木薯粉及制品中高靈敏度AFB₁快速檢測(cè)方法研究

余厚美 王琴飛 林立銘 徐緩 李其鑄 范武波 張振文

摘要：【目的】基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)原理，建立高靈敏度的直接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)木薯粉及其制品中的黃曲霉毒素B1（AFB1），為木薯食品安全提供技術(shù)支持?！痉椒ā客ㄟ^(guò)對(duì)AFB1抗原結(jié)構(gòu)改造、免疫和細(xì)胞融合等過(guò)程獲得抗原抗體，建立高靈敏度檢測(cè)方法，并進(jìn)行木薯粉及其制品樣本的實(shí)例驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】制備的AFB1抗原和抗體，其抗體亞型均為IgG1，靈敏度最高的3F2細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體對(duì)黃曲霉毒素G1、G2和B2交叉反應(yīng)率分別為21.4%、1.9%和8.8%，且對(duì)其他毒素類無(wú)交叉反應(yīng)，建立的ELISA線性區(qū)間為0.02～0.48 μg/kg，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.047 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978）。以35%甲醇水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，木薯食品原料用70%甲醇水溶液加0.2 g NaCl作為提取液，含油脂的木薯糕點(diǎn)用70%甲醇水溶液作為提取液，所有樣本均為10倍稀釋，檢測(cè)限0.2～4.8 μg/kg，樣品添加回收率81.5%～120.0%，變異系數(shù)均小于8.5%。應(yīng)用驗(yàn)證試驗(yàn)表明，自建ELISA試劑盒對(duì)96份樣本檢出19份陽(yáng)性樣本，購(gòu)買(mǎi)試劑盒檢出7份陽(yáng)性，大于2.0 μg/kg的樣本檢測(cè)結(jié)果完全符合，自建ELISA試劑盒方法靈敏度優(yōu)于購(gòu)買(mǎi)的ELISA試劑盒。【結(jié)論】本研究建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用于木薯粉及其制品樣本中AFB1的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1;快速檢測(cè);酶聯(lián)免疫分析;木薯粉

中圖分類號(hào)：S379.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）10-2824-10

Abstract：【Objective】Based on the principle of enzyme-linked immunoassay（ELISA），to establish high-sensitive direct competitive ELISA for detecting aflatoxin B1（AFB1） in cassava flour and based products samples，provide technical support for cassava food processing and utilization. 【Method】Antigen and antibody were obtained through structural modification of AFB1 antigen，immunization，cell fusion and others protocol. Then the highly sensitive rapid test was established，and it was carries on to test examples comparison with kits from market for verification for cassava flour and based products sample. 【Result】The results showed that AFB1 antigen and antibody were successfully synthesized，whose antibody subtypes were all IgG1. One of the most sensitive 3F2 cell line had a cross-reactivity to aflatoxins G1，G2，and B2 for 21.4%，1.9%，8.8% respectively，and they had no cross-reactivity to other toxins. The linear range of ELISA was 0.02-0.48 μg/kg，half inhibitory concentration（IC50） was 0.047 μg/kg，the standard equation was y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978）. With 35% methanol aqueous solution as standard diluent，cassava food raw materials were extracted with 70% methanol aqueous solution and 0.2 g NaCl，the oil-containing cassava pastries were using 70% methanol aqueous solution as the extract，all samples were 10 times diluted. It also found the detection limit was 0.2-4.8 μg/kg and，the recovery rate of cassava flour and based products samples addition was 81.5%-120.0%，whose coefficient of variation was less than 8.5%. While，the test results showed that，the self-built ELISA kit detected 19 positive samples from 96 samples，and the purchased ELISA kit detected 7 positive samples. The detection results of samples more than 2.0 μg/kg were in complete agreement，self-developed ELISA kit was more sensitive than the ELISA kits from market. 【Conclusion】The direct competitive ELISA method established in this study has high sensitivity，simple operation to be widely used for rapid determination for AFB1 in cassava flour and based products.

