免疫檢查點(diǎn)阻斷劑PD-1抗體在小鼠肝細(xì)胞癌治療中的應(yīng)用

買為麗旦·衣明江，塔來提·吐爾干，陳新華，吐爾干艾力·阿吉，張瑞青，張 巍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830054；*通訊作者,E-mail:zwyhr100@163.com)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第五大常見腫瘤，每年新發(fā)病高達(dá)80萬例，占原發(fā)性肝臟腫瘤的90%[1]，是我國惡性腫瘤繼肺癌之后的第2位，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。HCC起病隱匿，潛伏期長，患者早期通常沒有特殊癥狀，而一旦發(fā)病，往往已是中、晚期，病情發(fā)展迅速，預(yù)后極差，死亡率高[2]。HCC的治療以手術(shù)及放化療為主，近年來正在發(fā)展中的局部消融治療、免疫治療等逐漸成為肝癌治療的新策略[3,4]。免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)是人體免疫系統(tǒng)中起保護(hù)作用的分子，免疫檢查點(diǎn)分子過表達(dá)會抑制腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的免疫活性，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。基于這一機(jī)制，利用針對免疫檢查點(diǎn)分子或配體的單克隆抗體阻斷其信號傳遞，可以恢復(fù)細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性，從而誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)。免疫檢查點(diǎn)是腫瘤免疫逃逸的主要機(jī)制之一，其中最重要的是程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)/程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)。PD-1為免疫阻斷性受體，主要在周圍組織和腫瘤微環(huán)境中與它的配體PD-L1和PD-L2相互作用，從而抑制T細(xì)胞增殖、活化和分泌細(xì)胞因子[5,6]。使用PD-1受體拮抗劑可改善機(jī)體免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)，已在一些實體腫瘤中取得了一定的療效，但在肝癌患者中有效率低于30%[2,5]，這可能與肝癌免疫微環(huán)境耐受及免疫細(xì)胞浸潤不足有關(guān)[7]，但PD-1抗體對肝癌免疫微環(huán)境中各個免疫細(xì)胞的具體影響需進(jìn)一步研究。本實驗通過小鼠原位肝癌模型觀察PD-1阻斷劑在HCC中的治療效果和腫瘤微環(huán)境的變化，為PD-1阻斷劑的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

28只6-8周齡雌性SPF級C57BL/6J小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK(新)2018-0003，實驗動物質(zhì)量合格證：65000700001067。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會審查批準(zhǔn)，倫理審批號：IACUC20181203-01。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

鼠源性Hepa1-6肝癌細(xì)胞株由浙江大學(xué)陳新華教授惠贈。PD-1抗體(BioXcell，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，淋巴細(xì)胞分離液(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；免疫細(xì)胞檢測使用CD45-PC7-A、CD3-PECY5、CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PECY5、CD19 FITC-A和NK1.1-PECY7流式抗體，購自eBioscience(美國)。Th1類細(xì)胞因子檢測使用LEGENDplexTMMouse Th Cytokine Panel(13-plex)，購自Biolegend(美國)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠原位肝癌模型的建立

常規(guī)復(fù)蘇Hepa1-6肝癌細(xì)胞株，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)并傳代。將對數(shù)生長期的細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml。通過腹腔注射1%戊巴比妥(60 mg/kg)麻醉小鼠，麻醉見效后剖開小鼠腹腔，暴露小鼠肝臟，取50 μl細(xì)胞懸液與matrigel基質(zhì)膠混合，接種在肝左葉包膜下[8]。建模全過程無菌操作。

1.4 PD-1抗體阻斷實驗

建模完成后第8天，將小鼠隨機(jī)分為治療組和模型組，每組14只，8只取標(biāo)本，6只觀察生存狀態(tài)。治療組將PD-1抗體溶于500 μl的PBS中，每只小鼠腹腔注射200 μg PD-1抗體，每3 d一次，共注射3次[9]，模型組注射相同劑量的生理鹽水。治療后每天觀察兩組小鼠生存狀態(tài)。

