中華鱉投放密度對稻鱉共生田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

陳靜 何吉祥 吳本麗 黃龍 張燁

摘要：【目的】明確稻鱉共生模式下稻田土壤微生物多樣性及菌群結(jié)構(gòu)組成的變化特征，為推廣稻鱉共生模式及開展稻田土壤微生物功能研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā克疽圃?5 d后投放中華鱉，于8月10日、9月19日和10月10日采用五點(diǎn)法分別在水稻根部周圍和鱉池水底采集0～5 cm表層土，應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序分析稻田表層土壤和鱉池底泥的菌群結(jié)構(gòu)特征及其多樣性，并以冗余分析（RDA）識別稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵環(huán)境因子?！窘Y(jié)果】放養(yǎng)中華鱉后稻鱉共生田土壤的理化性質(zhì)均發(fā)生明顯變化。從24份樣品中測序獲得145239個OTUs，涵蓋的菌群涉及到74門184綱294目301科373屬。各樣品均具有較高的豐度和多樣性，Chao1指數(shù)范圍為7817.78～17453.39，Shannon指數(shù)范圍為8.64～11.29，且中華鱉投放密度低的稻鱉共生田土壤菌群多樣性相對較高。在稻田表層土壤和鱉池底泥菌群結(jié)構(gòu)中，相對豐度大于1.00%的門共有10個，分別是變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）、Ignavibacteriae、螺旋體門（Spirochaetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia），以變形菌門的相對豐度最高，達(dá)28.96%～64.76%;豐度大于1.00%的屬有16個，相對豐度排名前10的屬包括f_Anaerolineaceae、地桿菌屬（Geobacter）、厭氧粘細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）、f_Acidobacteriaceae_ [Subgroup_1]、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Sideroxydans、c_SBR2076、f_Nitrosomonadaceae、c_Bacteroidetes_vadinHA17和f_FW13。RDA分析結(jié)果表明，與稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)分布極顯著（P<0.01）相關(guān)的環(huán)境因子有pH、總氮（TN）含量和有機(jī)質(zhì)（OM）含量，其中pH對稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)分布影響最大?！窘Y(jié)論】稻鱉共生模式能促進(jìn)稻田土壤中氮、磷、鉀的累積，有效提高土壤養(yǎng)分，且中華鱉投放密度低的稻田土壤菌群多樣性相對較高。pH、TN含量和OM含量對稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)的變化產(chǎn)生極顯著影響，因此在實際生產(chǎn)中，中華鱉投放密度的確定除了要結(jié)合水稻和中華鱉的生產(chǎn)性能外，還應(yīng)考慮稻鱉共生模式中飼料化肥的環(huán)境釋放特點(diǎn)、營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)特征及微生物結(jié)構(gòu)組成等。

