利用Design-Expert響應(yīng)面法優(yōu)化南方稻谷防霉劑配方及驗(yàn)證

張典典 高家東 戴彰言 張文虎 張友勝 劉軍

摘要：【目的】篩選適合南方稻谷貯藏要求的防霉劑配方，為南方稻谷貯藏提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳援?dāng)年收儲(chǔ)、入庫貯藏3～6個(gè)月的秈稻稻谷（新糧）和入庫貯藏12～24個(gè)月的秈稻稻谷（陳糧）為試驗(yàn)材料，分析稻谷帶菌總量、主要污染菌種類以及藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油等5種植物提取物對(duì)稻谷中黃曲霉的抑制效果;以黃曲霉的抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，通過Design-Expert響應(yīng)面法進(jìn)行南方稻谷復(fù)合防霉劑最佳配方設(shè)計(jì)?！窘Y(jié)果】新糧稻谷樣品帶菌量為1.1×103～9.2×103 CFU/g，陳糧樣品帶菌量為8.1×103～2.2×105 CFU/g，陳糧樣品的帶菌總量明顯高于新糧樣品;南方稻谷的主要污染菌屬以曲霉屬和青霉屬為主，其次是毛霉屬和鐮刀菌屬;5種植物提取物對(duì)黃曲霉的抑菌圈直徑在8.4～11.1 mm，最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）分別為0.0125%～0.0500%和0.0500%～0.1000%，5種植物提取物均可作為單獨(dú)的防霉劑使用，以藤茶提取物的抑制效果最好。復(fù)合防霉劑預(yù)測模擬方程為：Y=10.34A+10.06B+7.18C+8126.84D-10096.90E+11.97AB+12.18AC-8236.89AD+10212.40AE+10.74BC-8245.77BD+10084.50BE-8149.38CD+10357.06CE+6202.14DE（其中Y代表抑菌圈直徑，A、B、C、D和E分別代表藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油在復(fù)合防霉劑中的比例），擬合后得到的復(fù)合防霉劑最優(yōu)配方比例為：55.00%藤茶提取物、22.12%茶葉提取物、22.56%桑葉提取物、0.10%陳皮精油和0.21%丁香精油;復(fù)合防霉劑的防霉效果明顯優(yōu)于單一防霉劑，25個(gè)組合對(duì)黃曲霉的抑菌圈直徑在11.30～13.90 mm;稻谷表面噴灑最優(yōu)復(fù)合防霉劑后的安全貯藏時(shí)間可延長60～120 d?！窘Y(jié)論】由藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油等5種植物提取物組成的復(fù)合型稻谷防霉劑可抑制稻谷中微生物的繁殖，延長稻谷安全貯藏時(shí)間。

關(guān)鍵詞： 響應(yīng)面法;南方稻谷;防霉劑;配方優(yōu)化;驗(yàn)證

中圖分類號(hào)： S511.093? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）10-2690-08

Abstract：【Objective】The mould inhibitor formula for southern rice during storage was selected so as to provide technical support for the rice storage. 【Method】 The main rice mold contaminants were determined from two indica rice varieties stored for 3-6 months and 12-24 months. The total mold counts and the mildew proof effects of five plant extracts， including leaf extracts from ampelopsis， tea，and mulberry， essential oils of orange peel and clove， on Aspergillus flavus growth in stored rice were analyzed. Finally， inhibition zone diameters achieved against A. flavus was used as an index and combined with the Design Expert response surface method to obtain an optimized compound formulation of the plant extracts. 【Result】 The microbial presence in grain stored for 3-6 months was 1.1×103-9.2×103 CFU/g，while that in rice stored for 12-24 months was significantly greater at 8.1×103-2.2×105 CFU/g. Aspergillus and Penicillium were the main contaminating molds in southern rice，followed by Mucor and Fusarium. The inhibition zone diameter of A. flavus is between 8.4-11.1 mm，and the minimum inhibitory（%） and bactericidal concentrations were between 0.0125%-0.0500% and 0.0500%-0.1000%， respectively. All five plant extracts were effective as independent fungicides， the most effective of which was the leaf extract of ampelopsis . The prediction and simulation equation of mold inhibitor is as follows：Y=10.34A+10.06B+7.18C+8126.84D-10096.90E+11.97AB+12.18AC-8236.89AD+10212.4AE+10.74BC-8245.77BD+10084.50BE-8149.38CD+10357.06CE+6202.14DE. Where Y represents the diameter of the antifungal zone and A，B，C，D and E represent the proportions of extracts of ampelopsis， tea， mulberry， orange peel and clove in the mold inhibitor formulation respectively. The optimal proportion of leaf extracts and essential oils was as follows： 55.00% ampelopsis，22.12% tea，22.56% mulberry，0.10% orange peel and 0.21% clove. The inhibition of mildew development by the compound fungicidal formula was clearly more effective than individual extracts or essential oils and the inhibition zone diameter of 25 combinations against A. flavus was between 11.30-13.90 mm. The safe grain storage time after spraying with the best compound fungicide on rice could be extended for about 60-120 d. 【Conclusion】 The compound fungicide composed of five natural plant extracts described above could inhibit the reproduction of microorganisms and extend the safe storage period for grain.

