中度嗜鹽菌S61生防因子分析及其對馬鈴薯干腐病的防效

摘要：【目的】測定中度嗜鹽菌S61對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌活性及對干腐病的防效，為馬鈴薯干腐病的生物防治及綠色防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳詠碓从谇嗪２鞝柡果}湖的1株中度嗜鹽菌S61為材料，采用形態(tài)學(xué)、生理生化特征及分子生物學(xué)方法對菌株S61進行鑒定。通過對峙培養(yǎng)法和馬鈴薯活體試驗，進行菌株S61及其發(fā)酵液有機溶劑萃取物抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性測定及對儲藏期馬鈴薯安全性評價。采用平板透明圈法和排油圈法，分別測定菌株S61發(fā)酵液分泌抑菌蛋白和產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)的能力?！窘Y(jié)果】結(jié)合菌株S61的形態(tài)特征、生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果，將菌株S61鑒定為特氏鹽芽孢桿菌（Halobacillus trueperi）。其發(fā)酵液能產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，并能產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)。菌株S61及其有機溶劑萃取物對3株馬鈴薯干腐病病原菌（青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6）均有不同程度的抑菌活性，其中對青9A-4-13的抑菌活性最強，對峙培養(yǎng)7 d后的抑制率為55.67%。菌株S61發(fā)酵液不同濃度（1、5、10和20 mg/mL）正丁醇萃取物對青9A-4-13的抑菌活性最高，抑制率分別為61.50%、63.00%、64.00%和66.00%。菌株S61發(fā)酵液及其正丁醇萃取物對馬鈴薯儲藏安全。【結(jié)論】中度嗜鹽菌S61在體外和馬鈴薯活體上均對干腐病病原真菌具有抑制作用，其發(fā)酵產(chǎn)物的正丁醇萃取物活性最高，并存在生防因子，能產(chǎn)生一些具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，具有較好的馬鈴薯干腐病生物防治潛力。

關(guān)鍵詞： 中度嗜鹽菌;生防因子;馬鈴薯干腐病;防效;安全性評價

中圖分類號： S435.32;S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2619-13

Abstract：【Objective】The inhibitory activity and control effect of moderate halophilic bacteria S61 against pathogenic fungi of potato dry rot was determinedto provide a scientific basis for the biological control and green prevention and control of potato dry rot. 【Method】A moderately halophilic strain S61 from Qarhan Salt Lake in Qinghai was used as material and was was identified by morphology， physiological and biochemical characteristics and molecular biology methods. The inhibitory activity of strain S61 and its organic solvent extract from fermentation against potato dry rot pathogens and the safety assessment were determined by confrontation culture method and potato experiment in vivo. The capacity of producing lipopeptides and proteins of strain S61’s fermentation was determined by transparent circle and oil drain ring methods. 【Result】Combining the morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and phylogenetic tree analysis results， the strain S61 was identified as Halobacillus trueperi. Its fermentation could produce protease， amylase， cellulose， and lipopeptides. S61 and its organic solvent extract had different inhibitory activities against 3 potato dry rot pathogenic fungi （Qing 9A-4-13， Qing 9A-5-2 and 65B-2-6）. S61 had the highest inhibitory activity against pathogen Qing9A-4-13， with an inhibition rate 55.67% （7 d）. Its N-butyl alcohol extract at the different concentrations （1， 5， 10 and 20 mg/mL） had the highest inhibitory activity against pathogen Qing 9A-4-13， with inhibition rates 61.50%， 63.00%， 64.00%? and 66.00%， respectively. The strain S61 and its N-butyl alcohol extract were safe for potato in storage. 【Conclusion】The moderate halophilic bacterium S61 has inhibitory activity against potato dry rot pathogenic fungi both in vitro and in vivo. The N-butyl alcohol extract has the highest inhibitory activity. It has biocontrol factors and could produce metabolic products with anti-fungi activity. It proves that S61 has good biocontrol potential in potato dry rot.

