一株抗南方根結(jié)線蟲長形賴氨酸芽孢桿菌的分離鑒定及應(yīng)用

程菊娥 王東偉 成飛雪 朱春暉 王忠勇 史曉斌 鄭立敏 蘇品 劉勇 張德詠

摘要：【目的】篩選對南方根結(jié)線蟲具有良好活性的生防菌株，為殺線蟲制劑的研制與應(yīng)用提供理論依據(jù)。【方法】采用平板稀釋法對從抗線蟲黃瓜根系附近采集的土壤樣品進(jìn)行芽孢桿菌分離，通過浸漬法篩選出殺線活性高且穩(wěn)定的菌株，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析對活性菌株進(jìn)行分類鑒定，并通過離體、盆栽及田間試驗(yàn)對分離菌株防治南方根結(jié)線蟲的效果進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】篩選出1株具有較高殺線蟲活性的芽孢桿菌C1，經(jīng)鑒定菌株C1為長形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。殺線活性測定結(jié)果表明，菌株C1發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的相對抑制率為74.50%、對雌蟲孵化的相對抑制率為95.17%、對2齡幼蟲的24和48 h校正死亡率分別為98.83%和100.00%，且殺蟲活性穩(wěn)定;盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株C1發(fā)酵液50倍稀釋液對番茄南方根結(jié)線蟲的防效為73.24%;田間防病試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株C1發(fā)酵液50倍稀釋液對黃瓜南方根結(jié)線蟲病的防效達(dá)82.67%，且產(chǎn)量較清水對照增產(chǎn)20.0%。【結(jié)論】菌株C1不僅對南方根結(jié)線蟲病具有良好的防治效果，且能促進(jìn)作物生長，可作為生物農(nóng)藥和肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞： 南方根結(jié)線蟲;長形賴氨酸芽孢桿菌;鑒定;殺線活性;促生效果

中圖分類號： S432.45? ? ? ? ? ?   ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2765-11

Abstract： 【Objective】To screen the biocontrol strains with good activity against Meloidogyne incognita and provide a theoretical basis for the development and application of nematicidal agents.【Method】Bacillus was isolated from soil samples collected near the root of cucumber resistant to M. incognita by plate dilution method. Strains with high and stable nematicidal activity were screened by impregnation method. The active strains were classified and identified based on morphological characteristics， physiology and biochemistry and 16S rDNA identification. In vivo， pot and field experiments were conducted to verify the effect of the isolated strain on the control of M. incognita. 【Result】A Bacillus C1 with high nematicidal activity was screened， and the strain C1 was identified as Lysinibacillus macrolides. The nematicidal activity results showed that the relative inhibition rate of the fermentation supernatant of strain C1 on the egg hatching of M. incognita was 74.50%， the relative inhibition rate on the female hatching was 95.17%， and the 24 and 48 h corrected mortality of the second-stage juvenile were 98.83% and 100.00%， respectively， with stable nematicidal activity. Pot experiment showed that the control effect of 50 times dilution of fermentation broth of strain C1 on tomato M. incognita was 73.24%. The results of field disease control experiment showed that the control effect of 50 times dilution of C1 fermentation broth on cucumber M. incognita was 82.67%， with yield 20.0% higher than that of clear water control.? 【Conclusion】Strain C1 not only shows good control effect on M. incognita， but also promotes crop growth. It can be developed and utilized as biological pesticide and fertilizer in agricultural production.

Key words： Meloidogyne incognita; Lysinibacillus macrolides; identification; nematicidal activity; growth promoting effect

Foundation item：Special Construction Project of China National Modern Agricultural Industrial Technology System （CARS-16-E17）; National Natural Science Foundation of China（31401797， 31871941）