Key words：response surface method; southern rice; mould inhibitor; formula optimization; verification

Foundation item：Protection Project of Species and Varieties Resources of Ministry of Agriculture and Rural Affairs（111821301354052029）;Guangdong Science and Technology? Project（2020B121201008）;Guangdong Modern Agricultural Induetry System Innovation and Extension Project（2021KJ101）

0 引言

【研究意義】水稻是一種重要的糧食作物，稻谷是我國主要儲(chǔ)備糧種。2019年，我國稻谷總產(chǎn)量為2.10億t，約占全國糧食總產(chǎn)量（6.64億t）的31.6%，其中湖南、湖北、安徽等南方地區(qū)13個(gè)省份的稻谷總產(chǎn)量約1.7億t，占全國總產(chǎn)量的81.0%（中華人民共和國國家統(tǒng)計(jì)局，2019）。南方稻谷尤其是早稻收獲季節(jié)正值南方雨季，環(huán)境溫度高、濕度大，稻谷水分含量高達(dá)25%～35%，在高溫高濕的環(huán)境中儲(chǔ)藏，易發(fā)生微生物特別是霉菌活動(dòng)而發(fā)生霉變，若不采取必要的防霉處理，品質(zhì)快速劣變，從而導(dǎo)致霉變稻谷中的大米無法食用（Shafiekhani et al.，2018;周顯青等，2020），即使稻谷經(jīng)干燥處理，也由于環(huán)境濕度大，易吸收外界水分從而導(dǎo)致稻谷霉變（Zhou et al.，2003）。因此，稻谷防霉處理是南方稻谷儲(chǔ)藏及糧食安全生產(chǎn)中最重要的環(huán)節(jié)之一。【前人研究進(jìn)展】從20世紀(jì)90年代開始，大量科研工作者圍繞稻谷或大米等糧食防霉劑的篩選、配方組成和效果評(píng)價(jià)進(jìn)行了系列試驗(yàn)。Paster等（1995）報(bào)道牛至精油和百里香精油可抑制黃曲霉、黑曲霉和赫曲霉的生長，利用其可作為糧食貯藏中的防霉劑使用。陳偉暢（2008）使用生姜水提取物、海藻糖和維生素C復(fù)合對(duì)大米進(jìn)行保鮮試驗(yàn)，結(jié)果表明，生姜水提取物能替代傳統(tǒng)化學(xué)防霉劑雙乙酸鈉。張旭等（2008）將檸檬、艾葉、肉桂、丁香、香茅和芥末等6種植物提取的精油對(duì)高水分含量（17.0%）大米進(jìn)行防霉保鮮效果試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同植物精油均有一定的防霉作用，但該種方法可能對(duì)大米的風(fēng)味產(chǎn)生影響。盛強(qiáng)等（2010）采用食品級(jí)防霉劑雙乙酸鈉與山梨酸鉀復(fù)配對(duì)高水分（15.6%～17.6%）稻谷進(jìn)行保鮮效果試驗(yàn)，結(jié)果表明，防霉劑添加量越大，防霉效果越好，安全儲(chǔ)藏期也越長。徐鎧煜等（2010）研究食品級(jí)防霉劑雙乙酸鈉、山梨酸鉀和丙酸鈣兩兩復(fù)配后對(duì)引起糧食霉變的10種主要有害霉菌的抑制作用，結(jié)果表明，復(fù)配防霉劑相比單一防霉劑具有明顯的防霉增效作用。戰(zhàn)鑫（2020）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蛇床子、山蒼子和補(bǔ)骨脂3種天然植物提取物的復(fù)合比例為1∶1∶1時(shí)，復(fù)合提取物對(duì)貯藏稻谷的防霉效果突出，且三者存在較強(qiáng)的協(xié)同作用。【本研究切入點(diǎn)】上述前人研究結(jié)果均表明，復(fù)合防霉劑相比單一防霉劑具有明顯的防霉增效作用，且天然植物防霉劑在安全性方面也較化學(xué)防霉劑具有明顯優(yōu)勢。復(fù)合防霉劑研究的關(guān)鍵是選擇合適的單一防霉劑和相應(yīng)的配方組成。本研究以稻谷中主要污染菌的分離與鑒定作為切入點(diǎn)，在證實(shí)曲霉屬為稻谷中主要污染菌屬的基礎(chǔ)上，選擇近年來國內(nèi)外研究較多的對(duì)微生物具有普適抑制和殺滅作用的藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油等5種植物提取物（熊皓平等，2004;沈維治等，2013;左龍亞，2018;顧瑩婕等，2019;王丹等，2020）對(duì)普通存在于曲霉屬中的黃曲霉進(jìn)行抑制和殺滅效果比較，然后對(duì)5種植物提取物構(gòu)成的配方進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，目前鮮見相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用Design-Expert響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合防霉劑中藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油5種成分的構(gòu)成比例進(jìn)行研究，通過混料設(shè)計(jì)組合中抑菌圈實(shí)測值與預(yù)期值的比較等系列試驗(yàn)獲得最佳配方，并在實(shí)踐中進(jìn)行效果驗(yàn)證，以期為南方稻谷貯藏提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