Key words： moderate halophilic bacterium; biocontrol factor; potato dry rot; control effect; safety assessment

Foundation item： General Project of Qinghai Natural Science Foundation（2019-ZJ-914）; Major Science and Techno-logy Project of Qinghai（2019-NK-A1）; Special Funds for National Modern Agricultural Industrial Technology System （CARS-10）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期主要真菌性病害之一，由多種鐮刀菌（Fusarium spp.）的種或變種引起（Delaplace et al.，2008;李金花等，2011）。馬鈴薯干腐病對馬鈴薯貯藏期造成的產(chǎn)量損失最高可達60%（Bojanowski et al.，2013;雷婭紅等，2016;許苗等，2018）。采用化學(xué)防治手段對馬鈴薯進行防腐保鮮處理是當(dāng)前減少馬鈴薯腐爛損失的重要手段，但長期使用化學(xué)藥劑防治會造成菌株抗藥性、環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問題（Romualdo et al.，2010;王麗麗等，2016;Krüsemann et al.，2017;孫清華等，2019）。目前，多利用具有安全無毒、不污染環(huán)境和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點的生物防治手段進行植物病害防治（Gerbore et al.，2014;Krüsemann et al.，2017）。因此，生物防治尤其是利用微生物等天然資源及其產(chǎn)生的天然產(chǎn)物對馬鈴薯干腐病進行防治，對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，有關(guān)馬鈴薯干腐病拮抗菌的研究主要集中在拮抗菌的篩選及活性物質(zhì)的抑菌活性研究方面。馬鈴薯干腐病拮抗菌篩選結(jié)果顯示，生防菌大部分為木霉菌（Trichoderma spp.）（崔巖，2013）、芽孢桿菌（Bacillus spp.）、放線菌（Actinomyces spp.）（孫現(xiàn)超等，2013;牛世全等，2017）和假單胞菌（Pseudomonas spp.）（Ramlawi et al.，2021）。王愛軍（2013）研究發(fā)現(xiàn)，萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）能同時抑制馬鈴薯干腐病菌接骨木鐮刀菌（F. sambucinum）和茄病鐮刀菌（F. solani），并采用AFLP技術(shù)對其遺傳多樣性進行了研究;賈鵬莉等（2020）研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）的正丁醇萃取物對馬鈴薯干腐病病原菌尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的抑菌活性高達80.07%，同時該拮抗菌能產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶及脂肽類物質(zhì);胡英杰等（2021）通過生長速率法測定發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）的正丁醇萃取物對馬鈴薯干腐病病原菌的抑制率高達78.57%;賈鵬莉和沈碩（2021）通過平板對峙法及穩(wěn)定性評價發(fā)現(xiàn)，暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）和貝萊斯芽孢桿菌對馬鈴薯干腐病病原鐮刀菌具有較高的抑菌活性。在次級代謝產(chǎn)物的研究方面，發(fā)現(xiàn)來源于藍桉的藍桉葉精油及其主要單體組分能抑制馬鈴薯干腐病致病菌菌絲生長，其對黃色鐮刀菌（F. culmorum）和擬枝鐮刀菌（F. sporotrioides）的抑制效果更好（韓峰，2017）;來源于真菌寡雄腐霉（Pythium oligandrum）的寡雄蛋白（Oligandrin）對馬鈴薯塊莖干腐病的擴展有一定控制效果，其能提高馬鈴薯塊莖組織苯丙烷代謝相關(guān)的酶活及相關(guān)基因的表達，從而提高馬鈴薯塊莖的抗病性（劉筱等，2017）;殼聚糖能抑制尖孢鐮刀菌的生長和孢子萌發(fā)，增強馬鈴薯對該病原菌的抗性（Ren et al.，2021）。在嗜鹽菌研究方面，由于嗜鹽菌在特殊鹽堿生境下生長，其中必然存在著特殊活性的次級代謝產(chǎn)物（任培根和周培瑾，2003;Mathabatha，2010;談峰等，2021）。目前國內(nèi)外有關(guān)來源于鹽湖的嗜鹽菌研究主要包括新菌種的發(fā)現(xiàn)及鑒定、群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析、耐鹽堿能力及防治植物病害等。王錢福（2007）從青島和甘肅河西走廊地區(qū)的高鹽環(huán)境樣品中分離到中度和極端嗜鹽菌菌株，并對分離到的菌株進行形態(tài)學(xué)、生理生化特征、細(xì)胞化學(xué)組分分析及16S rDNA序列分析等多相分類學(xué)研究。沈碩（2017）從察爾汗鹽湖樣品中分離到中度嗜鹽菌421株，并對其群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)該鹽湖中度嗜鹽菌具有豐富的遺傳多樣性，存在可分離的新物種。王艷紅等（2017）成功克隆了中度嗜鹽菌Halobacillus Y5的甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運蛋白opu D基因，對其結(jié)構(gòu)及蛋白功能進行分析，驗證了該菌的耐鹽堿特性。【本研究切入點】目前，針對馬鈴薯干腐病拮抗菌的研究多為從馬鈴薯薯塊病樣病健交界處分離得到拮抗菌，而且都為對馬鈴薯干腐病病原菌的體外活性測定;針對嗜鹽菌的研究方面多集中在嗜鹽菌的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及嗜鹽機制方面。有關(guān)利用特殊環(huán)境微生物中的中度嗜鹽菌及其次級代謝產(chǎn)物進行馬鈴薯窖藏病害生物防治、以及利用生防菌發(fā)酵液有機溶劑萃取物及次級代謝產(chǎn)物抑制馬鈴薯干腐病病原菌的馬鈴薯活體防效及安全性評價的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過體外對峙培養(yǎng)法與馬鈴薯活體試驗相結(jié)合，對來源于青海察爾汗鹽湖的1株中度嗜鹽菌S61及其發(fā)酵液有機溶劑萃取物抑制馬鈴薯干腐病病原菌的活性和干腐病活體防效進行評價，對生防因子進行分析，旨在尋找高效、低毒的馬鈴薯干腐病生防菌劑、生防制劑及其先導(dǎo)化合物，以期為馬鈴薯干腐病的生物防治及綠色防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 生防菌 中度嗜鹽菌S61分離自青海察爾汗鹽湖（東經(jīng)99°02′～99°02′，北緯36°18′～36°45′）湖水樣品，由青海省農(nóng)林科學(xué)院微生物研究室分離并保存。