1.5 腫瘤組織HE染色及病理學(xué)評估

治療結(jié)束后第2天，每組隨機(jī)選擇8只小鼠，通過摘眼球法取外周血后，處死小鼠取腫瘤組織，測量腫瘤組織標(biāo)本最大直徑，對比兩組小鼠腫瘤組織大小，并通過HE染色觀察兩組標(biāo)本病理特點(diǎn)。腫瘤組織標(biāo)本用3%中性多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成3 μm厚的連續(xù)切片，二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，將切片置于蘇木素染色2-4 min，鹽酸乙醇中分化以及自來水中返藍(lán)；切片置于伊紅染色液中1-2 min，脫水、透明、中性樹脂封片，光鏡觀察病理形態(tài)學(xué)改變。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織T、B、NK細(xì)胞及外周血Th1類細(xì)胞因子

外周血分離血清，用LEGENDplexTMMouse Th Cytokine Panel (13-plex)試劑盒檢測IL-2、IFN-γ、TNF-α濃度。取腫瘤組織制備單細(xì)胞懸液，以CD45-PC7-A為對照抗體，分別用抗T淋巴細(xì)胞(CD3-PECY5、CD4-FITC、CD8-PE)、B淋巴細(xì)胞(CD3-PECY5、CD19 FITC-A)、NK細(xì)胞(NK1.1-PECY7)抗體，使用DxFLEX(Beckman)流式細(xì)胞儀檢測CD3+T、CD4+T、CD8+T、B和NK細(xì)胞比例。實驗步驟按照抗體試劑盒說明書進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)采用Kaluza軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23和GraphPad Prism7(Version 7.00, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)軟件分析，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗比較兩組小鼠腫瘤大小，應(yīng)用雙因素方差分析比較兩組間T、B、NK細(xì)胞比例和細(xì)胞因子濃度的差異；用KaplanMeierr生存曲線法及Log-rank檢驗比較兩組間生存期的差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1抗體治療對腫瘤大小及病理特征的影響

治療組和模型組小鼠腫瘤直徑分別是(9.011±0.38)mm和(11.93±0.68)mm，治療組小鼠腫瘤直徑明顯小于模型組(t=3.74，P=0.002)。HE染色顯示，模型組腫瘤細(xì)胞實性片狀分布、核異型性明顯、可見核分裂，符合肝細(xì)胞肝癌的病理形態(tài)學(xué)特征，并腫瘤內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞(見圖1)。治療組腫瘤間質(zhì)纖維化、病灶出現(xiàn)不同程度的腫瘤細(xì)胞壞死融合，有彌散炎性細(xì)胞浸潤(見圖1)。

圖1 小鼠腫瘤組織HE染色Figure 1 HE staining of mouse tumor tissue

2.2 PD-1抗體治療對腫瘤局部免疫的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，治療組小鼠腫瘤組織總T細(xì)胞比例明顯高于模型組(P<0.001)；CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例均明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(分別P<0.001和P=0.001，見圖2)。

與對照組比較，**P<0.01，***P<0.01圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-1抗體對小鼠腫瘤組織T細(xì)胞比例的影響Figure 2 Effect of PD-1 antibody on T cell proportion in mouse tumor tissue by flow cytometry

為了了解PD-1抗體對體液免疫和固有免疫的的影響，檢測腫瘤組織B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，PD-1抗體治療組B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞比例均明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001，見圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-1抗體對小鼠腫瘤組織B和NK細(xì)胞比例的影響Figure 3 Effect of PD-1 antibody on the proportions of B,NK cells in mouse tumor tissue by flow cytometry

2.3 PD-1抗體治療對外周血細(xì)胞因子的影響

PD-1抗體治療組小鼠外周血IL-2濃度明顯高于模型組(P<0.001)；兩組間IFN-γ和TNF-α濃度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖4)。

2.4 PD-1抗體治療對小鼠生存期的影響

為了進(jìn)一步確定PD-1抗體在小鼠原位肝癌中的治療作用，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，采用Log-rank檢驗觀察兩組小鼠生存期并分別計算中位生存時間。結(jié)果顯示，PD-1抗體治療組小鼠中位生存時間為34 d，模型組小鼠為15 d，PD-1抗體治療組小鼠中位生存時間顯著延長(P=0.04，見圖5)。

與對照組比較，***P<0.001圖4 PD-1抗體對小鼠外周血Th1類細(xì)胞因子濃度的影響Figure 4 Effect of PD-1 antibody on the blood concentration of Th1 cytokines