稻谷樣品采自廣東、湖南和廣西等我國南部省份的國有和私營糧庫，新糧為當(dāng)年收儲(chǔ)、入庫貯藏3～6個(gè)月的秈稻稻谷，陳糧為入庫貯藏12～24個(gè)月的秈稻稻谷。藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油均為本實(shí)驗(yàn)室自制，其中藤茶提取物中總黃酮含量≥50%、茶葉提取物中總多酚含量≥50%、桑葉提取物中總黃酮含量≥20%、陳皮精油中精油含量≥90%、丁香精油中精油含量≥90%;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）購自廣東省微生物研究所。

主要儀器設(shè)備：LDZX-50FBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）;SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;LRH-150B生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）;MJPS-150型霉菌培養(yǎng)箱、HWS-400恒溫恒濕箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;Milipore超純水凈化系統(tǒng)（美國Milipore超純水系統(tǒng)）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 稻谷樣品采集 采用五點(diǎn)取樣法，將糧倉東南角、東北角、西南角、西北角及中央作為取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)分別在距糧堆表層0.5 m處取樣，每倉15個(gè)取樣點(diǎn)，每點(diǎn)取樣0.25 kg。樣品放置在無菌采樣袋中，于4 ℃保存。試驗(yàn)前將同一糧倉中所取的15個(gè)樣品等量混合，測定稻谷中的帶菌總量，同時(shí)對(duì)稻谷中主要污染菌屬進(jìn)行分離和鑒定（劉慧等，2020）。

1. 2. 2 稻谷中帶菌總量確定 參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)》的方法測定稻谷中的菌落總數(shù)。