0 引言

【研究意義】植物根結(jié)線蟲是一類普遍發(fā)生的專性植物寄生病原線蟲，可對3000多種植物的生長發(fā)育造成嚴(yán)重危害（劉維志，1998;Jones et al.，2013），每年由根結(jié)線蟲等植物寄生線蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失約1500億美元（Li et al.，2015），被認(rèn)為是最嚴(yán)重的寄生線蟲（段玉璽，2011）。近年來，隨著我國蔬菜和糧食作物種植面積不斷擴(kuò)大、全球氣候變暖以及規(guī)?；s農(nóng)業(yè)的發(fā)展，根結(jié)線蟲病害愈發(fā)嚴(yán)重，對糧食和蔬菜等作物造成嚴(yán)重影響，受根結(jié)線蟲侵染的作物生長發(fā)育緩慢、產(chǎn)量顯著下降，嚴(yán)重制約了我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。由于缺乏抗性品種、復(fù)種指數(shù)高等原因，現(xiàn)階段根結(jié)線蟲的治理主要應(yīng)用化學(xué)方式，化學(xué)防治雖然可獲得較突出的效果，但由于化學(xué)藥劑存在諸多缺點(diǎn)，如污染生態(tài)環(huán)境、毒性較高等，導(dǎo)致根結(jié)線蟲產(chǎn)生一定的抗藥性。尤其在2009年哥本哈根聯(lián)合國氣候變化大會召開后，世界各國均在追求低碳環(huán)保發(fā)展，一些對生態(tài)環(huán)境污染較嚴(yán)重的高毒藥物被禁用，生物防治由于其生態(tài)友好性而為人們所重視（路雪君等，2010;張楠，2017;Gogoi and sarodee，2019;程萬里等，2020）。南方根結(jié)線蟲是我國分布最廣和危害最嚴(yán)重的一類植物寄生線蟲（葛俊杰等，2016;舒然等，2020），目前化學(xué)防治是其主要防治方法，迫切需要經(jīng)濟(jì)有效且對環(huán)境友好的防治根結(jié)線蟲綠色生物農(nóng)藥。因此，利用微生物及其代謝產(chǎn)物防治南方根結(jié)線蟲既能殺滅線蟲，又符合生態(tài)友好的發(fā)展趨勢，但仍需挖掘更多的生防資源并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根結(jié)線蟲生防資源包括真菌、細(xì)菌、放線菌、植物、病毒和捕食性線蟲等，其中根際細(xì)菌是當(dāng)前的熱點(diǎn)和主要研究方向（程菊娥和孔曉婷，2017）。在根際細(xì)菌中，對線蟲有活性的多為促生細(xì)菌，主要包括芽孢桿菌屬和假單胞菌屬（Siddiqui and Mahmood，1999）。Mahgoob和El-Tayeb（2010）利用多粘菌UBF15、巨型芽孢桿菌UBF10和圓球芽孢桿菌UBF20等根際細(xì)菌進(jìn)行殺線蟲試驗(yàn)，結(jié)果表明UBF15、UBF10和UBF20菌株混合處理能顯著減少線蟲在根和土壤中的繁殖，接種后90 d較未接種的對照根中根結(jié)、卵塊、幼蟲和雌蟲數(shù)量分別減少74.8%、79.5%、76.8%和53.3%。丁磊（2017）研究發(fā)現(xiàn)，根際細(xì)菌嗜線蟲沙雷氏菌PFMP-5在24 h內(nèi)對根結(jié)線蟲卵的孵化抑制率可達(dá)93%以上。呂達(dá)（2017）從山東省萊蕪市大姜種植區(qū)土壤中分離出23株細(xì)菌，其中菌株E5、E9和E17發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲的防效均在98%以上。趙丹（2018）使用5種高效根際細(xì)菌對番茄種子處理可高效防治南方根結(jié)線蟲病，其中變形斑沙雷氏菌處理番茄種子防治根結(jié)線蟲為首次報道。杜珊珊（2018）從煙臺棲霞和姜疃鎮(zhèn)西洋參地土壤中分離出136株細(xì)菌，其中11株細(xì)菌對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲（J2）的校正死亡率均在80%以上。趙惠（2018）從北方線蟲研究所分離的1458株細(xì)菌中篩選出2株對蔬菜根結(jié)線蟲有良好防效的菌株Sneb811和Sneb709，其校正死亡率分別為98.17%（48 h）和98.09%（48 h），經(jīng)鑒定Sneb811為莓實(shí)假單胞菌、Sneb709為解淀粉芽胞桿菌。劉廣穎（2020）從線蟲發(fā)生地分離到包括短小芽孢桿菌DDWD、耐鹽芽孢桿菌DDWA、芽孢桿菌DDWB、蠟樣芽孢桿菌 DDWWAI、海泥芽孢桿菌DDWC、銅綠假單胞菌JNB、東洋芽孢桿菌DDWNEI和假蕈狀芽孢桿菌JNC等8株具有殺線蟲活性的根際細(xì)菌，其中菌株DDWC對南方根結(jié)線蟲的防效達(dá)69.96%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前只有蠟樣芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等極少數(shù)生防菌登記應(yīng)用于根結(jié)線蟲防治，難以滿足市場需求?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用平板稀釋法對從抗線蟲黃瓜根系附近采集的土壤樣品進(jìn)行芽孢桿菌分離，對篩選獲得的菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，進(jìn)一步通過離體、盆栽和大田試驗(yàn)評價分離菌株對南方根結(jié)線蟲的防治效果及對作物的促生作用，為殺線蟲制劑的研制與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試土壤樣品 2018年7月在湖南省長沙縣春華基地黃瓜地塊，用取樣器（長55 cm，直徑2 cm）在抗線蟲黃瓜根系附近選5點(diǎn)取土壤樣品，深度10 cm，經(jīng)篩取后將樣品混合裝袋。