Key words：aflatoxin B1; rapid test; enzyme-linked immunoassay（ELISA）; cassava flour

Foundation item：National Key Research and Development Program（2018YFF0213502）;Modern Agricultural Industrial Technology System Construction Project（CARS-11-HNZZW）;Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630052020018）

0 引言

【研究意義】黃曲霉毒素（Aflatoxins）是黃曲霉菌及曲霉寄生菌族類產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)類似物的總稱（李少暉等，2015），在各種糧食、食品和飼料中廣泛存在（劉偉偉等，2011），且理化性質(zhì)穩(wěn)定，現(xiàn)有的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝無(wú)法避免和消除污染（孫清，2017）。其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性和“三致”（致癌、致畸、致突變）均居首位（王督等，2014）。歐盟規(guī)定AFB1含量不得高于2 μg/kg，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定糧食中AFB1含量不得超過(guò)5 μg/kg，特殊膳食用食品不得超過(guò)0.5 μg/kg。木薯是一種重要的塊根糧食作物（朱艷梅等，2016;胡廣和梁大成，2019），全世界木薯產(chǎn)量的65%左右用于人類食物（韓和悅，2017）。我國(guó)是世界木薯第一進(jìn)口大國(guó)，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》第五法中AFB1在薯干中的檢出限是5 μg/kg。因此，制備抗原和單克隆抗體，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)檢測(cè)原理，建立高靈敏度的檢測(cè)方法檢測(cè)木薯粉及其制品中AFB1，對(duì)木薯粉及其食品制品的推廣和木薯食用化利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】檢測(cè)AFB1含量的方法主要有液相色譜法、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器方法（趙浩軍等，2013;謝潔，2017;任宏彬等，2019）和ELISA、免疫層析試紙條等快速檢測(cè)方法（王春燕等，2019;李丹陽(yáng)等，2020;張敏等，2020）。儀器方法雖然靈敏、準(zhǔn)確，但儀器昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法滿足基層對(duì)大量樣本的篩查。ELISA利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，具有靈敏度高、通量大、耗時(shí)短和成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于源頭監(jiān)測(cè)和成規(guī)模的樣本篩查（蔡雪等，2019;Satyanarayana et al.，2019）。蔣佳伊等（2020）利用ELISA檢測(cè)中藥材酸棗仁中AFB1，線性范圍為0.05～0.58 μg/kg，檢測(cè)限達(dá)1.69 μg/kg，與超高液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)結(jié)果符合良好。真菌毒素污染廣泛，王國(guó)強(qiáng)等（2019）對(duì)來(lái)自不同省份的飼料及其原料進(jìn)行霉菌毒素檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣本均被污染，同時(shí)被3種以上毒素污染的樣本高達(dá)76.55%。在喀麥隆、貝寧、尼日利亞等國(guó)家有木薯中檢測(cè)出AFB1的報(bào)道，除尼日利亞木薯樣本的檢測(cè)方法為薄層色譜法外，喀麥隆和貝寧木薯的檢測(cè)方法均為液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Adegoke et al.，1991，1993;Ediage et al.，2011，2014）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然國(guó)內(nèi)外己有AFB1的很多快速檢測(cè)產(chǎn)品出現(xiàn)，但目前未見(jiàn)有針對(duì)木薯粉及其制成的系列食品進(jìn)行AFB1定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】經(jīng)制備單克隆抗體，建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，檢測(cè)木薯粉及其制品中的AFB1，為木薯食品安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素M1（AFM1）、黃曲霉毒素M2（AFM2）、赭曲霉毒素A（OTA）、嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司;AFB1 ELISA試劑盒購(gòu)自河北伊萊莎生物技術(shù)有限公司;AFB1-BSA抗原和AFB1抗體購(gòu)自海南億康生物科技有限公司;小鼠抗體亞型鑒定試劑盒和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）購(gòu)自Sigma公司;氯化鈉和甲醇等化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Balb/C小鼠購(gòu)自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)中心;木薯全粉（Whole cassava flour，WCF）、 木薯淀粉（Cassava starch，CS）、木薯粉（Cassava flour，CF）、木薯干片（Dry cassava chips，DCC）、木薯面條（Cassava noodle，CN）、木薯粉條（Casssava starch noodles，CSN）、木薯粉酥餅（Cassava flour shortbread，CFS）、木薯蔓越莓餅干（Cassava cranberry cookies，CCC）和木薯蛋糕（Cassava cake，CC）樣品參照《木薯及其食品加工技術(shù)》（張振文和李開(kāi)綿，2019）進(jìn)行制作，木薯由國(guó)家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心提供;玉米和大豆購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。主要儀器設(shè)備：Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、DT5-2B離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）、AWL-0501-B純化儀（美國(guó)艾科浦公司）、SRY-150生化培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、MCO-18AC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）和BDS200倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）。