1. 2. 3 稻谷中主要污染菌屬的分離與鑒定 取3份同一糧倉中的混合稻谷置于滅菌平板中，加入適量無菌水，28 ℃培養(yǎng);待其長出霉菌后，挑取形態(tài)各異的菌株，劃線接種到PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng);之后反復(fù)進(jìn)行平板劃線，直至得到形態(tài)相同的單菌落。獲得單菌落后，采用形態(tài)特征與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行菌屬鑒定（都立輝等，2016;Rico-Munoz et al.，2019;李娜等，2020）。對(duì)試驗(yàn)獲得稻谷中主要污染菌屬中的主要菌種進(jìn)行單獨(dú)保留，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1. 2. 4 植物提取物對(duì)稻谷中黃曲霉的抑制效果比較 采用抑菌圈試驗(yàn)，參考李娜等（2020）的方法并修改。選擇1.2.3中獲得的曲霉屬中主要污染菌黃曲霉作為試驗(yàn)菌種并擴(kuò)繁。之后用無菌生理鹽水將其配制成106～107 CFU/mL的菌懸液，用無菌移液管向已滅菌、凝固的平板上加入0.l mL菌懸液，再用無菌三角刮鏟涂布均勻，制成含一定濃度的黃曲霉平板。然后將直徑為6 mm的已滅菌濾紙片分別浸于濃度為0.1%的5種植物提取物溶液（用95%乙醇溶解）中充分浸泡;將浸泡好的濾紙片于60 ℃恒溫箱中烘干，無菌操作貼在制備好的含一定濃度的黃曲霉平板上，培養(yǎng)皿背面標(biāo)記，每皿均勻分貼同種植物提取物溶液濾紙片3片，相應(yīng)乙醇溶劑空白對(duì)照濾紙片2片;將貼好濾紙片的平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取出測定抑菌圈直徑大小。

1. 2. 5 植物提取物對(duì)稻谷中黃曲霉的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）確定 參考李娜等（2020）的方法并修改。將各植物提取物用95%乙醇配成一定濃度，與瓊脂培養(yǎng)基按不同比例混合，制成不同濃度的植物提取物平板，再接種黃曲霉試驗(yàn)菌，28 ℃培養(yǎng)44～48 h，觀察生長情況。以能抑制黃曲霉生長的植物提取物最低濃度為該植物提取物的MIC。平板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察黃曲霉生長情況，以無黃曲霉菌生長的植物提取物最高濃度為該植物提取物的MBC。

1. 2. 6 復(fù)合防霉劑配方篩選 采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)進(jìn)行配方篩選。利用前期研究得到的復(fù)合防霉劑中5種植物提取物的用量范圍（藤茶提取物45.00%～55.00%，茶葉提取物和桑葉提取物均為20.00%～30.00%，陳皮精油和丁香精油均為0.10%～0.30%），根據(jù)Design-Expert 8.0中自帶的中心響應(yīng)面試驗(yàn)原則，組成25個(gè)模擬配方組合（運(yùn)行序列），以黃曲霉抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，進(jìn)行抑菌圈直徑的實(shí)測和預(yù)期比較;得到復(fù)合防霉劑中5種植物提取物的構(gòu)成比例與抑菌圈直徑之間的預(yù)測模型方程，同時(shí)通過校正與優(yōu)化，得到復(fù)合防霉劑中5種植物提取物的最佳配方組合。

1. 2. 7 稻谷防霉驗(yàn)證試驗(yàn) 按試驗(yàn)獲得的最佳防霉劑配方，配制一定量防霉劑，用95%乙醇溶液將其溶解成1.0%的防霉劑溶液，在廣東省從化市某糧食干燥廠進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)新鮮稻谷經(jīng)傳送帶送入干燥箱時(shí)，通過普通噴霧器將防霉劑溶液噴灑到稻谷表面（防霉劑的噴灑量為1 kg/t），經(jīng)干燥工藝后進(jìn)入貯藏倉庫。分別在0、60、180、240、360、480和720 d取樣分析稻谷表面微生物總量，以此驗(yàn)證最佳防霉劑對(duì)稻谷的防霉效果。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

所有分析測試均采用3次平行處理，每項(xiàng)測試設(shè)3次獨(dú)立重復(fù)。采用SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，同時(shí)應(yīng)用單因素方差進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)的組間差異采用S-N-K法，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2. 1 稻谷帶菌總量和主要污染菌

稻谷帶菌總量是衡量稻谷污染程度的重要指標(biāo)，帶菌總量多代表稻谷污染程度高，帶菌總量少則代表稻谷污染程度低。試驗(yàn)測定了15個(gè)新糧和21個(gè)陳糧樣品的帶菌總量，其中新糧樣品帶菌總量為1.1×103～9.2×103 CFU/g，陳糧樣品帶菌總量為8.1×103～2.2×105 CFU/g，陳糧樣品帶菌總量明顯高于新糧樣品，說明糧食貯藏過程中微生物仍在不斷生長繁殖。從表1可看出，盡管貯藏稻谷中的微生物污染菌屬組成復(fù)雜，但不同樣品中同一類型污染菌屬的檢出率基本一致;不論是新糧還是陳糧，曲霉屬（90.1%和91.3%）和青霉屬（均為83.5%）霉菌均為南方貯藏稻谷中的主要污染菌屬，其次是毛霉屬和鐮刀菌屬，而枝孢霉屬、交鏈孢霉屬和根霉屬存在較少。因此，對(duì)貯藏稻谷而言，控制其中微生物的關(guān)鍵是防止曲霉屬和青霉屬霉菌的快速繁殖，進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)時(shí)可用曲霉屬或青霉屬中的某一種具體菌種作為指示菌。