1. 1. 2 供試根結(jié)線蟲雌蟲、蟲卵和2齡幼蟲的準(zhǔn)備

參照劉維志（1998）的方法，將南方根結(jié)線蟲用感病寄主在室內(nèi)盆栽接種擴(kuò)大培養(yǎng)，在根系有大量雌蟲出現(xiàn)時，將根系用水輕輕沖洗，小心挑取雌蟲;將雌蟲放在0.5%次氯酸鈉溶液中消毒3 min，再用無菌水沖洗3次，放在盛有少量無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)，25 ℃培養(yǎng)4 d，每隔24 h收集一次新孵化的根結(jié)線蟲2齡幼蟲，配制根結(jié)線蟲液（1000條/mL），4 ℃保存?zhèn)溆?將被南方根結(jié)線蟲侵染的根全部剪碎，并直接放置于三角瓶內(nèi)，然后將100 mL 0.5%次氯酸鈉溶液倒入其中，振蕩2 min，再倒進(jìn)200/500目篩組中，通過自來水沖洗，對500目篩網(wǎng)中包含的卵進(jìn)行收集，最后對卵進(jìn)行稀釋處理，制備1000粒/mL的卵懸浮液。

1. 1. 3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，加水至1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃條件下滅菌30 min。NA液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，加水至1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

1. 1. 4 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（福際生物技術(shù)有限公司），2×Es Taq Master Mix（康為世紀(jì)生物科技有限公司），細(xì)菌通用引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 1. 5 主要儀器 OLYMPUS SZ51顯微鏡;OLYM PUS SX23顯微鏡;Eppendorf 5430R離心機(jī)（南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司）;LRH-250恒溫生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;全波長微孔板分光光度計（Bio Tek/Eon，美國）;W-CJ-FD超凈工作臺（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）;掃描電子顯微鏡（JEXL-230，日本電子株式會社），ZD-85振蕩培養(yǎng)箱（江蘇金壇市醫(yī)療器械廠）;凝膠成像儀（UVP凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司）;BKQ-B100II全自動內(nèi)循環(huán)立式高壓蒸汽滅菌器（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）;Eppendorf 5331 PCR儀（上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 芽孢桿菌分離 參照張立強(qiáng)等（2014）的平板稀釋法，將土壤配制成10-2～10-6懸浮液，分別取100 μL梯度懸浮液涂布于NA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2～4 d，挑選形態(tài)各異的單菌落，在純化培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線處理，得到純培養(yǎng)的單菌落，對菌株進(jìn)行編號處理，-80 ℃甘油中保藏。

1. 2. 2 芽孢桿菌發(fā)酵液及發(fā)酵上清液制備 將通過活化處理的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃下180～220 r/min振蕩培養(yǎng)1～2 d，部分備用;另一部分30 ℃下8000～10000 r/min離心，上清液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 殺線蟲活性芽孢桿菌篩選 采用Giannakou等（2005）的浸漬法，將900 μL芽孢桿菌發(fā)酵上清液與100 μL根結(jié)線J2懸浮液分別添加至24孔板的空穴中，4次重復(fù)。25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24和48 h后，參考孫海等（2020）的方法在體視顯微鏡下觀察并記錄線蟲死亡數(shù)，計算校正死亡率。設(shè)NA液體培養(yǎng)基為對照。

死亡率（%）=死亡的線蟲數(shù)/觀察的線蟲總數(shù)×100

校正死亡率（%）=（處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率）/（100-對照線蟲死亡率）×100