1. 2 AFB1抗原抗體的制備及鑒定

1. 2. 1 AFB1抗原制備及鑒定 偶聯(lián)物制備：參考鄧娟（2016）、孫清（2017）的方法合成AFB1肟化物（AFB1·O），經(jīng)質(zhì)譜掃描鑒定正確。用碳化二亞胺法（DCC法）將AFB1·O與載體蛋白BSA、OVA和HRP分別進(jìn)行偶聯(lián)，然后在pH 7.2的PBS中透析48 h，分裝保存于-20 ℃。

偶聯(lián)物鑒定：取偶聯(lián)產(chǎn)物AFB1-BSA、AFB1-OVA、AFB1-HRP和陰性對(duì)照BSA、OVA、HRP，與購(gòu)買(mǎi)的AFB1-BSA抗原作為包被抗原包被于酶標(biāo)板，同時(shí)包被PBS作空白對(duì)照，以購(gòu)買(mǎi)的AFB1抗體作為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行間接ELISA鑒定偶聯(lián)效果。

1. 2. 2 AFB1單克隆抗體制備 用免疫原皮下多點(diǎn)注射免疫Balb/C小鼠，用免疫前的小鼠血清作陰性對(duì)照，小鼠血清梯度稀釋，分別用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)效價(jià)和AFB1、AFB2、AFM1、AFM2、AFG1、AFG2標(biāo)準(zhǔn)品20 μg/kg對(duì)抗原抗體結(jié)合抑制的情況，挑選效價(jià)和抑制率高（劉偉偉等，2011）的小鼠，加強(qiáng)免疫后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0融合，挑選抑制率高的陽(yáng)性細(xì)胞克隆至陽(yáng)性單克隆率為100%，小鼠體內(nèi)誘生腹水，硫酸銨純化后-20 ℃分裝保存。

1. 2. 3 AFB1單克隆抗體效價(jià)及亞型鑒定 梯度稀釋包被抗原包被于酶標(biāo)板，梯度稀釋抗體，采用間接法檢測(cè)抗體效價(jià)，選擇陽(yáng)性孔OD值1.8～2.1的最高稀釋倍數(shù)為抗原抗體的效價(jià);亞型的測(cè)定根據(jù)Sigma試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1. 3 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法建立

1. 3. 1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA棋盤(pán)方陣測(cè)定效價(jià)，選取OD450最接近2.0的抗原、抗體和酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)作為效價(jià)，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度倍比稀釋進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、吸光度值的logit值為縱坐標(biāo)，建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1. 3. 2 單克隆抗體的特異性測(cè)定 以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、OTA、ZEN、DON和BSA分別作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用已建立的ELISA曲線進(jìn)行檢測(cè)，分別計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），以AFB1的IC50為標(biāo)準(zhǔn)，各標(biāo)準(zhǔn)品IC50與標(biāo)準(zhǔn)品AFB1的IC50比值即為交叉反應(yīng)率，比值越大，交叉反應(yīng)率越高。

1. 3. 3 快速檢測(cè)方法的穩(wěn)定性測(cè)試 將上述包被好單克隆抗體的酶標(biāo)板、HRP·AFB1酶標(biāo)抗原工作液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品液體等，分別分裝置于4 ℃冰箱和37 ℃生化培養(yǎng)箱保存，保存前和保存后第1、3、5、7、10和15 d分別對(duì)比保存在不同溫度條件試劑盒的OD值和IC50變化，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果推斷試劑盒儲(chǔ)存穩(wěn)定性。用不同批次制備的試劑盒分別做多個(gè)批次內(nèi)和批次間平行曲線，檢測(cè)其變異系數(shù)。