1. 1. 2 植物病原真菌 馬鈴薯干腐病病原真菌青9A-4-13（F. acuminatum）和青9A-5-2（F. solani）分離自馬鈴薯青薯9號薯塊病樣，65B-2-6（F. tricinctum）分離自馬鈴薯下寨65薯塊病樣。供試菌株均由青海省農(nóng)林科學(xué)院微生物研究室分離并保存。

1. 1. 3 馬鈴薯品種 供試馬鈴薯品種為青薯2號，由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1. 1. 4 培養(yǎng)基 中度嗜鹽菌S61分離培養(yǎng)于ATCC 213改良培養(yǎng)基（沈碩，2017），所有馬鈴薯干腐病病原菌培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基（沈碩和王艦，2013）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株S61形態(tài)學(xué)與生理生化特征鑒定 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（Buchanan and Gibbons，1999）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對菌株S61進行形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定。

1. 2. 2 菌株S61可利用碳源分析 采用Biolog細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，菌株S61經(jīng)革蘭氏染色和酶活性測定后，在Biolog微生物鑒定系統(tǒng)專用的平板培養(yǎng)基（Biolog，USA）上劃線培養(yǎng)12 h，取單菌落用稀釋液稀釋至合適濁度，透光率為90%～98%，將稀釋液加至Biolog全自動生化鑒定板中，每孔加100 μL，30 ℃培養(yǎng)20 h后上機讀數(shù)，記錄讀數(shù)結(jié)果，并進行菌株S61對95種碳源的利用特征分析。

1. 2. 3 菌株S61分子生物學(xué)鑒定 菌株S61的DNA提取根據(jù)生工生物工程（上海）股份有限公司的柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒的程序操作。選擇細(xì)菌16S rDNA通用引物F27（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAGG-3'）和P1541（5'-AAGGAGGTGGTGATCCA GCCGCA-3'）。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：10×Buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L） 2.0 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，無菌水補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5.0 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將得到的16S r DNA序列登錄NCBI網(wǎng)站通過BLAST進行序列比對，運用MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）（Bootstrap值為1000次）構(gòu)建菌株S61 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 4 菌株S61發(fā)酵液制備及其萃取物制備? 將菌株S61接種至裝瓶量為400 mL的ATCC213改良液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 180 r/min恒溫?fù)u瓶柜中振蕩培養(yǎng)5～7 d，收集發(fā)酵液，然后將其經(jīng)布氏漏斗減壓過濾去除菌體，得到去菌體發(fā)酵液，備用。