1. 2. 4 活性菌株穩(wěn)定性測定 選取活性菌株，將其涂布于NA培養(yǎng)基上，連續(xù)繼代培養(yǎng)5代后對各菌株的抗根結(jié)線蟲活性進(jìn)行測定，具體操作方式同1.2.3。

1. 2. 5 活性菌株鑒定

1. 2. 5. 1 培養(yǎng)及形態(tài)特征 參照成飛雪等（2011）的方法，30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落大小、顏色、質(zhì)地、形狀和濕潤度等。另取對數(shù)生長期的新鮮菌體于1000 r/min下離心8 min，去掉上清液后收集菌體，再經(jīng)2.5%戊二醛固定后用于電鏡觀察（李培京，2008）。

1. 2. 5. 2 生理生化特性測定 依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）進(jìn)行菌株生理生化特性鑒定。

1. 2. 5. 3 分子生物學(xué)鑒定 參考陳麗潔等（2019）的方法，基于菌株測序結(jié)果利用MEGA 7.0建構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 6 活性菌株發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制效果 將菌株發(fā)酵上清液配制成原液、5倍和10倍稀釋液3個梯度（依次記為處理1～處理3），于24孔板中分別加入900 μL不同梯度的發(fā)酵液和100 μL蟲卵懸浮液，混勻，各處理重復(fù)3次，以NA液體培養(yǎng)基為對照（處理4，CK）;25 ℃處理5 d后于體式顯微鏡下觀察計數(shù)，計算南方根結(jié)線蟲卵孵化率和相對抑制率。

1. 2. 7 活性菌株發(fā)酵上清液對根結(jié)線蟲雌蟲孵化的抑制效果 試驗(yàn)設(shè)2個處理，處理1：菌株發(fā)酵上清液處理，挑選大小相似、新鮮飽滿的南方根結(jié)線蟲雌蟲，先用0.5%次氯酸鈉溶液消毒2 min，再用無菌水沖洗，將雌蟲放置于含有900 μL發(fā)酵上清液的空穴中（2個/穴），25 ℃條件下進(jìn)行孵化，5 d后統(tǒng)計孵化的線蟲總數(shù)，求出雌蟲孵化抑制率;處理2（CK）：用NA液體培養(yǎng)基作為對照，處理方式同處理1。

1. 2. 8 活性菌株發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲J2的殺線蟲活性 方法同1.2.3。

1. 2. 9 活性菌株發(fā)酵液對盆栽番茄南方根結(jié)線蟲的防控效果 試驗(yàn)于2019年9—12月在湖南省植物保護(hù)研究所溫室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)期間平均濕度70%左右，溫度28 ℃。供試番茄品種鉆紅一號（市售），以1.8%阿維菌素水乳劑為對照藥劑。采用灌根法處理。在育苗盤中，用經(jīng)消毒處理的基質(zhì)培育番茄，番茄長至4片真葉時，選擇長勢優(yōu)良的番茄苗移植于經(jīng)消毒處理的花盆中，恒溫恒濕溫室培養(yǎng)，定期澆水施肥，保持土壤肥力和濕度;移栽7 d供試番茄植株定根后，在番茄根基部接種線蟲，1000頭/株。接蟲第5～10 d后，分別用活性菌株發(fā)酵液50倍稀釋液（處理1）、1.8%阿維菌素水乳劑500倍稀釋液（處理2）和NA液體培養(yǎng)基（處理3，CK）灌根，每處理20株番茄苗，50 mL處理液/株，每處理重復(fù)3次;15 d后再灌根處理一次，方法同第1次。第2次處理后30 d進(jìn)行調(diào)查，每處理調(diào)查10株番茄，參考成飛雪等（2011）的方法進(jìn)行番茄根結(jié)線蟲危害分級，計算病情指數(shù)和防治效果;同時測定番茄植株的株高和根長，計算增長率、病情指數(shù)和防治效果。

1. 2. 10 活性菌株發(fā)酵液對大田黃瓜南方根結(jié)線蟲病的防治效果 試驗(yàn)于2020年4—8月在湖南省長沙縣春華鎮(zhèn)蔬菜基地簡易大棚內(nèi)進(jìn)行，面積約120 m2，土壤為沙壤土，肥力中等，常年種植蔬菜，灌溉條件良好，歷年均有根結(jié)線蟲病發(fā)生，發(fā)病程度中等。供試黃瓜品種為鄂黃三號（根結(jié)線蟲感病品種，市售）。