1. 3. 4 樣本中標(biāo)準(zhǔn)品的添加回收試驗(yàn)與樣本實(shí)測(cè) 參照謝琿等（2015）、宋衛(wèi)得等（2016）的方法進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)木薯干片、木薯蔓越莓餅干、木薯粉條、木薯面條、木薯蛋糕、玉米和大豆等大塊樣本進(jìn)行烘干粉碎，過(guò)80目篩。準(zhǔn)確稱取樣本2 g，分別加入一定量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使其濃度為0、0.5和2.0 μg/kg，再加入10 mL 60%～80%的甲醇水溶液（含0.2 g NaCl）作為提取液，封口后強(qiáng)力振蕩5 min，3500 r/min離心5 min后取上清液，用去離子水稀釋2～5倍，取50 μL進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算樣本的回收率。木薯蔓越莓餅干和木薯蛋糕等木薯食品樣本含油脂，在樣本中加70%甲醇水溶液作提取液，提取后取1.0 mL上清液，加入0.8 mL正己烷，封口后強(qiáng)力振蕩5 min，3500 r/min離心5 min后取下層上清液，用去離子水稀釋2～3倍，取50 μL進(jìn)行檢測(cè)?；厥章剩?）=實(shí)測(cè)濃度/添加濃度×100，回收率越接近100%表明檢測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確。同時(shí)將檢測(cè)結(jié)果與外購(gòu)AFB1 ELISA試劑盒進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，判斷該方法的準(zhǔn)確性。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Excel 2010分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 AFB1抗原鑒定結(jié)果

2. 1. 1 半抗原的鑒定 將AFB1肟化生成半抗原AFB1·O，AFB1的分子量為321，偶聯(lián)間隔臂羧甲基羥胺后，半抗原的分子量為385，半抗原作質(zhì)譜鑒定，正離子峰為386，結(jié)構(gòu)正確（圖1）。經(jīng)質(zhì)譜分析有AFB1·O單體峰存在，且AFB1特征峰消失，證明該物質(zhì)合成成功。

2. 1. 2 偶聯(lián)產(chǎn)物的ELISA鑒定 利用間接ELISA鑒定載體蛋白和半抗原的偶聯(lián)效果，購(gòu)買(mǎi)的偶聯(lián)抗原（AFB1-BSA）和偶聯(lián)產(chǎn)物（AFB1-BSA、AFB1-OVA、AFB1-HRP）的OD450遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照（BSA、OVA、HRP）和空白對(duì)照（PBS）OD450的2.1倍，確定偶聯(lián)成功（圖2）。

2. 2 小鼠血清效價(jià)及抑制率的測(cè)定結(jié)果

5只小鼠血清檢測(cè)抑制率結(jié)果如表1所示，2#鼠和3#鼠的血清在20 μg/kg的抑制率均超過(guò)50.0%，且對(duì)其他黃曲霉類標(biāo)準(zhǔn)品交叉率也較其他小鼠高，故挑選對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品抑制效果好的2#鼠和3#鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2. 3 單抗的效價(jià)及亞型測(cè)定結(jié)果

融合后的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)克隆篩選，得到9株陽(yáng)性單克隆細(xì)胞（表2），7株陽(yáng)性單克隆細(xì)胞體外誘導(dǎo)法制備的腹水效價(jià)均達(dá)到106及以上，抗體亞型均為IgG1型。9株單克隆抗體對(duì)AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率有所差別，細(xì)胞株3F2的抑制率最高（72.0%），故選擇細(xì)胞株3F2產(chǎn)生的抗體用以建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。

2. 4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖3所示，建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA均隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，IC50明顯降低，反應(yīng)時(shí)間同為30 min時(shí)，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法IC50為0.029 μg/kg，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法IC50為1.040 μg/kg。直接競(jìng)爭(zhēng)法更靈敏，IC50更低，更穩(wěn)定，加樣方法也更簡(jiǎn)單，故選取直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法體系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。以AFB1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值作橫坐標(biāo)、吸光度值的logit值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品AFB1濃度在0.02～0.48 μg/kg時(shí)有較好的線性關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978），靈敏度為0.02 μg/kg，IC50為0.047 μg/kg。

2. 5 單克隆抗體特異性測(cè)定結(jié)果

將不同種類標(biāo)準(zhǔn)品帶入建立的ELISA中檢測(cè)，結(jié)果（表3）顯示，該單克隆抗體對(duì)AFB1抑制效果最好，其次是AFG1、AFB2和AFG2，對(duì)AFM1、AFM2、OTA、ZEN、DON和BSA的交叉反應(yīng)率均小于1.0%，說(shuō)明制備的AFB1單克隆抗體的特異性良好。

