AAV介導(dǎo)的聽力損失基因治療進(jìn)展

柯君子，談方志?，鐘桂生??

①上?？萍即髮W(xué) iHuman研究所，上海 201210；② 上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

聽力損失是最常見的神經(jīng)感覺障礙疾病之一，影響著全球4.6億人口的正常生活[1]。每1 000個(gè)新生兒中就有3個(gè)患有先天性聽力障礙，而且聽力受損人數(shù)不斷增長，預(yù)計(jì)到2050年將有10億人受聽力損失影響[2]。環(huán)境和遺傳因素均可導(dǎo)致感覺細(xì)胞和神經(jīng)元的死亡，繼而導(dǎo)致聽力損失。由于這些細(xì)胞的不可再生性，損傷累積將最終導(dǎo)致嚴(yán)重的耳聾。佩戴人工耳蝸是目前解決聽力損失的有效方法，但是這種方法沒有從根本上治愈聽力損傷，使用中還存在靈敏性差、背景噪聲強(qiáng)等缺點(diǎn)[3-4]。近年來，由于基因組生物學(xué)的發(fā)展，多種聽力相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及部分聽力損失機(jī)制被闡明，為聽力疾病的基因治療提供了基礎(chǔ)理論。耳蝸和聽神經(jīng)損傷導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聽力損失（sensorineural hearing loss, SNHL）占所有聽力損失的90%，而SNHL中50%左右是基因突變導(dǎo)致的，可以通過基因治療彌補(bǔ)人工耳蝸的缺陷，從根本上治愈聽力損失[5-6]。

1 天然AAV的結(jié)構(gòu)與分型

基因治療（gene therapy）是指將外源正?；颉⑿NA或基因編輯等工具導(dǎo)入靶細(xì)胞，糾正或補(bǔ)償表達(dá)異常和基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。大約有1 800例基因治療使用病毒介導(dǎo)的方法，占總基因治療臨床試驗(yàn)的70%。鑒于腺病毒可能引起致命的免疫反應(yīng)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒可能誘發(fā)癌癥等原因，腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus, AAV）的非致病性使其有望成為主要的病毒載體。

AAV擁有60個(gè)衣殼亞基組成的蛋白衣殼，以及一個(gè)約4.7 kb的單鏈線性DNA基因組，需要依賴于其他病毒（主要是腺病毒）共同感染才能復(fù)制[7-9]。AAV的單鏈基因組包含：Rep基因和Cap基因。其基因產(chǎn)物的兩側(cè)是基因組復(fù)制和包裝所需的反向末端重復(fù)序列（ITR）[10]。Rep基因編碼病毒基因組，復(fù)制和包裝所必需的蛋白質(zhì)；Cap表達(dá)病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3，形成保護(hù)病毒基因組的外衣殼，并參與細(xì)胞結(jié)合[11]。此外，aap基因在一個(gè)與Cap基因重疊的閱讀框中編碼組裝激活蛋白（AAP），該核蛋白為衣殼裝配提供支架[12-13]。

迄今為止，研究人員已從人類和非人類靈長類動(dòng)物組織樣品中分離出12種血清型AAV（AAV1～AAV12）和100多種變體[14]。在12種血清型中， AAV1～9具有較廣泛的組織嗜性，被作為主要基因治療載體。2012年歐盟批準(zhǔn)了第一個(gè)基因治療產(chǎn)品Glybera，該產(chǎn)品通過利用AAV1病毒載體將正常的LPL基因?qū)牖颊呒∪饧?xì)胞中使其產(chǎn)生脂蛋白脂肪酶，以此治療脂蛋白酯酶缺乏癥[15]。FDA也于2017批準(zhǔn)了首個(gè)使用AAV2治療遺傳性視網(wǎng)膜疾病的基因治療產(chǎn)品Luxturna[16]。