關(guān)鍵詞：稻鱉共生;稻田土壤;群落結(jié)構(gòu);多樣性;高通量測序

中圖分類號：S154.37? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2650-12

Abstract：【Objective】To clarify the variation characteristics of soil microbial diversity and bacterial community structure under rice-turtle symbiotic model， and to provide theoretical basis for the promotion of rice-turtle intergrowth model and the study of soil microbial function in rice field.【Method】Chinese soft-shelled turtles were placed 25 d after the rice was transplanted. On August 10， September 19， and October 10， the five-point method was used to collect 0-5 cm topsoil around the root of rice and the bottom of turtle pond， respectively. Illumina MiSeq high-throughput sequencing was used to analyze the characteristics and diversity of bacteria in soil and the bottom mud of the Chinese soft-shelled turtle pond， and redundancy analysis（RDA） was used to identify the key environmental factors affecting the structural changes of soil bacteria in rice-turtle symbiotic field. 【Result】The results showed that the physical and chemical properties of soil in rice-turtle symbiotic field changed greatly after putting Chinese soft-shelled turtle. 145239 OTUs were obtained from 24 samples， covering 74 phyla， 184 classes， 294 orders， 301 families and 373 genera. Each sample had high richness and diversity， with Chao1 index range of 7817.78-17453.39， and Shannon index range of 8.64-11.29. Moreover， the diversity of soil microbial community in rice-turtle symbiotic field with low stocking density was relatively high. There were 10 phyla with relative abundance greater than 1.00% in the soil of rice-turtle symbiotic field and bottom mud of turtle pond. They were Proteobacteria， Chloroflexi， Acidobacteria， Bacteroidetes， Nitrospirae， Firmicutes， Ignavibacteriae， Spirochaetes， Gemmatimonadetes and Verrucomicrobia， respectively. The relative abundance of Proteobacteria was the highest， reaching 28.96%-64.76%; there were 16 genera with abundance greater than 1.00%. The top 10 genera with relative abundance included f_Anaerolineaceae， Geobacter， Anaeromyxobacter， f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]， Stenotrophomonas， Sideroxydans， c_SBR2076， f_Nitrosomonadaceae， c_Bacteroidetes_vadinHA17 and f_FW13. The results of RDA analysis showed that pH， total nitrogen（TN） content and organic matter（OM） content were extremely correlated to the distribution of soil microbial community structure in the rice turtle symbiotic field （P<0.01）， and pH had the grea-test impact on the distribution of soil microbial community structure in the rice-turtle symbiotic field. 【Conclusion】The rice-turtle symbiosis model can promote the accumulation of nitrogen， phosphorus， and potassium in the paddy soil， and effectively improve the soil nutrients， and the soil microbial diversity of the paddy field with low stocking density of the Chinese soft-shelled turtle is relatively high. The pH， TN content and OM content have extremely significant indigenous effects on the changes of soil microbial community structure in the rice-turtle symbiotic field. Therefore， in the actual production， the determination of the feeding density of turtle should not only combine the production performance of rice and turtle， but also consider the environmental release of feed and fertilizer， nutrient cycling characteristics and microbial structure in the symbiotic mode of rice and turtle.

Key words： rice-turtle intergrowth; paddy soil; community structure; diversity; high-throughput sequencing

Foundation item：National Key Research and Development Program of China（2018YFD0300904-4）; Chief Expert Office of Hefei Agricultural Industry （202107）; Innovative Team Building Special Project of Anhui Academy of Agricultural Sciences（2021YL028）