2. 6 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

對(duì)比4和37 ℃保存不同時(shí)間條件的穩(wěn)定性，經(jīng)ELISA檢測(cè)，試劑盒空白OD值（B0）在37 ℃生化培養(yǎng)箱中保存7 d后下降了0.411，10 d下降0.587，15 d下降0.560，但I(xiàn)C50未見(jiàn)明顯變化。試劑盒在37 ℃生化培養(yǎng)箱保存10和15 d OD值下降不明顯，說(shuō)明試劑盒在下降到一定程度后較穩(wěn)定。按照37 ℃保存1 d相當(dāng)于4 ℃保存一個(gè)半月的模型計(jì)算，在37 ℃保存7 d穩(wěn)定的試劑盒，理論上在4 ℃可以保存10個(gè)月左右，保存15 d后IC50變化不大，只是OD值下降，不影響試劑盒的使用。經(jīng)檢測(cè)，批內(nèi)差異和批間差異均小于8.5%，說(shuō)明該檢測(cè)產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。

2. 7 標(biāo)準(zhǔn)品AFB1的添加回收率

2. 7. 1 樣本提取方法的確定 60%甲醇水溶液提取后直接檢測(cè)回收率為64%，70%和80%甲醇水溶液提取后直接檢測(cè)ELISA不顯色，可能是過(guò)高的甲醇會(huì)影響抗原抗體結(jié)合所致?；厥章孰S著甲醇溶液濃度升高而降低，80%甲醇水溶液的回收率最低;添加的NaCl越多，回收率越高，但本底和假陽(yáng)性也越高;相同的提取方法，回收率隨著檢測(cè)前稀釋倍數(shù)增大而升高。為避免假陽(yáng)性率，對(duì)比在60%和70%甲醇水溶液中加入不同NaCl和標(biāo)準(zhǔn)品的量，分別進(jìn)行10倍、15倍和25倍稀釋。如圖4所示，添加0.2 g NaCl時(shí)，回收率也可達(dá)100%左右，回收率隨樣本稀釋倍數(shù)增大而升高，添加0.5 μg/kg的回收率高于2.0 μg/kg，且70%甲醇水溶液提取的樣本0.5和2.0 μg/kg回收率差異更小，故優(yōu)選70%甲醇水溶液作為樣本提取液。

2. 7. 2 不同濃度甲醇水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液對(duì)樣本回收率的影響 樣品不同稀釋倍數(shù)和不同濃度甲醇水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液對(duì)樣本添加回收率的影響如圖5所示，樣本10倍稀釋、35%甲醇作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的回收率和樣本15倍稀釋、30%甲醇作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的回收率更接近100%，添加0.3 g NaCl也得出同樣的結(jié)果。為減少稀釋帶來(lái)的誤差，選擇樣本10倍稀釋、35%甲醇水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

2. 7. 3 不同類型木薯樣本的回收率 不同類型木薯食品原料樣本10倍和15倍稀釋后添加回收率如圖6所示，所有樣本10倍稀釋回收率在81.5%～120.0%，添加0.5 μg/kg的回收率均高于2.0 μg/kg，15倍稀釋的回收率均高于10倍稀釋，且部分回收率高于120.0%，容易造成假陽(yáng)性，故選用70%甲醇水溶液加0.2 g NaCl提取，封口強(qiáng)力振蕩5 min，3500 r/min離心5 min取上清液，再用去離子水2倍稀釋后檢測(cè)，作為木薯食品原料的樣本處理方法。該方法樣本檢測(cè)限范圍為0.2～4.8 μg/kg。

木薯蔓越莓餅干和木薯蛋糕等含油脂木薯糕點(diǎn)食品對(duì)比10倍和15倍稀釋后檢測(cè)，添加回收率如圖7所示，加大稀釋倍數(shù)和提取過(guò)程中加NaCl均可使回收率升高，不加NaCl提取的樣本10倍稀釋后樣本回收率為90.8%～103.1%，選用70%甲醇水溶液提取后取上清液1.0 mL，加入0.8 mL正己烷，振蕩離心后取下層上清液2倍稀釋后檢測(cè)，作為含油脂的木薯糕點(diǎn)食品樣本處理方法。該方法樣本檢測(cè)限范圍為0.2～4.8 μg/kg。

2. 8 樣本實(shí)測(cè)結(jié)果

用自建ELISA試劑盒和外購(gòu)的試劑盒對(duì)96份待檢樣本進(jìn)行初篩檢測(cè)，其中包括72份木薯粉及其制品樣本、15份玉米樣本和9份大豆樣本，結(jié)果（表5）顯示，自建ELISA試劑盒共檢出19份陽(yáng)性樣本，外購(gòu)ELISA試劑盒檢出7份陽(yáng)性樣本。