2 新型AAV載體在聽力領(lǐng)域的進(jìn)展

Landegger等人[17]于2017年報(bào)道一種人工設(shè)計(jì)的AAV病毒載體Anc80L65。與傳統(tǒng)的血清型AAV相比，Anc80L65顯著提高了幼年小鼠內(nèi)、外毛細(xì)胞的感染效率。同年，Scientific Report報(bào)道了Anc80L65對(duì)成年小鼠的內(nèi)毛細(xì)胞有幾乎100%的感染率，但對(duì)外毛細(xì)胞表現(xiàn)出極低的感染率[18]。這說明幾乎所有聽力領(lǐng)域AAV載體的一個(gè)現(xiàn)況和難點(diǎn)，即對(duì)幼年和成年鼠的感染往往顯示出不同的效率。2019年，美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)現(xiàn)另一種新型AAV——AAV2.7m8[19]。相比于Anc80L65，高滴度的AAV2.7m8表現(xiàn)出對(duì)毛細(xì)胞更強(qiáng)的感染效率。同時(shí)，AAV2.7m8也可感染IPhC和IBC這兩類支持細(xì)胞。但是，AAV2.7m8與Anc80L65都對(duì)其他支持細(xì)胞感染率低，這也是兩者在靶向支持細(xì)胞的基因治療和毛細(xì)胞再生上的劣勢(shì)。

通過改造AAV衣殼蛋白，談方志等人獲得一款對(duì)耳蝸內(nèi)各細(xì)胞具有高感染效率的AAV載體AAV-ie。AAV-ie對(duì)于耳蝸支持細(xì)胞的感染率顯著高于其他天然AAV型（包括AAV2.7m8和Anc80L65），能達(dá)到80%左右顯示其在聽力疾病治療領(lǐng)域的潛力（圖1）。同時(shí)，他們利用AAV-ie將Atoh1基因?qū)氲接资蟮亩佒?，首次?shí)現(xiàn)利用AAV載體再生內(nèi)毛細(xì)胞（圖2）[19]。值得注意的是，雖然AAV-ie幾乎能感染所有的支持細(xì)胞，但并沒有觀察到外毛細(xì)胞的再生，可能是由于Atoh1單基因不足以再生外毛細(xì)胞。多種因子組合誘導(dǎo)再生或成為后續(xù)再生內(nèi)外毛細(xì)胞的重要探索方向之一。

圖1 AAV-ie高效感染整個(gè)耳蝸組織中的支持細(xì)胞，利用AAV-ie導(dǎo)入綠色熒光蛋白

圖2 AAV-ie-Atoh1在Sensory區(qū)域和GER區(qū)域均能再生大量Myo7a陽性的新生毛細(xì)胞

3 AAV載體的持續(xù)研發(fā)

3.1 AAV衣殼的優(yōu)化

因?yàn)锳AV感染特性由衣殼的多個(gè)方面決定，每一個(gè)氨基酸的改變都可能影響AAV感染的偏好性和強(qiáng)度，所以對(duì)AAV衣殼的優(yōu)化成為改造AAV載體的重點(diǎn)。其中，通過突變、肽段插入和家族改組等方法進(jìn)行的定向進(jìn)化，創(chuàng)建出的獨(dú)特衣殼組合可能具有獨(dú)特的載體特性。一方面，定向進(jìn)化具有極強(qiáng)的目的性，更易獲得所需的載體；另一方面，下一代測序技術(shù)能夠篩選幾千個(gè)條形碼的轉(zhuǎn)基因基因，進(jìn)行豐富迭代，使得定向進(jìn)化成為發(fā)現(xiàn)新衣殼的強(qiáng)大技術(shù)。另一種構(gòu)建新AAV衣殼的方法是通過計(jì)算機(jī)算法來實(shí)現(xiàn)的[20]。計(jì)算機(jī)利用已有的衣殼生物學(xué)知識(shí)和宿主細(xì)胞靶標(biāo)，合理設(shè)計(jì)出特異性靶向細(xì)胞能逃避免疫監(jiān)視或具有其他特性的衣殼（圖 3）[21]。用上述的技術(shù)構(gòu)建一個(gè)新AAV衣殼的改造平臺(tái)，對(duì)于基因治療平臺(tái)的建立至關(guān)重要。

圖3 AAV衣殼的改造方法

3.2 AAV介導(dǎo)的蛋白特異性表達(dá)

研究表明，Anc80L65被注射入小鼠耳蝸后，除了耳蝸組織的感染外，Anc80L65也能擴(kuò)散入小鼠的腦部區(qū)域，提示出極大的安全風(fēng)險(xiǎn)[18]。AAV-ie的研究中也出現(xiàn)過類似的現(xiàn)象。因此，AAV感染的特異性研究對(duì)臨床應(yīng)用具有重要意義。載體特異性問題可以從兩個(gè)方面來解決：一是定向進(jìn)化，篩選組織特異性或細(xì)胞特異性的AAV載體；二是利用特異性的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的特異性表達(dá)[22]。特異性啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)方法（圖4）[22-23]：①通過選取細(xì)胞類型特異性基因起始密碼子上游序列合成；②通過至少兩個(gè)細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前的遺傳保守的DNA元素有序組裝而成；③由細(xì)胞特異性的重復(fù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與隨機(jī)序列交叉組成；④由低甲基化的順調(diào)節(jié)元件組成。上述4種設(shè)計(jì)方式針對(duì)不同耳蝸細(xì)胞類型的特異性啟動(dòng)子，提高治療基因的表達(dá)特異性，繼而提高AAV介導(dǎo)的基因治療的安全性。