取去菌體發(fā)酵液600 mL于3000 mL的分液漏斗中，依次用等體積的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇對發(fā)酵液進行萃取，萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得萃取物;將萃取物預(yù)溶于二甲基亞砜（≤0.1%），并用無菌水分別將其配成質(zhì)量濃度為1.00、5.00、10.00和20.00 mg/mL的萃取物溶液，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜抽濾，備用。

1. 2. 5 菌株S61生防因子分析 采用平板透明圈法（潘曉梅等，2019），用直徑6 mm的打孔器分別在淀粉、酪蛋白、葡聚糖酶和羧甲基纖維素培養(yǎng)基上打取3個孔，向每孔中加入菌株S61發(fā)酵液100 μL，每個培養(yǎng)基處理設(shè)3次重復(fù)。將培養(yǎng)基平板置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，向淀粉酶培養(yǎng)基中加入2 mL碘液，使碘液均勻覆蓋平板，靜置10 min，觀察平板上出現(xiàn)透明圈情況;同時觀察酪蛋白酶、葡聚糖酶和羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板出現(xiàn)透明圈的情況。

采用排油圈法（魏新燕等，2017），取適量橄欖油加入蘇丹Ⅲ染色劑混勻，向直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中加入60 mL純水，并緩慢加入染色后的橄欖油，水面形成一層油膜，向培養(yǎng)皿油膜中心持續(xù)滴加菌株S61發(fā)酵液，觀察是否形成排油圈，檢測菌株S61發(fā)酵液是否有脂肽類物質(zhì)生成。

1. 2. 6 菌株S61及其萃取物抑菌活性測定 采用平板對峙法（Sadfi et al.，2001），在直徑9 cm的培養(yǎng)皿底部用十字交叉法劃線，并以交叉點為中心，在中心點接種菌株S61，在距離中心點2.5 cm處呈對稱分布的4個點接種直徑為5 mm的同一種病原菌菌餅。每個培養(yǎng)皿為1個處理，每處理3次重復(fù)，以只接種病原菌的培養(yǎng)皿為對照。7 d后測定菌株S61的抑菌活性。計算公式：抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

采用牛津杯法（吳海霞和田志芳，2020）測定發(fā)酵液有機溶劑萃取物的抑菌活性。計算公式：抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1. 2. 7 菌株S61發(fā)酵液及其萃取物對活體馬鈴薯上干腐病病原菌的抑制效果和馬鈴薯儲藏的安全性評價 參照Sadfi等（2001）的方法，首先將活化后的菌株S61接種于ATCC213改良液體培養(yǎng)基中，在37 ℃ 200 r/min的搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)2 d，收獲發(fā)酵液，用血球計數(shù)板將菌株S61發(fā)酵液的濃度調(diào)至1.0×108 CFU/mL;將3株供試馬鈴薯干腐病病原菌接種于PDB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃ 200 r/min的搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)2 d，收獲發(fā)酵液，用血球計數(shù)板分別將3株病原菌發(fā)酵液的孢子濃度調(diào)整為1.0×107 個/mL。然后在已消毒處理的馬鈴薯上用直徑為5 mm的打孔器打造2個深3 mm的孔口，每個孔口先接入40 μL病原菌發(fā)酵液，隨后接入40 μL菌株S61發(fā)酵液，將接種完成的馬鈴薯用封口膜包扎放入自封袋中，并在28 ℃、相對濕度75%左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d;以接病原菌發(fā)酵液和等量無菌水的處理作為陽性對照，以接等量無菌水和菌株S61發(fā)酵液的處理為陰性對照，以只接等量無菌水的處理為空白對照。每處理接種1個馬鈴薯，重復(fù)3次。