0 引言

【研究意義】水稻—土壤及其生態(tài)系統(tǒng)是環(huán)境友好、生態(tài)健康、可持續(xù)利用的人工濕地生態(tài)系統(tǒng)（曹志洪等，2006），稻田綜合種養(yǎng)是一種綠色農(nóng)業(yè)種養(yǎng)模式，既能充分利用有限的土地資源和水資源，又能保護(hù)和改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，是促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展和確保糧食安全的有效途徑（Pretty，2008;王昂等，2019）。隨著農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展理念的提出，我國稻田養(yǎng)殖得到快速發(fā)展，2019年我國稻田養(yǎng)殖水產(chǎn)品面積達(dá)231.75萬ha，年產(chǎn)出水產(chǎn)品達(dá)291.33萬t（農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局等，2020），其中稻鱉共生（稻田養(yǎng)殖甲魚）是稻漁綜合種養(yǎng)的一種重要模式。土壤微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成和分解，直接或間接影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化及土壤肥力的提高（Win-ding et al.，2005;朱永官等，2017;張晟等，2019）。因此，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)已逐漸從地上部分的農(nóng)藝性狀分析擴(kuò)展到地下部的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能研究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】稻田養(yǎng)殖的快速發(fā)展，促使稻田養(yǎng)殖技術(shù)得到顯著提高。佀國涵等（2016）研究認(rèn)為，稻蝦共作模式能提高稻田土壤微生物的活性及其群落功能多樣性;趙翔剛等（2017）研究表明，稻田養(yǎng)殖沙塘鱧后其水體及底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)與常規(guī)稻田存在明顯差異;王蓉等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，稻蝦共作模式對稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落無顯著影響，但顯著增加氨氧化細(xì)菌的豐度并影響其群落結(jié)構(gòu)組成;張軍等（2020）研究認(rèn)為，稻鴨共作通過改變土壤理化性質(zhì)來影響細(xì)菌群落的空間分布。目前關(guān)于稻鱉共生的研究主要集中在生產(chǎn)技術(shù)及經(jīng)濟(jì)效益等方面（劉才高等，2015;張靜等，2016;李竣等，2019;張開禮，2019）。周愛珠等（2014）研究認(rèn)為，運(yùn)用生態(tài)經(jīng)濟(jì)學(xué)原理、系統(tǒng)工程方法和健康消費(fèi)理念建立稻鱉共生基地，可探索出一條稻田養(yǎng)殖和穩(wěn)糧增收的有效途徑，在保障糧食安全的同時促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效及農(nóng)民增收。蔡炳祥等（2016）根據(jù)浙江省德清縣單季晚稻主要病蟲害發(fā)生特點(diǎn)，總結(jié)出稻鱉共生技術(shù)中的綠色稻米病蟲害控制關(guān)鍵措施，能有效控制病蟲害發(fā)生及減少農(nóng)藥使用量。宋光同等（2017）研究表明，在稻鱉共作模式中水稻品種宜選擇粳稻，而幼鱉放養(yǎng)密度以控制在3000只/ha左右為宜。常培恩等（2019）研究證實，稻鱉共作模式有利于增加水稻的有效穗數(shù)和實粒數(shù)，顯著提升再生稻產(chǎn)量，提高出糙率、精米率和整精米率，改善稻米加工品質(zhì)，同時能降低堊白率和堊白度，提升稻米的外觀品質(zhì)。楊飛翔等（2019）研究表明，稻鱉共作模式下水稻田土壤的全氮和全磷含量呈“峰”形變化，有機(jī)質(zhì)含量長期保持較高水平，通過提高單位面積有效穗數(shù)和穗粒數(shù)而增加水稻產(chǎn)量，具體表現(xiàn)為頭季稻平均增產(chǎn)9.75%，再生稻平均增產(chǎn)10.05%。佟德利等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，全生育期內(nèi)稻蟹種養(yǎng)生產(chǎn)田的氨化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、嫌氣性纖維素分解菌、好氣性自生固氮菌、亞硝酸細(xì)菌分別是常規(guī)稻田的9.28、6.44、5.22、3.65和3.00倍，即稻蟹種養(yǎng)生產(chǎn)田主要微生物種類增加，改變了微生物多樣性格局，尤其是細(xì)菌多樣性指數(shù)峰值出現(xiàn)的時間提早20 d?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】稻田綜合種養(yǎng)正逐步發(fā)展成為具有“穩(wěn)糧、促漁、提質(zhì)、增效、生態(tài)”等多方面功能的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)新模式，有關(guān)水稻與動物共育影響稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究已有報道，但針對稻鱉共生模式下水稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分析中華鱉投放密度對稻鱉共生田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，明確稻鱉共生模式下稻田土壤微生物多樣性及菌群結(jié)構(gòu)組成的變化特征，以期為推廣稻鱉共生模式及開展稻田土壤微生物功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 田間處理

在安徽省太湖縣徐橋鎮(zhèn)桃鋪村稻鱉生態(tài)種養(yǎng)基地（東經(jīng)116°36′，北緯30°29′）開展稻鱉共生試驗，該區(qū)域?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，四季分明，夏季高溫多雨，冬季溫和少雨，常年平均氣溫16.4 ℃，年均降水量1368.4 mm，無霜期249 d。試驗共設(shè)4塊試驗稻田（P1、P2、P3和P4），每塊試驗田的稻鱉共生工程如圖1所示。每塊試驗稻田總面積約1600.0 m2（長47.0 m，寬34.0 m），其中，水稻種植面積為1360.0 m2（每塊試驗稻田內(nèi)的水稻田編號分別為Pa1、Pa2、Pa3和Pa4），鱉池面積為108.0 m2（長12.0 m，寬9.0 m，深1.0 m）（每塊試驗稻田內(nèi)的鱉池編號分別為Po1、Po2、Po3和Po4），與鱉池長邊垂直方向設(shè)長21.0 m、寬1.0 m、深0.6 m的水溝，水稻移栽25 d后投放中華鱉，中華鱉規(guī)格為0.35～0.40 kg/只，實際投放數(shù)量分別為260、230、200和170只，投放的中華鱉均為雄性。水稻品種為秈型兩系雜交水稻——隆兩優(yōu)華占，于6月26日移栽，行株距為25 cm×15 cm，10月11日收割。水稻移栽前施用復(fù)合肥1125 kg/ha、尿素150 kg/ha，整個水稻生長期間不施用任何化肥及農(nóng)藥，每天按中華鱉體重的3%～5%投喂中華鱉飼料（湖州?；始佐~配合飼料）。