2. 2 5種植物提取物對(duì)稻谷中黃曲霉的抑制效果

根據(jù)藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油等5種植物提取物在乙醇溶液中的溶解情況，最終選用溶解狀態(tài)均為良好、濃度均為0.1%的植物提取物乙醇溶液對(duì)稻谷中最典型的污染菌屬（曲霉屬）中的黃曲霉進(jìn)行抑制試驗(yàn)。同時(shí)因?yàn)辄S曲霉為南方稻谷的主要污染菌屬普通存在于稻谷中，且容易產(chǎn)生被世界衛(wèi)生組織劃定為一類致癌物的黃曲霉毒素。結(jié)果（表2）表明，5種植物提取物對(duì)黃曲霉均有一定的抑制效果，均可作為單一的稻谷防霉劑進(jìn)行使用，但不同種類提取物對(duì)黃曲霉的抑制效果不同，其中藤茶提取物對(duì)黃曲霉的抑制效果最好，其抑菌圈直徑達(dá)11.1 mm，其次為桑葉提取物（10.5 mm）和茶葉提取物（10.4 mm）。從MIC和MBC同樣可看出，5種植物提取物中以藤茶提取物和茶葉提取物對(duì)黃曲霉的抑制和殺滅效果較好，其MIC和MBC均分別為0.0125%和0.0500%，而桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油的MIC和MBC均分別為0.0500%和0.1000%（表2）。

2. 3 復(fù)合防霉劑的配方篩選結(jié)果

2. 3. 1 混料試驗(yàn)組合 由表3可看出，運(yùn)行序列10中抑菌圈直徑實(shí)測值最大（13.90 mm），而抑菌圈直徑預(yù)期值最大的運(yùn)行序列為7（13.17 mm），兩者存在一定差異。其原因一是軟件本身可能存在設(shè)計(jì)問題，二是可能存在的試驗(yàn)誤差所致。5種植物提取物作為單獨(dú)的防霉劑使用時(shí)，對(duì)黃曲霉的抑菌圈直徑在8.4～11.1 mm（表2），若組合使用，25個(gè)組合對(duì)黃曲霉的抑菌圈直徑（實(shí)測值）在11.30～13.90 mm，顯示復(fù)配防霉劑具有明顯的增效作用。

2. 3. 2 預(yù)測模型方程及最優(yōu)組合 根據(jù)表3所得的模擬組合中抑菌圈直徑的實(shí)測值和Design-Expert 8.0給出的預(yù)期值，進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到抑菌圈直徑（Y）與各因素之間的擬合方程：Y=10.34A+10.06B+7.18C+8126.84D-10096.90E+11.97AB+12.18AC-8236.89AD+10212.40AE+10.74BC-8245.77BD+10084.50BE-8149.38CD+10357.06CE+6202.14DE（其中A、B、C、D、E分別代表藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油的比例）。通過對(duì)模型進(jìn)行方差分析（表4），發(fā)現(xiàn)二項(xiàng)式模型達(dá)P<0.01的極顯著水平，判定系數(shù)R2=0.9431。校正后的判定系數(shù)R2adj=0.9517，表明模型方程很好地?cái)M合抑菌圈直徑與各植物提取物在復(fù)合防霉劑最終配方中的比例關(guān)系。從各因素的交互作用差異性分析可看出，僅AC和BC的交互作用對(duì)黃曲霉抑菌圈直徑有顯著影響（P<0.05，下同），而其他提取物的交互作用無顯著影響（P>0.05），其原因可能是藤茶提取物與桑葉提取物、茶葉提取物與桑葉提取物之間所含的活性成分對(duì)黃曲霉的抑制作用具有非常強(qiáng)烈的互補(bǔ)增效作用。