菌株S61發(fā)酵液萃取物對活體馬鈴薯上干腐病防效測定方法與發(fā)酵液防效測定方法一致。

培養(yǎng)14 d后，分別測定發(fā)酵液和萃取物溶液處理下馬鈴薯塊莖的壞果率、病斑深度及抑制率，并進行菌株S61發(fā)酵液及其萃取物對貯藏期馬鈴薯的安全性評價（李永才等，2009;劉筱等，2017）。計算公式：抑制率（%）=LP-LA/LP×100;其中，LP=未經(jīng)中度嗜鹽菌處理的馬鈴薯塊莖原質(zhì)量-鐮刀菌侵染后質(zhì)量，LA=中度嗜鹽菌處理后的馬鈴薯塊莖原質(zhì)量-鐮刀菌侵染后質(zhì)量。馬鈴薯儲藏安全性評價中無需計算抑制率。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)運用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進行各處理間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌株S61的鑒定

2. 1. 1 形態(tài)學(xué)鑒定 如圖1所示，菌株S61菌落呈乳黃色，不透明，表面褶皺，邊緣不規(guī)則;革蘭氏染色后鏡檢呈藍紫色，桿狀，表明該菌株為陽性菌。

2. 1. 2 生理生化特征 菌株S61過氧化氫酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解和酪蛋白測定呈陽性，精氨酸雙水解酶、精氨酸脫羧酶、H2S產(chǎn)生、水楊酸、吲哚試驗、溶血試驗、厭氧試驗和脲酶呈陰性（表1）。

2. 1. 3 菌株S61可利用碳源 采用Biolog細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進行菌株S61對95種碳源利用情況分析，結(jié)果見表2。

2. 1. 4 分子生物學(xué)鑒定 將菌株S61測序得到的16S rDNA序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號為MW 159354。經(jīng)BLAST序列比對分析，菌株S61與H. trueperi（MT125689.1）和H. trueperi（JX122547.1）的親緣關(guān)系最近，同源性達99.78%。使用MEGA 7.0中的鄰接法，以菌株S61與其他同源性相近的菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果（圖2）顯示，菌株S61的16S rDNA序列與H. trueperi（MT125689.1）和H. trueperi（JX122547.1）聚類為同一分支。結(jié)合菌株S61的形態(tài)特征、生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果，將菌株S61鑒定為特氏鹽芽孢桿菌（H. trueperi）。

2. 2 菌株S61生防因子分析

采用透明圈法測定菌株S61發(fā)酵液的產(chǎn)酶能力，結(jié)果（圖3）顯示，菌株S61發(fā)酵液在酪蛋白培養(yǎng)基（圖3-A）、淀粉培養(yǎng)基（圖3-B）和羧甲基纖維素培養(yǎng)基（圖3-C）上均產(chǎn)生了明顯的酶解圈，其中在酪蛋白培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基上酶解圈邊緣界限清晰;在酪蛋白培養(yǎng)基上酶解圈明顯較大;在羧甲基纖維素培養(yǎng)基上酶解圈邊緣界限模糊。說明菌株S61發(fā)酵液產(chǎn)蛋白酶較多，淀粉酶次之。菌株S61發(fā)酵液在葡聚糖酶培養(yǎng)基上未產(chǎn)生透明圈（圖3-D），說明菌株S61發(fā)酵液不具有產(chǎn)葡聚糖酶的能力。

采用排油圈法測定菌株S61發(fā)酵液是否具有產(chǎn)生表面活性功能的脂肽類物質(zhì)的能力，結(jié)果（圖3-E）顯示，菌株S61發(fā)酵液產(chǎn)生了明顯的排油圈，但排油圈較小，說明菌株S61發(fā)酵液能產(chǎn)少量脂肽類物質(zhì)。

2. 3 菌株S61抑菌活性測定結(jié)果

由表3可知，菌株S61與3株馬鈴薯干腐病病原菌在培養(yǎng)皿中分別對峙培養(yǎng)3 d后，對青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6的抑制率分別27.67%、19.00%和36.33%;培養(yǎng)7 d后，抑制率升高，分別為55.67%、30.33%和38.33%;培養(yǎng)14 d后，對3株病原菌的抑制效果相當(dāng)，抑制率分別為15.00%、15.00%和20.33%。由此可見，培養(yǎng)7 d后，菌株S61對病原菌的抑制效果最強，其中對青9A-4-13的抑制活性最好（圖4）。