1. 2 樣品采集與處理

于8月10日、9月19日和10月10日，采用五點(diǎn)法分別在水稻根部周圍和鱉池水底采集0～5 cm表層土，具體稻田表層土壤樣品和鱉池底泥樣品如表1所示。樣品剔除根茬、雜草及石塊等雜物后充分混勻并分成2份。一份用于土壤理化性質(zhì)測定;另一份裝入干凈塑料封口袋，以干冰運(yùn)回實驗室后存放于-80 ℃冰箱，用于細(xì)菌多樣性分析。

1. 3 Illumina MiSeq高通量測序分析

采用TIANamp Soil DNA Kit試劑盒（TIANGEN，DP 336）提取基因組DNA，提取的DNA以1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度、純度及完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆?。在PCR儀（ABIGeneAmp?9700）上使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTT T-3'）對16S rRNA序列V4～V5高變區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Stubner，2002;Lundberg et al.，2013），PCR反應(yīng)體系50.0 μL：DNA模板10 ng，5×Buffer 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，引物515F和907R（5 μmol/L）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃變性1 min;98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行27個循環(huán);72 ℃延伸5 min。參照Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation構(gòu)建文庫，利用NanoDorp和Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫濃度及其片段大小，檢測合格后委托廣州賽哲生物科技有限公司在Illumina MiSeq平臺上完成高通量測序分析。

1. 4 數(shù)據(jù)處理分析

去除測序所得序列中低質(zhì)量堿基和接頭污染序列，數(shù)據(jù)過濾后得到優(yōu)質(zhì)序列（Bokulich et al.，2013）;采用UCHIME v4.2鑒定并去除嵌合體（Edgar et al.，2011;李忠奎等，2019），得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。將相似度大于97%的序列歸為一類OTU，然后將OTU比對到相關(guān)數(shù)據(jù)庫中各物種相應(yīng)的序列進(jìn)行物種識別;利用QIIME 1.8.0進(jìn)行Alpha多樣性分析等（Adler et al.，2013），并以Canoco 4.5進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 稻鱉共生田土壤的理化性質(zhì)

于稻田中投放不同密度的中華鱉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稻鱉共生田土壤的理化性質(zhì)均發(fā)生明顯變化（表2）。土壤pH在P1試驗田和P2試驗田間無顯著差異（P>0.05，下同），但有一定程度的提高;總氮（TN）、總磷（TP）和全鉀（TK）含量在P3試驗田和P4試驗田也均呈上升趨勢;有機(jī)質(zhì)（OM）含量在P1試驗田、P2試驗田和P4試驗田有一定程度的下降趨勢，且在P1試驗田的差異達(dá)顯著水平（P<0.05，下同）;陽離子交換量（CEC）在4塊試驗田均呈下降趨勢，其差異均達(dá)顯著水平。

2. 2 稻鱉共生田土壤菌群豐富度及其多樣性

從24份樣品中測序獲得7580378條Reads，經(jīng)雙端Reads拼接及過濾后共獲得5303353條Effective Tags。按97%的相似度進(jìn)一步歸類，共產(chǎn)生145239個OTUs，每份樣品的OTU數(shù)量介于4465～7466個。將OTU進(jìn)行門、綱、目、科及屬水平分類，除部分分類地位不明確的菌群外，共鑒定出74門184綱294目301科373屬（表3）。除9月的P1試驗田和P2試驗田外，同一時期同塊試驗田的OTU數(shù)量均表現(xiàn)為稻田表層土壤高于鱉池底泥;在3個采樣時期的樣品中，OTU數(shù)量均表現(xiàn)為10月>8月>9月。