試驗(yàn)設(shè)5個處理，處理1～處理3：依次為5×109 CFU/mL活性菌株發(fā)酵液50、100和200倍稀釋液;處理4：1.8%阿維菌素乳油800倍液;處理5：清水對照（CK）。按500 mL處理液/穴灌蔸處理，每處理4次重復(fù)，每小區(qū)10 m2，22株黃瓜/小區(qū)，各處理按完全隨機(jī)區(qū)組排列，其他水肥管理按常規(guī)。于移栽前（4月25日）進(jìn)行噴藥處理土壤，4月27日移植4葉黃瓜苗，5月2日和7日各灌根1次，共施藥3次。

根結(jié)線蟲J2數(shù)量、防治效果、黃瓜長勢及產(chǎn)量調(diào)查參考成飛雪等（2011）的方法，計算根結(jié)線蟲J2蟲口減退率、統(tǒng)計病情指數(shù)、防效及黃瓜產(chǎn)量和增長率。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行整理，運(yùn)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 芽孢桿菌的分離及篩選結(jié)果

從抗線蟲黃瓜根際土壤樣品中共分離出93株菌株，通過篩選得到4株校正死亡率為85.00%以上的菌株，其中菌株C1發(fā)酵上清液對根結(jié)線蟲的校正死亡率約為95.96%，5次繼代培養(yǎng)后的殺線蟲活性仍在93.01%左右（圖1），表明菌株C1具有較強(qiáng)的抗根結(jié)蟲活性及穩(wěn)定性。

2. 2 菌株C1鑒定

2. 2. 1 菌株形態(tài)鑒定 將菌株C1在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)（圖2），其菌落直徑2～4 mm，圓形、偏淡黃色、光滑、不透明、表面平坦且有光澤、邊緣較整齊，細(xì)菌在電子顯微鏡下呈長桿（圖3）。

2. 2. 2 菌株生理生化測定 由表1可知，菌株C1的淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)和菌膜形成試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)，H2O2酶試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)。

2. 2. 3 菌株16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果菌株C1的16S rDNA序列長度為1455 bp，其NCBI登錄號為MK949359。將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，運(yùn)用MEGA 7.0構(gòu)建菌株C1序列與參比菌株序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）顯示，菌株C1與Lysinibacillus macroides（登錄號KX027335）處于同一個分支，存在一定的親緣關(guān)系，同源性在99.79%左右。綜合菌株C1形態(tài)、生理生化和分子鑒定結(jié)果，菌株C1鑒定為長形賴氨酸芽孢桿菌（L. macroides）。

2. 3 菌株C1發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲卵的抑制效果

由表2可知，以NA液體培養(yǎng)基為對照，南方根結(jié)線蟲卵5 d的孵化率達(dá)92.3%，但經(jīng)過菌株C1發(fā)酵上清液原液和5倍、10倍稀釋液處理的卵孵化率為24.1%～33.5%，顯著抑制了南方根結(jié)線蟲卵的孵化（P<0.05，下同），相對抑制率可達(dá)64.72%～74.50%，說明菌株C1發(fā)酵上清液能有效抑制南方根結(jié)線蟲卵的孵化。

2. 4 菌株C1發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲雌蟲孵化的抑制效果

由表3可知，經(jīng)過菌株C1發(fā)酵上清液處理后，南方根結(jié)線蟲雌蟲孵化的相對抑制率達(dá)95.17%，明顯抑制了南方根結(jié)線蟲雌蟲的孵化，顯示出良好的應(yīng)用前景。

2. 5 菌株C1發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲J2的殺線蟲活性

菌株C1發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲J2的24和48 h校正死亡率分別為98.83%和100.00%，說明菌株C1發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲具有顯著的毒殺效果（表4）。

2. 6 菌株C1發(fā)酵液對盆栽番茄南方根結(jié)線蟲的防控效果

盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株C1發(fā)酵液處理的番茄根結(jié)較少，根系相對發(fā)達(dá)，而對照根結(jié)成瘤（圖5）。

由表5可知，經(jīng)菌株C1發(fā)酵液處理的病情指數(shù)明顯低于對照，防效達(dá)73.24%，且比阿維菌素對照處理的效果（防效為67.79%）更佳;菌株C1發(fā)酵液處理的番茄株高和根長較阿維菌素和對照處理均有明顯增加，分別比對照處理高58.30%和47.17%。