2. 4 菌株S61發(fā)酵液萃取物的抑菌活性測定結(jié)果

由表4可知，菌株S61的正丁醇萃取物對3株馬鈴薯干腐病病原菌的抑制活性最高，乙酸乙酯萃取物活性次之，氯仿萃取物活性最低。就正丁醇萃取物而言，1和5 mg/mL萃取物僅對青9A-4-13具有高抑菌活性，抑制率分別為61.50%和63.00%;10 mg/mL萃取物對青9A-4-13和青9A-5-2具有高抑菌活性，抑制率分別為64.00%和68.50%;20 mg/mL萃取物對青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6均具有較高的抑菌活性，抑制率分別為66.00%、70.00%和58.00%。就乙酸乙酯萃取物而言，5和10 mg/mL萃取物僅對青9A-4-13具有較高的抑菌活性，抑制率分別為58.00%和59.00%;20 mg/mL萃取物對青9A-4-13和65B-2-6具有較高的抑菌活性，抑制率分別為61.00%和56.50%。就氯仿萃取物而言，僅10和20 mg/mL萃取物對青9A-4-13具有較高的抑菌活性，抑制率分別為59.00%和67.00%。

由此可見，3種不同的菌株S61發(fā)酵液萃取物對青9A-4-13的抑菌活性最高;同時，正丁醇和乙酸乙酯萃取物對3株馬鈴薯干腐病病原菌均具有不同的抑菌活性，且正丁醇萃取物的抑菌活性更高。

2. 5 菌株S61發(fā)酵液對活體馬鈴薯上干腐病病原菌的抑制效果

由表5可知，菌株S61發(fā)酵液對活體馬鈴薯上干腐病病原菌青9A-4-13的抑菌活性最高，壞果率為0.89%，病斑深度為1.92 cm，抑制率達76.33%;對65B-2-6的抑菌活性次之，抑制率為65.53%;對青9A-5-2的抑菌活性最弱，抑制率為44.67%。

2. 6 菌株S61發(fā)酵液萃取物對活體馬鈴薯上干腐病病原菌的抑制效果

由表6可知，菌株S61發(fā)酵液萃取物對活體馬鈴薯上干腐病病原菌有明顯的抑制活性，其中對青9A-4-13具有高抑菌活性，抑制率為62.51%～85.50%;對65B-2-6的抑菌活性次之，抑制率為49.28%～81.78%;對青9A-5-2的抑菌活性最低，抑制率為38.30%～64.53%。此外，菌株S61發(fā)酵液的正丁醇萃取物對青9A-4-13和65B-2-6的抑菌活性最高，各供試濃度下對2株病原菌的抑制率均高于60.00%，濃度為10和20 mg/mL的正丁醇萃取物對2株病原菌的抑制率均高于80.00%。同時，濃度為10和20 mg/mL的正丁醇和乙酸乙酯萃取物作用下的壞果率和病斑深度均較低。

2. 7 菌株S61發(fā)酵液及其有機溶劑萃取物對馬鈴薯儲藏的安全性評價

由表7可知，馬鈴薯接種青9A-4-13后，經(jīng)菌株S61發(fā)酵液及其正丁醇萃取物處理，馬鈴薯表現(xiàn)出一定程度的失重，但馬鈴薯塊莖創(chuàng)傷處無任何病害癥狀，病斑深度及發(fā)病率均為零。說明菌株S61發(fā)酵液及其正丁醇萃取物對馬鈴薯儲藏安全。