最后，用Design-Expert 8.0的最優(yōu)化功能設(shè)定各組分的變化范圍，同時(shí)設(shè)定所期望的響應(yīng)值。運(yùn)行軟件后，從隨機(jī)組合開始進(jìn)行最陡爬坡預(yù)測，直到目標(biāo)響應(yīng)值。軟件給出達(dá)到或接近目標(biāo)響應(yīng)值時(shí)的5個(gè)組合，并提供預(yù)測值（表5和表6）。由表6可看出，要使抑菌圈直徑達(dá)最大預(yù)測結(jié)果（13.37 mm），稻谷防霉劑中藤茶提取物、茶葉提取物、桑葉提取物、陳皮精油和丁香精油5種原料的用量比例分別為55.00%、22.12%、22.56%、0.10%和0.21%。

2. 4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證通過Design-Expert響應(yīng)面法獲得的復(fù)合防霉劑最佳配方效果，進(jìn)行20 t稻谷效果驗(yàn)證試驗(yàn)。由表7可看出，試驗(yàn)初期（0～180 d）2個(gè)樣品表面微生物總量變化較小，貯藏240 d后兩者間有明顯差異，說明復(fù)合防霉劑的主要作用是抑制稻谷表面微生物繁殖，而非殺滅微生物。在貯藏過程中，未噴灑防霉劑的稻谷，180 d后其表面微生物總量與剛?cè)霂熨A藏（0 d）的稻谷表面微生物總量相比有顯著增加，720 d的稻谷表面微生物總量較240 d增加16.44倍，說明未經(jīng)防霉劑處理的稻谷在貯藏過程中微生物繁殖速度非?？?而經(jīng)過防霉劑處理的稻谷，240 d后稻谷表面微生物總量與入庫貯藏（0 d）的稻谷表面微生物總量才開始有顯著差異，說明噴灑防霉劑后的稻谷貯藏時(shí)間至少延長了60 d。結(jié)合360～720 d的微生物總量可看出，噴灑防霉劑后的稻谷安全貯藏時(shí)間延長了60～120 d。

3 討論

稻谷貯藏過程中，隨著貯藏時(shí)間的延長，微生物不斷繁殖，其結(jié)果顯示出陳糧樣品的帶菌總量明顯高于新糧樣品。隨著陳糧樣品帶菌總量的增加，各種微生物依靠其分泌的胞外酶不斷地將貯藏稻谷中淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)水解為可溶性低分子物質(zhì)，以此保證微生物自身生長發(fā)育和大量繁殖的營養(yǎng)需要，其結(jié)果反映在貯藏糧食上，便是霉變的發(fā)生和發(fā)展（周建新，2004）。在稻谷貯藏過程中，減少稻谷初始帶菌量或抑制微生物的繁殖速度是保障稻谷安全貯藏的關(guān)鍵，但由于稻谷生產(chǎn)環(huán)境為開放式，要減少初始帶菌量較難以實(shí)現(xiàn)，抑制微生物的繁殖速度則是比較可行的一種技術(shù)方案。

長期以來，主要使用單一組分的防霉劑以抑制貯藏稻谷中微生物的繁殖，如食品級(jí)的雙乙酸鈉、山梨酸和山梨酸鹽、丙酸鈣、苯甲酸和苯甲酸鹽等（盛強(qiáng)等，2010;馬永軒等，2012）。但單一組分組成的防霉劑無法對(duì)所有糧食微生物起到抑制作用，且不同區(qū)域尤其是南、北方稻谷在貯藏過程中的微生物菌系差別很大，影響稻谷的品質(zhì)情況也不相同（王啟陽等，2020），因此，單一組分的防霉劑在貯藏稻谷中具有明顯不足。復(fù)合型防霉劑是由多種具有協(xié)同效應(yīng)的單一防霉組分按一定比例復(fù)配而成，其增效和協(xié)同作用可克服單一組分防霉劑在防霉效應(yīng)上的局限性。本研究結(jié)果表明，5種植物提取物中對(duì)黃曲霉抑制效果最好的是藤茶提取物，其抑菌圈直徑為11.1 mm，最差的是丁香精油，抑菌圈直徑為8.4 mm，但5種植物提取物復(fù)配后抑制效果明顯增加，其對(duì)黃曲霉的抑菌圈直徑可達(dá)13.37 mm。因此，復(fù)合型防霉劑應(yīng)是稻谷貯藏過程中首選的技術(shù)方案。

