平。實(shí)驗(yàn)方法同1.5。其中血清以200倍稀釋起,糞便以10倍稀釋起,2倍系列稀釋后進(jìn)行測(cè)定。抗體效價(jià)定義為OD值高于臨界值的血清或糞便的最高稀釋度,陰性樣品的抗體效價(jià)計(jì)為起始稀釋度的50%,即陰性血清樣品IgA效價(jià)計(jì)為100,陰性糞便樣品IgA計(jì)為5。

1.7 HBGA阻斷試驗(yàn)

通過(guò)HBGA阻斷試驗(yàn)測(cè)定血清中的GⅠ.1和GⅡ.4型抗體的HBGA阻斷效價(jià)[11]。分別用2.5 μg/ml的Leb-PAA-生物素和H(3型)-PAA-生物素包被中性親和素包被微孔板。將首次免疫第28天的小鼠血清100倍起2倍系列稀釋,疫苗組稀釋至12 800倍,對(duì)照組稀釋至800倍,分別與GⅠ.1型和GⅡ.4型VLP混合,設(shè)立稀釋液與VLP混合的對(duì)照,37 ℃孵育1 h。將混合物加至HBGA包被的微孔板中,4 ℃孵育2 h。洗板后,加入GⅠ.1型、GⅡ.4型特異性抗體,37 ℃孵育1 h。洗板后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h。洗板后加入TMB底物20-25 ℃避光顯色15 min,終止液終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀450/630 nm讀板。抗體的阻斷指數(shù)(%)=100%-(血清孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%。阻斷效價(jià)50(blocking titer 50,BT50)表示為阻斷50% VLP結(jié)合的血清最高稀釋度的倒數(shù),即為血清抗體阻斷病毒與HBGA受體或附著因子結(jié)合的能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件對(duì)血清各型抗體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)重復(fù)測(cè)量資料的方差分析統(tǒng)計(jì)疫苗組與對(duì)照組間各型抗體及疫苗組各型抗體不同時(shí)間點(diǎn)間的差異,如數(shù)據(jù)不滿足球形假設(shè),則用Greenhous-Geisser方法進(jìn)行校正。將血清IgA抗體濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后,通過(guò)重復(fù)測(cè)量資料的方差分析統(tǒng)計(jì)疫苗組與對(duì)照組間血清IgA水平的差異,并采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行疫苗組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的抗體水平差異分析,如差值不符合正態(tài)分布,采用兩相關(guān)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn),顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 血清NoV型特異性抗體

疫苗組小鼠第1劑免疫后第7天即產(chǎn)生NoV型特異性IgG、IgG1和IgG2a,至第35天一直維持在較高水平。IgM在第1劑免疫后第7天升至高水平,之后逐漸降低,IgA在第2劑免疫后第7天明顯升高(見(jiàn)圖1,2)。

圖1 疫苗組和對(duì)照組小鼠血清NoV GⅠ.1型特異性抗體反應(yīng)Figure 1 Serum NoV GⅠ.1-specific antibody response in vaccine group and control group

通過(guò)重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,疫苗組與對(duì)照組間各型抗體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。疫苗組不同時(shí)間點(diǎn)的抗體,除GⅠ.1型IgG和IgG1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其他均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(GⅠ.1型IgG2a:P<0.05;GⅠ.1型IgM、IgA和GⅡ.4型各抗體:P<0.01)。

2.2 免疫后血清NoV IgA水平

疫苗組在第1劑接種后第28天即第2劑接種后第7天血清特異性IgA達(dá)到較高水平,對(duì)照組均為陰性,疫苗組首劑接種后第28天和第35天的各型血清IgA抗體水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。疫苗組與對(duì)照組間血清IgA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 疫苗組免疫后血清IgA水平差異分析 (log2效價(jià),Table 1 The difference analysis results of serum IgA levels after immunization in vaccine

圖2 疫苗組和對(duì)照組小鼠血清NoV GⅡ.4型特異性抗體反應(yīng)Figure 2 Serum NoV GⅡ.4-specific antibody response in vaccine group and control group

2.3 免疫后糞便NoV IgA水平

疫苗組在第1劑免疫后第7天糞便IgA轉(zhuǎn)陽(yáng),第21天糞便IgA水平略有下降,第28天再次升高,疫苗組糞便GⅠ.1型IgA達(dá)到160,GⅡ.4型IgA達(dá)到80(見(jiàn)圖3)。

圖3 疫苗組和對(duì)照組糞便NoV GⅠ.1和GⅡ.4型特異性IgA抗體水平Figure 3 Fecal titers of NoV GⅠ.1- and GⅡ.4-specific IgA antibodies in vaccine group and control group

2.4 免疫后血清HBGA阻斷抗體水平

通過(guò)HBGA阻斷試驗(yàn)進(jìn)一步分析第28天,即第2劑免疫后第7天的小鼠血清抗體阻斷活性。結(jié)果顯示,疫苗組各型血清均有阻斷活性(見(jiàn)圖4),血清GⅠ.1型BT50達(dá)到400,GⅡ.4型BT50達(dá)到800。