檢測(cè)的72份木薯粉及其制品樣本中，自建方法共篩出8份污染樣品，外購(gòu)試劑盒未篩出陽(yáng)性樣本。所檢測(cè)的36份木薯粉樣本中，4份樣本含有AFB1但未超標(biāo)，含量在0.32～0.75 μg/kg;其中17份木薯粉樣本敞口置于室溫條件下長(zhǎng)達(dá)20個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果和密封保存結(jié)果一致。木薯淀粉、木薯全粉、木薯干片、木薯粉條和木薯面條中未檢出AFB1，部分存放最久的木薯粉和木薯干片長(zhǎng)達(dá)5年仍未檢出AFB1。檢測(cè)的21份木薯糕點(diǎn)樣品中17份樣本已室溫存放1年，僅有4份樣本檢出含有AFB1，含量在0.41～0.54 μg/kg。

對(duì)15份玉米樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，自建ELISA試劑盒共檢出6份陽(yáng)性樣本，其中超過(guò)2.0 μg/kg的有3份;外購(gòu)ELISA試劑盒檢出3份陽(yáng)性樣本。自建ELISA試劑盒對(duì)9份大豆樣本檢出陽(yáng)性樣本為5份，其中超過(guò)2.0 μg/kg的有4份;外購(gòu)ELISA試劑盒檢出4份大豆陽(yáng)性樣本。

自建試劑盒檢測(cè)區(qū)間為0.2～4.8 μg/kg，外購(gòu)試劑盒檢測(cè)區(qū)間為2～50 μg/kg，所有已檢測(cè)出的木薯粉及其制品陽(yáng)性樣本含量已低于外購(gòu)試劑盒的檢測(cè)范圍，玉米和大豆樣本中大于2.0 μg/kg的樣本檢測(cè)結(jié)果完全符合，因此，本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度優(yōu)于外購(gòu)試劑盒。

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中評(píng)價(jià)方法進(jìn)行一致性分析，結(jié)果表明，卡方值為10.08，大于3.84，表示自建方法與外購(gòu)試劑盒的陽(yáng)性確認(rèn)比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異;所有樣本假陰性率均為0，假陽(yáng)性率為13.5%，相對(duì)準(zhǔn)確度為87.5%。

3 討論

AFB1屬于小分子化合物，需偶聯(lián)大分子蛋白載體后才具有免疫原性（楊利國(guó)等，1998;章飚等，2018）。本研究選取BSA作為免疫原的載體蛋白，OVA作為包被原的載體蛋白，這2種蛋白理化性質(zhì)穩(wěn)定，物美價(jià)廉。在AFB1全抗原偶聯(lián)鑒定方面，許多文獻(xiàn)均采用紫外掃描，強(qiáng)調(diào)偶聯(lián)比（陳宇熹等，2017;潘明飛等，2019），本研究利用現(xiàn)成的抗原抗體來(lái)驗(yàn)證是否已偶聯(lián)成功是最直觀和最廉價(jià)的評(píng)價(jià)方式，且可操作性強(qiáng)，對(duì)后期抗體的驗(yàn)證也可提供參考。

抗原抗體結(jié)合受反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH和緩沖液成分等影響（楊利國(guó)等，1998）。試驗(yàn)用相同的抗原抗體，不同反應(yīng)條件下，靈敏度和IC50差異較大，與反應(yīng)時(shí)間和加樣模式有關(guān)，且相同條件下，反應(yīng)時(shí)間越短，抗原抗體效價(jià)越低，所需抗原抗體用量越大。本研究中雖然直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法2種反應(yīng)模式的反應(yīng)時(shí)間同為30 min，但檢測(cè)數(shù)據(jù)差距較大，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法IC50為0.029 μg/kg，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法IC50為1.040 μg/kg。同樣是直接競(jìng)爭(zhēng)法，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，抗原抗體越能充分結(jié)合，但當(dāng)抗原抗體結(jié)合和解離反應(yīng)達(dá)到一個(gè)新的平衡后差異減小，結(jié)果趨于平穩(wěn)。

檢測(cè)AFB1等小分子物質(zhì)均采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA或間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（詹屋強(qiáng)和王弘，2015）。本研究采用包被固定單克隆抗體，樣本中AFB1和HRP-AFB1酶標(biāo)抗原均處于游離狀態(tài)，使其均在相同條件下競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)板上的抗體形成復(fù)合物，更具有公平競(jìng)爭(zhēng)性。本研究采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法相比，加樣更簡(jiǎn)單，從方法上減少操作誤差，準(zhǔn)確性更高（余厚美等，2017）。