Alpha多樣性分析結(jié)果（表3）顯示，不同采樣點(diǎn)的多樣性指數(shù)變化與OTU具有相同的變化趨勢。24份樣品均具有較高的豐度和多樣性，Chao1指數(shù)范圍為7817.78～17453.39，Shannon指數(shù)范圍為8.64～11.29。稻鱉共生田土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)存在明顯的時空變化特征，除10月的P1試驗田和P2試驗田外，同一時期同塊試驗田菌群的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均表現(xiàn)為稻田表層土壤高于鱉池底泥。在投放不同密度的中華鱉稻田中，3個采樣時期的樣品菌群Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)平均值排序均表現(xiàn)為P4試驗田>P3試驗田>P2試驗田>P1試驗田。

2. 3 稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)特征

2. 3. 1 門分類水平下優(yōu)勢菌群的分布特征 如圖2所示，稻田表層土壤和鱉池底泥菌群在門分類水平上具有較高的多樣性。對于所有樣品而言，相對豐度大于1.00%的門共有10個，分別是變形菌門（Proteobacteria，28.96%～64.76%）、綠彎菌門（Chloroflexi，6.56%～26.05%）、酸桿菌門（Acidobacteria，3.67%～17.15%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，2.18%～33.54%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，0.53%～13.23%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.38%～5.26%）、Ignavibacteriae（0.23%～ 3.56%）、螺旋體門（Spirochaetes，0.45%～3.51%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，0.17%～2.51%）和疣微菌門（Verrucomicrobia，0.16%～3.85%），相對豐度之和達(dá)90.02%～96.26%。其中，變形菌門為最優(yōu)勢菌門，其次是綠彎菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和硝化螺旋菌門。

變形菌門的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈逐漸下降趨勢，且稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中其相對豐度排序為P2試驗田>P1試驗田>P4試驗田>P3試驗田。綠彎菌門的相對豐度與變形菌門恰好相反，隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈上升趨勢，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中其相對豐度排序為P3試驗田>P4試驗田>P1試驗田>P2試驗田。酸桿菌門在9月采集樣品中的相對豐度最高，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中其相對豐度排序為P1試驗田>P3試驗田>P4試驗田>P2試驗田。擬桿菌門的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移也呈上升趨勢，但稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中其相對豐度排序為P4試驗田>P3試驗田>P2試驗田>P1試驗田。硝化螺旋菌門的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移也呈下降趨勢，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中其相對豐度排序為P2試驗田>P4試驗田>P3試驗田>P1試驗田。

2. 3. 2 綱分類水平下優(yōu)勢菌群的分布特征 稻田表層土壤和鱉池底泥菌群組成在綱分類水平上相對豐度大于1.00%的共有19個，相對豐度排名前10的綱（圖3）包括δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，16.49%～46.55%）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria，6.20%～21.69%）、厭氧繩菌綱（Anaerolineae，3.83%～ 17.39%）、硝化螺旋菌綱（Nitrospira，0.52%～13.23%）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，1.16%～19.05%）、Bacteroi-detes_vadinHA17（0.53%～13.29%）、SBR2076（0.59%～6.92%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，0.67%～3.19%）、酸桿菌綱（Acidobacteria，0.21%～7.86%）和擬桿菌綱（Bacteroidia，0.10%～10.03%），相對豐度之和為66.07%～81.61%。其中，δ-變形菌綱、β-變形菌綱和厭氧繩菌綱的相對豐度較高，為主要優(yōu)勢菌綱。

δ-變形菌綱的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈下降趨勢，且稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P3試驗田>P2試驗田>P4試驗田>P1試驗田。β-變形菌綱在10月采集樣品中的相對豐度最高，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P2試驗田>P1試驗田>P4試驗田>P3試驗田。厭氧繩菌綱的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈上升趨勢，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P3試驗田>P4試驗田>P1試驗田>P2試驗田。硝化螺旋菌綱的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈下降趨勢，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P2試驗田>P4試驗田>P3試驗田>P1試驗田。γ-變形菌綱的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移也呈下降趨勢，且稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P1試驗田>P2試驗田>P4試驗田>P3試驗田。Bacteroidetes_vadinHA17的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈上升趨勢，且稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中其相對豐度排序為P4試驗田>P3試驗田>P2試驗田>P1試驗田。SBR2076在9月采集樣品中的相對豐度最高，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P1試驗田>P2試驗田>P4試驗田>P3試驗田。Alphaproteobacteria在9月采集樣品中的相對豐度最高，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P3試驗田>P1試驗田>P4試驗田>P2試驗田。