隨著天然產(chǎn)物研究的縱深發(fā)展，天然產(chǎn)物中有不少活性成分兼具保健和防霉作用，從天然產(chǎn)物中篩選相應(yīng)的活性成分復(fù)配成稻谷防霉劑更是引起了大量糧食貯藏科研工作者的注意（智亞楠等，2018;羅澤萍等，2019）。但由于微生物的多樣性，引起糧食霉變中的微生物又有其特殊性，且天然產(chǎn)物活性成分的種類很多，選擇何種天然產(chǎn)物作為復(fù)合型防霉劑的組成又是其中的一個(gè)關(guān)鍵。本研究過程中，選擇藤茶、茶葉和桑葉提取物，主要是因?yàn)槠渲饕钚猿煞址謩e為藤茶黃酮（二氫楊梅素）、茶多酚（兒茶素）和桑葉黃酮（蕓香甙、槲皮素、異槲皮素及槲皮素-3-葡萄糖甙等），均含有基本骨架為C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的2-苯基苯并吡喃酮天然化合物及其衍生物，此類化合物則是對(duì)稻谷中黃曲霉具有明顯的抑制作用（尚小飛，2019）;選擇陳皮精油和丁香精油作為復(fù)合型防霉劑的原料，主要是因?yàn)榫椭泻写罅康妮葡╊?、醛類、酯類和醇類等組成復(fù)雜的小分子類物質(zhì)，脂溶性強(qiáng)，容易滲入微生物脂質(zhì)膜從而抑制微生物的繁殖代謝（高以宸，2020;張慶霞，2020）。

選擇單一的防霉組分后，如何按一定的配比組成復(fù)合型防霉劑也是研究中的重點(diǎn)內(nèi)容，不同的配比最終決定配方的協(xié)同效應(yīng)大小，這是一種典型的混料試驗(yàn)。目前常用的混料試驗(yàn)方法有很多，如單因素輪換法、優(yōu)選法、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)、旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)及D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)等，難以區(qū)分哪種方法具有決定性優(yōu)勢，但采用Design-Expert響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化，在利用前期研究得到的復(fù)合防霉劑中各個(gè)組分大致的用量范圍基礎(chǔ)上，根據(jù)軟件中自帶的中心響應(yīng)面試驗(yàn)原則，通過模擬和實(shí)測的比較、校正與優(yōu)化，最后可快速得到最佳配方組合，相比其他方法，試驗(yàn)次數(shù)較少，較容易得到具體的最佳配方。但最佳配方是否合理，能否達(dá)到預(yù)期目的的關(guān)鍵是試驗(yàn)過程中選擇的考察指標(biāo)是否具有代表性。本研究選擇配方組合對(duì)黃曲霉的抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，但黃曲霉僅是貯藏稻谷中的一種污染菌，盡管普通存在于貯藏稻谷中，但也不能完全代表所有污染菌的抑制狀況，因此這是本試驗(yàn)中的一個(gè)明顯不足。為獲得理想準(zhǔn)確的配方，下一步可選擇其他的污染菌如曲霉屬中的黑曲霉作為考察指標(biāo)進(jìn)行類似試驗(yàn)，以此校正最終配方，獲取最佳防霉效果。此外，在稻谷防霉應(yīng)用效果方面，盛強(qiáng)等（2010）采用雙乙酸鈉與山梨酸鉀復(fù)配制成復(fù)合型防霉劑，在實(shí)驗(yàn)室條件下可使稻谷的安全貯藏時(shí)間延長90 d，而本研究所得的配方產(chǎn)品在大規(guī)模實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用過程中，可使稻谷安全貯藏時(shí)間延長60～120 d，表現(xiàn)出較好的實(shí)際應(yīng)用效果。

4 結(jié)論

利用5種植物提取物配制復(fù)合型稻谷防霉劑的最優(yōu)用量比例為：55.00%藤茶提取物、22.12%茶葉提取物、22.56%桑葉提取物、0.10%陳皮精油和0.21%丁香精油。復(fù)合型稻谷防霉劑可抑制稻谷中微生物的繁殖，延長稻谷安全貯藏時(shí)間60～120 d。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）