圖4 疫苗組和對(duì)照組免疫后第28天血清HBGA阻斷抗體水平Figure 4 Levels of serum HBGA blocking antibodies at day 28 after the first immunization in vaccine group and control group

3 討論

NoV是全球流行性非細(xì)菌性胃腸炎的主要原因,多種候選NoV疫苗正在研發(fā)或臨床階段。由于NoV GⅠ和GⅡ基因組間無(wú)交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答[12],我國(guó)研究者以NoV GⅠ.1型和GⅡ.4型病毒株VLP組成二價(jià)疫苗,旨在提供廣泛的保護(hù)作用。為了初步評(píng)價(jià)該疫苗的免疫原性,本研究觀察了GⅠ.1和GⅡ.4諾如病毒VLP抗原在小鼠體內(nèi)的體液、黏膜和中和抗體應(yīng)答。

與Tamminen等[13]的VLP研究結(jié)果一致,本研究中小鼠接種1劑重組諾如病毒疫苗后,即產(chǎn)生較高的抗體反應(yīng),尤其是GⅠ.1型IgG,GⅡ.4型的IgG也呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),表明VLP蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。此外,作為細(xì)胞反應(yīng)標(biāo)志物的IgG亞類分析表明,各型抗原都會(huì)產(chǎn)生IgG1和IgG2a反應(yīng),提示誘導(dǎo)抗原特異性Th2/Th1型反應(yīng),前者參與調(diào)節(jié)抗病毒細(xì)胞免疫,后者增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。據(jù)報(bào)道EV71 VLP也可刺激免疫小鼠產(chǎn)生混合Th1和Th2型反應(yīng)[14],本研究結(jié)果顯示,第2次免疫后血清IgA抗體滴度增加至較高水平,表明重復(fù)疫苗接種有效地增強(qiáng)NoV衣殼特異性血清抗體反應(yīng)。在糞便樣品中也觀察到IgA反應(yīng),提示抗原激活機(jī)體黏膜免疫系統(tǒng)。黏膜免疫產(chǎn)生的IgA抗體能夠抑制病毒黏附于腸道黏膜表面,對(duì)某些抗原物質(zhì)具有封閉作用。與諾如病毒相似,輪狀病毒也是感染腸道表面,有證據(jù)表明,針對(duì)輪狀病毒的局部黏膜免疫反應(yīng)對(duì)于抵抗病毒感染至關(guān)重要,血清和糞便IgA抗體與防止輪狀病毒再感染有關(guān)[15]。由于兩種病毒的感染途徑相似,推測(cè)NoV特異性IgA可能也與機(jī)體抵御病毒感染的保護(hù)作用有關(guān)。較高的GⅡ.4特異性血清IgA抗體水平與受試者中NoV感染和患病率的降低有關(guān)[16]。然而,在一項(xiàng)GⅠ.1型NoV的攻擊研究中,病毒特異性血清IgA水平與相應(yīng)型別疾病的保護(hù)無(wú)關(guān),但較高的病毒特異性唾液IgA抗體水平可降低諾如病毒胃腸炎的風(fēng)險(xiǎn)[17],提示腸黏膜免疫可能對(duì)諾如病毒胃腸炎起保護(hù)作用。

由于NoV體外培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物模型尚不成熟,因此無(wú)法采用常規(guī)的病毒中和試驗(yàn)測(cè)定抗體中和效價(jià)。HBGA在人體分泌物中和黏膜表面表達(dá),諾如病毒可通過(guò)VP1突出的P2結(jié)構(gòu)域與HBGA的糖基相結(jié)合,進(jìn)入胃腸道上皮細(xì)胞。NoV特異性抗體可阻斷NoV VLP與其HBGA受體或附著因子的結(jié)合,研究表明阻斷NoV VLP與HBGA結(jié)合的抗體可能與保護(hù)作用有關(guān),因此學(xué)者們公認(rèn)將血清HBGA阻斷抗體作為中和抗體的替代指標(biāo)[18],其成為諾如病毒的免疫保護(hù)性標(biāo)志物。為了探索二價(jià)NoV疫苗誘導(dǎo)免疫的功能,確認(rèn)其抗體在中和方面的保護(hù)潛力,本研究測(cè)定抗原免疫后第28天的血清HBGA阻斷抗體水平,疫苗組血清GⅠ.1型和GⅡ.4型BT50分別不低于400和800。有學(xué)者在人群中研究HBGA阻斷抗體水平與保護(hù)作用之間的關(guān)系,結(jié)果GⅠ.1型血清HBGA阻斷效價(jià)≥200與對(duì)諾如病毒引起的疾病的有效保護(hù)有關(guān)[19],GⅡ.4型血清HBGA阻斷效價(jià)≥500與對(duì)諾如病毒導(dǎo)致的中至重度嘔吐或腹瀉的預(yù)防相關(guān)[16],提示該疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生阻斷抗體,為機(jī)體提供有效的保護(hù)作用。

本研究基于小鼠免疫接種試驗(yàn),結(jié)果提示重組NoV VLP疫苗通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)GⅠ.1和GⅡ.4型的保護(hù)性免疫反應(yīng)在小鼠中具有較好的免疫原性,可能為人體諾如疫苗免疫后的反應(yīng)評(píng)價(jià)研究提供參考。