2. 3. 3 屬分類水平下優(yōu)勢菌群的分布特征 稻鱉共生田土壤和鱉池底泥菌群組成在屬分類水平上相對豐度大于1.00%的有16個，相對豐度排名前10的屬（圖4）包括f_Anaerolineaceae（3.33%～11.98%）、地桿菌屬（Geobacter，4.19%～22.69%）、厭氧粘細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter，1.36%～14.61%）、f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]（0.18%～7.50%）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas，0.11%～15.37%）、Sideroxydans （0.01%～8.19%）、c_SBR2076（0.30%～3.65%）、f_Nitrosomonadaceae（0.14%～3.78%）、c_Bacteroidetes_vadin HA17 （0.34%～8.78%）和f_FW13（0.10%～4.19%），相對豐度之和為25.18%～50.95%。

f_Anaerolineaceae的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈上升趨勢，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P4試驗田>P3試驗田>P2試驗田>P1試驗田。地桿菌屬的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈下降趨勢，且稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P3試驗田>P4試驗田>P2試驗田>P1試驗田。厭氧粘細(xì)菌屬的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈下降趨勢，且稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P4試驗田>P2試驗田>P1試驗田>P3試驗田。f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈上升趨勢，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P1試驗田>P3試驗田>P4試驗田>P2試驗田。寡養(yǎng)單胞菌屬在8月采集樣品中的相對豐度最高，且稻田表層土壤低于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P1試驗田>P2試驗田>P3試驗田>P4試驗田。Sideroxydans的相對豐度隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈上升趨勢，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P1試驗田>P2試驗田>P3試驗田>P4試驗田。c_SBR2076在9月采集樣品中的相對豐度最高，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P1試驗田>P2試驗田>P4試驗田>P3試驗田。f_Nitrosomonadaceae在9月采集樣品中的相對豐度也最高，且稻田表層土壤高于鱉池底泥，在稻鱉共生田中的相對豐度排序為P2試驗田>P3試驗田>P4試驗田>P1試驗田。

2. 4 菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的RDA分析結(jié)果

為了解稻鱉共生田土壤主要菌群與環(huán)境因子的相互關(guān)系，采用Canoco 4.5進(jìn)行RDA分析，選用相對豐度排名前10的門和屬，環(huán)境因子參數(shù)包括pH、TN含量、TP含量、TK含量、OM含量和CEC。在環(huán)境因子梯度分析中，特征值（F）越大，表明環(huán)境因子對菌群結(jié)構(gòu)影響越大，P越小則其相關(guān)性越顯著。由表4可知，稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)變化是不同環(huán)境因子變化的共同結(jié)果，與稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)分布極顯著（P<0.01）相關(guān)的環(huán)境因子有pH、TN含量和OM含量，其中pH對稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)分布影響最大。稻鱉共生田土壤優(yōu)勢菌群與環(huán)境因子的RDA分析結(jié)果（圖5）顯示，環(huán)境因子對稻鱉共生田土壤優(yōu)勢菌群的影響主要通過各環(huán)境因子的長度表征，而環(huán)境因子對優(yōu)勢菌群的影響程度通過夾角余弦值來反映。變形菌門及其門下的地桿菌屬、厭氧粘細(xì)菌屬和Sideroxydans與OM含量呈正相關(guān)，變形菌門受TK含量的影響較大，地桿菌屬和厭氧粘細(xì)菌屬受CEC的影響較大;綠彎菌門及其門下的f_Anaero-lineaceae和f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]、酸桿菌門、硝化螺旋菌門和Ignavibacteriae與pH呈負(fù)相關(guān)，與TN含量和OM含量呈正相關(guān);擬桿菌門與pH呈正相關(guān)，且受pH影響較大。