2. 7 菌株C1發(fā)酵液對大田黃瓜南方根結(jié)線蟲病的防治效果

由表6可知，相較于清水對照（CK），3種不同濃度的菌株C1發(fā)酵稀釋液處理均能降低黃瓜根圍土壤中根結(jié)線蟲J2的種群數(shù)量，尤其是50倍液處理30 d后的蟲口減退率達(dá)79.07%，與阿維菌素的防效（82.11%）無顯著差異（P>0.05，下同）。

從表7可看出，各濃度菌株C1發(fā)酵稀釋液處理對黃瓜根結(jié)線蟲病均有一定的防治效果，其中50倍稀釋液的防效可達(dá)82.67%，與對照藥劑阿維菌素處理的防效（86.22%）無顯著差異。施用菌劑后，于黃瓜幼苗期和坐果期測量黃瓜株高，結(jié)果顯示，3種不同濃度的菌株C1發(fā)酵稀釋液處理對黃瓜生長均有一定的促進(jìn)作用，其中50倍稀釋液處理的效果最佳，其苗期和坐果期株高分別較CK高3.3和24.6 cm;同時，各處理黃瓜產(chǎn)量也顯著提升，尤其是50倍稀釋液處理的黃瓜小區(qū)產(chǎn)量較CK增產(chǎn)22.0%，顯著高于阿維菌素處理（增產(chǎn)率為11.3%）。表明菌株C1發(fā)酵液不僅對蔬菜根結(jié)線蟲病有良好的防治效果，且能促進(jìn)蔬菜生長，提高作物產(chǎn)量，具有良好的應(yīng)用前景。圖6為大田試驗(yàn)各處理黃瓜植株和根部生長情況。

3 討論

植物根結(jié)線蟲危害作物種類廣、傳播途徑多樣，因其寄生于植物根內(nèi)韌皮部，加之蟲體結(jié)構(gòu)的特殊性，病原抗藥性很強(qiáng)，僅有少數(shù)幾種化學(xué)農(nóng)藥對其具有較好的防治效果，但長期使用會提高線蟲的抗藥性，使防治用藥量日趨增大。本研究篩選的長形賴氨酸芽孢桿菌C1菌株對南方根結(jié)線蟲具有較高活性，離體對南方根結(jié)線蟲卵、雌蟲和J2均有較好的控制作用，大田對黃瓜根結(jié)線蟲病亦有較好的防治效果，且能促進(jìn)蔬菜生長，提高作物產(chǎn)量，具有抗病促生作用。

對于植物根結(jié)線蟲的預(yù)防和防治，生物手段是目前的主要研究方向。植物根結(jié)線蟲生防資源是指其在自然界的所有天敵生物，包括真菌、細(xì)菌、放線菌、植物、病毒和捕食性線蟲等（祝明亮等，2004;郝昕等，2021），其中生防細(xì)菌是近年的研究熱點(diǎn)，越來越多的細(xì)菌被分離，不同的作用方式被報道。根據(jù)作用方式不同，又分為寄生細(xì)菌、內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌3大類。研究人員對根際生防菌進(jìn)行了深入研究，包括資源篩選、活性物質(zhì)分離鑒定及機(jī)理研究等。就生防資源而言，能有效防治植物寄生線蟲的根際芽孢桿菌種類很多。因芽孢桿菌在自然界各種生境中普遍存在，且環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，能自動產(chǎn)生多種可抑制線蟲活性的代謝物，同時可有效促進(jìn)植物生長發(fā)育等（Abd-Elgawad and Askary，2018;Mhatre et al.，2019），而具有防治土傳病害的優(yōu)勢，如解淀粉芽孢桿菌（朱麗梅等，2009）、巨大芽孢桿菌（梁建根等，2011）、蘇云金芽孢桿菌（成飛雪等，2011）、枯草芽孢桿菌（Khalil et al.，2012）、簡單芽胞桿菌（王進(jìn)福等，2016）、阿氏芽孢桿菌（姚思敏，2018）、堅強(qiáng)芽孢桿菌（劉廣穎，2020）和蠟樣芽胞桿菌（趙勁捷等，2020）等多種芽孢桿菌被應(yīng)用于根結(jié)線蟲防治，其中利用最成功的是蘇云金芽孢桿菌，為無公害生產(chǎn)中首推的生物殺蟲劑品種（Wei et al.，2003;徐重新等，2019）。賴氨酸芽孢桿菌與其他芽孢桿菌一樣廣泛存在于土壤、海洋、植物及動物體內(nèi)，但相關(guān)應(yīng)用限于生物表面活性劑（Seo et al.，2013）、重金屬污染治理和控制蚊媒疾?。╒argas and Dussán，2013）、胞外多糖生產(chǎn)（曾承露等，2017）、石油降解（李國麗等，2018）和抑制真菌（鄭雯等，2019）中，對于在線蟲病害防治方面的研究鮮有報道。