不同樣本類型、稀釋倍數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品添加濃度等因素均對(duì)回收率有明顯影響，可能與樣本基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)（秦珊珊，2015）。許嬌嬌等（2017）用直接稀釋—超高液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定谷物及制品中真菌毒素時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分真菌毒素有基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng);符金華等（2019）在25種飼料及飼料原料中對(duì)16種真菌毒素的添加研究表明絕大多數(shù)真菌毒素在不同樣本中均有基質(zhì)效應(yīng)，AFB1在所有類型的樣本中均有基質(zhì)抑制效應(yīng)。范葉等（2019）在檢測(cè)蔬菜農(nóng)藥殘留過(guò)程中用相同儀器能減小基質(zhì)效應(yīng)，用與本底一致的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正樣品可有效消除基質(zhì)效應(yīng)。秦珊珊（2015）在采用HPLC-MS/MS檢測(cè)食用菌中80種農(nóng)藥殘留分析中發(fā)現(xiàn)稀釋法能消除大多數(shù)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)。凈化和稀釋是常用的去基質(zhì)效應(yīng)方法，但凈化需萃取、層析等步驟，成本高，操作復(fù)雜，本研究在靈敏度和檢測(cè)限允許的前提下，適當(dāng)稀釋樣本，去除基質(zhì)效應(yīng)，是低成本、易操作的一種去除基質(zhì)效應(yīng)的處理方式。評(píng)價(jià)方法分析中得出該方法有13.5%假陽(yáng)性，全部樣本無(wú)假陰性，是因?yàn)樽越ǚ椒`敏度高于參比方法所致。在各自檢測(cè)限范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果一致，因靈敏度更高，本研究建立的檢測(cè)方法實(shí)際檢測(cè)樣本更精確。

本研究中，部分木薯粉樣品在室溫下放置20個(gè)月仍未檢測(cè)出AFB1陽(yáng)性，所有樣本中只有少數(shù)樣本檢測(cè)出低陽(yáng)性，可能與新鮮木薯天然抗黃曲霉毒素污染有關(guān)，但在經(jīng)過(guò)烘干、烘焙加工等處理后會(huì)喪失這種特性（Adjovi et al.，2014）;也有可能是木薯粉和木薯干片在儲(chǔ)藏過(guò)程中受外界環(huán)境影響小;還有可能是木薯粉加工原材料——木薯肉表面原本無(wú)菌，在加工過(guò)程中感染的概率小。為了保證食用安全性，減少木薯粉中生氰糖苷含量，木薯粉是木薯去除外皮和周皮后加工生產(chǎn)（張振文和李開(kāi)綿，2019），加工前無(wú)黃曲霉菌等產(chǎn)毒菌株污染，所以相對(duì)其他農(nóng)作物如玉米、大豆（劉鳳芝等，2017）、花生（張杏等，2019）等在生長(zhǎng)過(guò)程中受污染，其感染概率低。比較檢測(cè)出弱陽(yáng)性對(duì)應(yīng)的木薯粉外觀，所有檢出陽(yáng)性的樣本顏色均呈褐色，有污染的樣本肉眼可辨。木薯食品中檢測(cè)出陽(yáng)性率稍高可能是加工過(guò)程中添加了雞蛋、黃油等高蛋白的原因，有部分有霉變現(xiàn)象但未檢測(cè)出AFB1陽(yáng)性，可能是有霉菌污染未產(chǎn)生毒素，或是其他類型的毒素污染（許嬌嬌等，2017;王國(guó)強(qiáng)等，2019）。本研究結(jié)果表明，只要儲(chǔ)藏得當(dāng)，木薯粉及其制品在一定時(shí)期內(nèi)受AFB1污染較少。此外，采用本研究建立的方法對(duì)玉米、大豆和花生等樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果和外購(gòu)試劑盒檢測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明本方法也同樣適用于其他糧食樣本的檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究成功制備了AFB1抗原和單克隆抗體，并建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，該方法既能檢測(cè)木薯粉及其制品樣本中的AFB1，也能檢測(cè)其他糧食樣本中的AFB1。該方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可批量檢測(cè)樣本等特點(diǎn)，易于被企業(yè)和基層檢測(cè)人員掌握和應(yīng)用，可為木薯食品中AFB1污染篩查提供快速檢測(cè)技術(shù)。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）