3 討論

3. 1 中華鱉投放密度對稻鱉共生田土壤菌群多樣性的影響

菌群多樣性是細(xì)菌譜系在生境中的重要生態(tài)影響因素（Cohan，2002），土壤微生物多樣性越高，越有利于維持土壤功能和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定（Cardinale et al.，2006）。與其他的稻田綜合種養(yǎng)模式（佀國涵等，2016;趙翔剛等，2017;羅衡等，2018）相比，本研究的稻鱉共生田土壤菌群多樣性指數(shù)（Chao1和Shannon）處于偏高水平，究其原因可能是應(yīng)用高通量測序分析獲得的菌群多樣性指數(shù)與以PCR-DGGE和T-RFLP分析得到的多樣性指數(shù)相比其數(shù)值更高（Kirchman et al.，2010;王歡等，2018），且表層土壤微生物多樣性高于下層（任萬軍等，2009），稻田土壤和鱉池底泥均采集0～5 cm表層，菌群結(jié)構(gòu)組成豐富。

稻田土壤微生物作為稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對外界環(huán)境的作用具有一定響應(yīng)。在稻鱉共生模式下，中華鱉通過爬行、掘穴及覓食等生物擾動改變營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供應(yīng)，進(jìn)而影響稻田表層土壤和水稻根系的微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性（羅衡等，2018）。本研究結(jié)果表明，中華鱉對稻鱉共生田土壤菌群產(chǎn)生一定程度的影響，且中華鱉投放密度對稻鱉共生田土壤菌群的影響表現(xiàn)為低投放密度的稻田土壤菌群多樣性相對較高，可能是中華鱉引入打破了原有稻田的平衡，短時間內(nèi)未能適應(yīng)，而導(dǎo)致菌群多樣性降低，中華鱉投放密度越大其干擾越大，但與佀國涵等（2016）、羅衡等（2018）的研究結(jié)論不一致，即稻漁共生模式的土壤菌群多樣性高于水稻單作模式。

3. 2 中華鱉投放密度對稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)組成的影響

稻田土壤在經(jīng)歷淹水和控水的干濕交替后，具有獨(dú)特的氧化還原條件和性質(zhì)，發(fā)生一些如硝化作用、反硝化作用、鐵氧化還原、產(chǎn)甲烷和甲烷氧化等過程（王娟，2015）。與其他土壤相比，具有更豐富的好氧、厭氧和兼性微生物（Jangid et al.，2008）。變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和硝化螺旋菌門是稻鱉共生田土壤的主要菌門，且以變形菌門的相對豐度最高，與Jangid等（2008）、羅衡等（2018）的研究結(jié)果相似。f_Anaerolineaceae、地桿菌屬、厭氧粘細(xì)菌屬、f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]和寡養(yǎng)單胞菌屬是稻鱉共生田的主要菌屬。不同菌門和菌屬的分布呈明顯時空特征。變形菌門及其門下的地桿菌屬和厭氧粘細(xì)菌屬及硝化螺旋菌門的相對豐度均隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈下降趨勢，究其原因可能是變形菌門和硝化螺旋菌門與OM含量呈正相關(guān)，在水稻生長旺季需要養(yǎng)分較多，加上水體流動帶走稻田土壤的一些養(yǎng)分，致使OM含量呈下降趨勢，導(dǎo)致變形菌門和硝化螺旋菌門隨時間推移而下降趨勢。綠彎菌門及其門下的f_Anaerolineaceae和f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]及擬桿菌門的相對豐度則隨中華鱉放養(yǎng)時間的推移呈上升趨勢。此外，變形菌門及其門下的地桿菌屬、厭氧粘細(xì)菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬及擬桿菌門的相對豐度表現(xiàn)為稻田表層土壤低于鱉池底泥，可能是這些菌群主要與CEC呈負(fù)相關(guān)，而稻田表層土壤的CEC大于鱉池底泥。綠彎菌門及其門下的f_Anaerolineaceae和f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]、酸桿菌門、硝化螺旋菌門及其門下的f_Nitrosomonadaceae的相對豐富表現(xiàn)為稻田表層土壤高于鱉池底泥。