圖5 PD-1抗體對小鼠生存期的影響Figure 5 Effect of PD-1 antibody on survival time of mice

3 討論

腫瘤免疫治療作為一種嶄新的治療手段，具備多方面的獨(dú)特優(yōu)勢，既可以治療原發(fā)腫瘤，又可以抑制腫瘤復(fù)發(fā)、減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10,11]。盡管生物免疫治療有可能徹底治愈惡性腫瘤，并在某些實體惡性腫瘤的治療上取得極為顯著的療效，然而，在肝癌的免疫治療方面，至今仍未見革命性突破效果。肝癌免疫治療藥物的種類及其療效仍然非常有限，針對肝癌免疫治療的臨床試驗數(shù)量仍不多。究其原因，主要是由于肝臟所特有的免疫抑制狀態(tài)和未能找到理想的相關(guān)抗原靶點(diǎn)[12]。近年來，PD-1受體阻斷劑在多種惡性腫瘤(如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌及腎細(xì)胞癌等)的臨床應(yīng)用中已取得很好的成果[6,13-21]。應(yīng)用PD-1阻斷劑可恢復(fù)T細(xì)胞的活性及功能，減輕患者免疫抑制狀態(tài)，從而達(dá)到抗腫瘤的目的[22]。更重要的是，PD-1抑制劑的制備選用的大都是IgG4或者經(jīng)過改造的IgG1亞型抗體，其天然的抗體依賴的細(xì)胞毒性效應(yīng)(ADCC)很弱，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性效應(yīng)(CDC)也幾乎沒有，從而避免了對T淋巴細(xì)胞的殺傷作用[23]。目前多個抗PD-1/PD-L1治療肝癌的臨床研究正在進(jìn)行中。

PD-1抗體可以通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖、活化發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[24]，本實驗通過小鼠原位肝癌模型觀察腫瘤組織T淋巴細(xì)胞比例的改變，結(jié)果顯示，腫瘤組織總T、CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞比例均升高，且PD-1抗體治療組小鼠生存期明顯延長。研究證明[25]，腫瘤組織中浸潤性T細(xì)胞的數(shù)量和患者的預(yù)后呈正相關(guān)，CD8+T細(xì)胞數(shù)量的增加能夠控制腫瘤的生長及延長生存期。CD4+T細(xì)胞通過多種機(jī)制促進(jìn)抗腫瘤免疫，不僅輔助激活CD8+T淋巴細(xì)胞，還參與B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化，并能吸引NK細(xì)胞到腫瘤局部，以發(fā)揮抗腫瘤作用。除此之外，CD4+T淋巴細(xì)胞通過與腫瘤細(xì)胞直接接觸介導(dǎo)其凋亡[26]。本研究結(jié)果顯示，PD-1抗體治療后小鼠腫瘤組織B和NK細(xì)胞比例顯著升高，這提示，PD-1抗體治療在肝癌微環(huán)境中，對B細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)亦有一定的增強(qiáng)作用。B淋巴細(xì)胞是通過產(chǎn)生特異性抗體和呈遞抗原從而促進(jìn)免疫效應(yīng)，并通過抗體依賴的、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，補(bǔ)體結(jié)合作用等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，在機(jī)體體液免疫應(yīng)答中占主導(dǎo)地位。而腫瘤浸潤性NK細(xì)胞比例通常與癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān),高比例患者預(yù)后比較好[27]。

腫瘤發(fā)生后，機(jī)體可以通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，其中輔助性T細(xì)胞(helper T lymphocyte，Th)無論在體液免疫還是細(xì)胞免疫中都發(fā)揮不可或缺的重要作用，根據(jù)其功能不同，Th細(xì)胞分為Thl和Th2兩個亞群。研究表明，以IL-2和IFN-γ介導(dǎo)的Thl為主的細(xì)胞免疫在清除腫瘤及獲得記憶性細(xì)胞免疫中起關(guān)鍵作用[28-29]，當(dāng)機(jī)體Thl細(xì)胞和及其分泌的細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α占優(yōu)勢，則提示機(jī)體對腫瘤具有較強(qiáng)的免疫力，在決定抗腫瘤免疫治療是否成功方面起到了重要作用[30]。其中IL-2是機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖、活化、促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體。本研究結(jié)果顯示，PD-1抗體治療組外周血IL-2和IFN-γ濃度均高于模型組，其中IL-2濃度在兩組間的差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。這說明，PD-1抗體治療可以上調(diào)外周血IL-2濃度，從而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。綜上所述，PD-1抗體治療可以明顯改善原位肝癌模型小鼠免疫微環(huán)境，并增強(qiáng)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而顯著延長小鼠生存時間，這結(jié)果為肝癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療提供了實驗和理論依據(jù)。