3 討論

中度嗜鹽菌特殊的生存環(huán)境使其具有極為特殊的生理結(jié)構(gòu)和代謝機制，并且還產(chǎn)生了許多具有特殊功能的天然活性物質(zhì)，是一類具有生物技術(shù)潛能的自身利益資源，因而其應(yīng)用已引起人們的廣泛關(guān)注。目前對中度嗜鹽菌應(yīng)用方面的研究主要集中在對其產(chǎn)生的酶、一些功能性分子和大分子多聚物以及生物環(huán)保等方面（馮二梅等，2009）。除此之外，也有學(xué)者對來源于青海察爾汗鹽湖的中度嗜鹽菌萃取物對辣椒疫霉菌的抑菌活性進行了研究（韓峰，2017）。本研究利用青海察爾汗鹽湖的中度嗜鹽菌S61及其發(fā)酵液萃取物對馬鈴薯干腐病的抑制作用進行了評價，結(jié)果表明，菌株S61及其發(fā)酵液萃取物對3株馬鈴薯干腐病病原菌具有不同程度的抑制作用;在對馬鈴薯塊莖的安全性評價中，馬鈴薯接種病原菌青9A-4-13后，經(jīng)菌株S61發(fā)酵液及其正丁醇萃取物處理，馬鈴薯塊莖創(chuàng)傷處無任何病害癥狀，菌株S61及其發(fā)酵液萃取物對馬鈴薯儲藏安全?？梢娋闟61具有作為馬鈴薯儲藏期間干腐病生防制劑的潛力。關(guān)于其發(fā)酵液提取物中活性物質(zhì)的分離、結(jié)構(gòu)鑒定以及尋找具有高效抑制馬鈴薯干腐病病害的化合物是下一步研究工作的重點。

截至目前，大量的國內(nèi)外學(xué)者將芽孢桿菌作為多種植物病原真菌潛在的生防制劑在培養(yǎng)皿中和生物活體上進行了研究（Sadfi et al.，2002;van den Boogert and Luttikholt，2004;王穎等，2014;Chen? et al.，2016;程歡歡等，2019）。本研究對中度嗜鹽菌S61進行了生理生化鑒定及基于16S rDNA序列分析的分子生物學(xué)鑒定，將菌株S61鑒定為特氏鹽芽孢桿菌。大量研究顯示，芽孢桿菌中的短小芽孢桿菌可對小麥根腐病病原菌（崔云龍等，1995）、番茄細(xì)菌性青枯?。ㄟB玲麗等，2009）、大豆疫?。ú芩矗?015）、煙草赤星病菌、黑脛病菌和白粉病菌（王靜等，2010，2015）等多種植物病害及病原物具有生防作用;簡單芽孢桿菌對根結(jié)線蟲和胞囊線蟲的生防作用顯著（劉冬梅等，2006;李永才等，2009）。但有關(guān)特氏鹽芽孢桿菌在生物防治方面的研究還處于空白狀態(tài);而本研究中特氏鹽芽孢桿菌S61及其發(fā)酵液萃取物對3種不同馬鈴薯干腐病病原菌均有一定的抑制作用，為開發(fā)防治植物病害的新型生物源農(nóng)藥打下基礎(chǔ)。

菌株S61在體外對峙培養(yǎng)和馬鈴薯活體試驗中均對干腐病病原菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，經(jīng)生理生化試驗發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生過氧化氫酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝酸鹽還原酶、淀粉水解酶和酪蛋白酶等多種酶活性;同時，其發(fā)酵產(chǎn)物的3種不同有機溶劑萃取物在體外和馬鈴薯活體試驗中對干腐病病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，其中，正丁醇萃取物活性最高。由此可見，菌株S61會產(chǎn)生一些具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，如抗生素（Korsten，1995）、生物表面活性劑（梅雨薇等，2020）、酶類物質(zhì)（Sadfi et al.，2001;劉郵洲等，2017）、嗜鐵素（Zhang et al.，2016）和酯肽類（Isabel et al.，2015;魏新燕等，2017;車建美等，2017）等。此外，菌株S61發(fā)酵液及其萃取物在體外和馬鈴薯活體試驗中對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌活性相當(dāng)，說明生防制劑的有效性通常受到生防菌和病原菌類型、寄主植物對病原菌的抗性以及環(huán)境等多種因素的影響（Recep et al.，2009）。后續(xù)課題組將進一步探究菌株S61的活性組分對干腐病病原菌的相關(guān)生防作用機制，以期為生防菌劑、生防制劑及其先導(dǎo)化合物的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

4 結(jié)論

中度嗜鹽菌S61在體外和馬鈴薯活體上均對干腐病病原菌具有抑制作用，其發(fā)酵產(chǎn)物的正丁醇萃取物活性最高，并存在生防因子，能產(chǎn)生一些具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，具有較好的馬鈴薯干腐病生物防治潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）