不同中華鱉投放密度的稻鱉共生田土壤菌群分布也不同。本研究結(jié)果表明，稻鱉共生田土壤f_Nitrosomonadaceae的相對豐度隨中華鱉投放密度的增加而增加， f_Nitrosomonadaceae為亞硝化細(xì)菌，能將NH4+氧化成NO2-，是硝化作用的第一步和限速步驟，控制著硝化作用的整個過程，在土壤生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用（路璐和何艷，2018;Lu et al.，2018），可能是由于中華鱉的活動提高了土壤通透性和硝化作用，與佀國涵等（2019）的研究結(jié)果相似。擬桿菌門在稻鱉共生田土壤中的相對豐度也隨中華鱉投放密度的增加而增加，擬桿菌門利用碳能減少甲烷排放，具有減少溫室效應(yīng)的潛力。盛鋒（2019）在探究稻鴨共育時發(fā)現(xiàn)，鴨子的行走或覓食等行為促使土壤氧化還原狀況得到改善，進(jìn)而有利于降低CH4排放。

3. 3 稻鱉共生田土壤營養(yǎng)物質(zhì)分布對菌群結(jié)構(gòu)變化的影響

稻田土壤菌群結(jié)構(gòu)與土壤的理化性質(zhì)密切相關(guān)（袁紅朝等，2015;劉其根等，2018）。本研究中菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的RDA分析結(jié)果表明，pH、TN含量和OM含量對稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)的變化產(chǎn)生極顯著影響。pH是調(diào)控土壤菌群結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子，不僅直接影響菌群的生長情況，還能改變土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性（張宇亭，2017）。土壤含有的有機(jī)和無機(jī)營養(yǎng)物是微生物生長與繁殖的天然培養(yǎng)基（陳力力等，2018）。在稻鱉共生田土壤中，相對豐度最高的菌屬是f_Anaero-lineaceae，隸屬于綠彎菌門，為兼性厭氧生物，具有綠色色素，在光合作用中不產(chǎn)生氧氣，不能固氮，與pH呈負(fù)相關(guān)，與TN含量和OM含量呈正相關(guān)。其次是地桿菌屬和厭氧粘細(xì)菌屬，二者均為變形菌門δ-變形菌綱的革蘭氏陰性及兼性細(xì)菌，廣泛分布于厭氧沉積環(huán)境。RDA分析結(jié)果顯示，地桿菌屬和厭氧粘細(xì)菌屬與pH的相關(guān)系數(shù)分別為0.603（P=0.21）和-0.833（P=0.16），結(jié)合采樣點(diǎn)的土壤pH，發(fā)現(xiàn)并不在其最適生長的pH范圍內(nèi)（朱超等，2011）。f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]隸屬于酸桿菌門，是土壤中一類常見且重要的細(xì)菌類群，在植物殘體降解中發(fā)揮重要作用，酸桿菌門與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)（Lauber et al.，2008;王光華等，2016）。由于稻田土壤環(huán)境十分復(fù)雜，土壤理化因子與微生物各種作用途徑的相互關(guān)系及分子機(jī)理均有待進(jìn)一步探究。吳雪（2012）在研究稻魚共作時發(fā)現(xiàn)，隨著田魚投放密度的增加，飼料養(yǎng)分的流失也相應(yīng)增加，氮利用效率降低。在實際生產(chǎn)中，中華鱉投放密度的確定除了要結(jié)合水稻和中華鱉的生產(chǎn)性能外，還應(yīng)考慮稻鱉共生模式中飼料化肥的環(huán)境釋放特點(diǎn)、營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)特征及微生物結(jié)構(gòu)組成等。

4 結(jié)論

稻鱉共生模式能促進(jìn)稻田土壤中氮、磷、鉀的累積，有效提高土壤養(yǎng)分，且中華鱉投放密度低的稻田土壤菌群多樣性相對較高。pH、TN含量和OM含量對稻鱉共生田土壤菌群結(jié)構(gòu)的變化產(chǎn)生顯著影響，因此在實際生產(chǎn)中，中華鱉投放密度的確定除了要結(jié)合水稻和中華鱉的生產(chǎn)性能外，還應(yīng)考慮稻鱉共生模式中飼料化肥的環(huán)境釋放特點(diǎn)、營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)特征及微生物結(jié)構(gòu)組成等。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）