圖4 細(xì)胞特異性表達(dá)啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)方法

4 AAV介導(dǎo)的聽力損失小鼠基因治療

近年來，已有大量研究將AAV用于聽力損傷治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（表1）。雖然這些AAV介導(dǎo)的基因治療顯示出一定的療效，但是都沒能完全恢復(fù)聽力。有效的耳蝸基因治療的關(guān)鍵是對(duì)不同基因和內(nèi)部各種類型突變引起的缺陷的細(xì)胞機(jī)制的理解。其中，影響毛細(xì)胞、支持細(xì)胞或血管紋（SV）功能的單源突變，是導(dǎo)致嚴(yán)重聽力損失的3種主要突變類型。天然傳統(tǒng)的AAV由于其對(duì)各類細(xì)胞的感染率都不高，已經(jīng)逐漸被淘汰。3種新型的AAV載體具有一定的偏好性：AAV2.7m8和Anc80L65偏好感染毛細(xì)胞，適用于毛細(xì)胞的基因治療；而AAV-ie能廣泛地感染耳蝸內(nèi)各種組織，對(duì)支持細(xì)胞感染率高，適用于支持細(xì)胞治療和再生治療。

表1 部分具有代表性的動(dòng)物模型的研究

一部分的耳聾基因參與毛細(xì)胞負(fù)責(zé)的聲音傳導(dǎo)（如Tmc1）、毛束的發(fā)育和維持（如Myosin系列的蛋白Myo6、Myo7a等）、神經(jīng)傳導(dǎo)（如OTOF），針對(duì)這部分基因異常所導(dǎo)致的耳聾，選用的AAV必須能精準(zhǔn)地靶向毛細(xì)胞，因此Anc80L65成為這類基因治療的首選載體。另外一些耳聾基因則主要影響支持細(xì)胞，如Gjb2、Slc26a4等[32]，AAV-ie則更適合這類耳聾基因的治療。此外，支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化毛細(xì)胞等毛細(xì)胞再生治療手段仍需進(jìn)一步的探索。

5 展望：AAV載體的改造與純化

近幾年，AAV在聽力領(lǐng)域的基因治療研究中取得跨越式的發(fā)展，3種新型AAV一定程度上滿足了治療需求，但仍存在特異性差、感染效率低等缺點(diǎn)。目前其他領(lǐng)域中使用AAV載體的臨床試驗(yàn)呈指數(shù)級(jí)增長，而聽力領(lǐng)域的相關(guān)試驗(yàn)卻嚴(yán)重滯后。一個(gè)很重要的原因就是缺少能高效感染內(nèi)耳各種組織的AAV載體。3種新型AAV雖然能解決部分的問題，但特異性和成體感染依然有待進(jìn)一步研究以尋求方案。要使AAV成為適用聽力損失基因治療的載體，需要多學(xué)科融合來篩選出真正實(shí)用的AAV載體。因此，對(duì)新型AAV的發(fā)現(xiàn)與改造仍需要繼續(xù)探索深研。

另一個(gè)AAV基因治療應(yīng)用的主要障礙是藥物產(chǎn)品的可負(fù)擔(dān)性。目前批準(zhǔn)的3款A(yù)AV藥物都以其驚人的巨額費(fèi)用限制了藥品受眾。臨床級(jí)AAV產(chǎn)品的需求量大和純化工藝復(fù)雜是價(jià)格高昂的一個(gè)因素。利用懸浮的HEK293細(xì)胞進(jìn)行三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以進(jìn)行AAV包裝仍是現(xiàn)階段普遍采取的方法，但無法保證所有細(xì)胞都能獲得高效包裝所需的質(zhì)粒的最佳比率，從而，使得生產(chǎn)效率低下，無法滿足臨床大量的使用量。因此，改進(jìn)生產(chǎn)工藝或?qū)ふ腋行У姆椒ㄈ允俏覀兝^續(xù)努力的方向。