前期研究已證明根際促生菌對根結(jié)線蟲的控制效果，芽孢桿菌、假單胞菌的細(xì)菌懸液和濾液對爪哇根結(jié)線蟲（Siddiqui and Shaukat，2003）、南方根結(jié)線蟲（Radwan et al.，2012）和埃塞俄比亞根結(jié)線蟲（Aballay et al.，2013）幼蟲的防效均超過70%，對卵孵化也有類似的效果;同時，溫室條件下根際細(xì)菌對根際寄生蟲的防效為80%（Aballay et al.，2013）。但目前對根際細(xì)菌防治線蟲的拮抗機(jī)制研究還不夠透徹，大致分為以下幾個方面：（1）根際細(xì)菌可改變根際分泌物。Racke和Sikora（1992）研究發(fā)現(xiàn)，根際細(xì)菌致使植物根際分泌物發(fā)生改變，進(jìn)而影響其寄生線蟲的發(fā)育。（2）根際細(xì)菌通過代謝產(chǎn)生如抗生素、次生代謝物、酶、NH3、NO2、H2S和小分子物質(zhì)等影響線蟲的行為或殺死線蟲（郭榮君等，1996;Siddiqui and Shaukat，2003）。程萬里等（2020）從江西省湖口縣有機(jī)復(fù)合污染的毛茛根際土壤中分離得到多粘類芽胞桿菌KM2501-1產(chǎn)生的環(huán)二肽類物質(zhì)cyclo （Pro-Phe）殺線蟲效率達(dá)84.75%。（3）根際細(xì)菌與線蟲的營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競爭。Zuckerman和Kuhlman（2001）研究發(fā)現(xiàn)，主根表層的凝聚素與根結(jié)線蟲體表糖蛋白相互識別從而致使寄主植物受到侵染。（4）根際細(xì)菌誘導(dǎo)作物系統(tǒng)抗性。巨大芽孢桿菌Sneb 207能誘導(dǎo)大豆植株對大豆孢囊線蟲產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，使葉綠素含量提高，光合速率增大，從而達(dá)到防治病害的目的（周園園，2016）。以上報道表明，根際細(xì)菌對線蟲的抑制活性是一種或幾種因子共同作用的結(jié)果。本研究認(rèn)為，正是根際細(xì)菌對線蟲抑制作用機(jī)制呈多樣性的特點(diǎn)，使根際細(xì)菌成為當(dāng)前線蟲生物防治中重要的天敵類群而受到研究者的關(guān)注。

本研究篩選獲得的長形賴氨酸芽孢桿菌C1，前期試驗(yàn)表明其不僅對南方根結(jié)線蟲具有毒殺效果，同時對花生根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、擬禾本科根結(jié)線蟲和模式線蟲——秀麗小桿線蟲等也具有較高的活性（程菊娥，2020），說明該菌株對線蟲具有廣譜抗性。無論是離體測試的發(fā)酵上清液還是田間試驗(yàn)發(fā)酵液，菌株C1對南方根結(jié)線蟲均具有明顯防效，說明該菌株的代謝產(chǎn)物具有殺線蟲活性，具有較高的研究價值。長形賴氨酸芽孢桿菌作為一類藥肥兩用的根際微生物在植物線蟲病害生物防治方面具有較大的開發(fā)潛力，其發(fā)酵液次級代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)鑒定及其對線蟲的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

篩選獲得的長形賴氨酸芽孢桿菌菌株C1不僅對南方根結(jié)線蟲病具有良好的防治效果，且具有促進(jìn)作物生長的作用，可作為生物農(nóng)藥和肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開發(fā)利用。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）