狐源屎腸球菌的分離鑒定及藥敏試驗

魏成威，劉 琳，王新宇，白 薈，高 利*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物臨床教學(xué)醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

腸球菌是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、無芽孢的兼性厭氧菌，是溫血動物和人類胃腸道的共生菌[1]。糞腸球菌和屎腸球菌是其中的兩大類，被認為是引起人類醫(yī)院內(nèi)感染的主要原因[2]。屎腸球菌曾被認為對人類及動物機體是無害的，并且很長一段時間內(nèi)在食品工業(yè)中作為益生菌等添加物被廣泛使用[3]。近年來的研究顯示,屎腸球菌作為條件致病菌在腸道抵抗力降低及長期患病(如腎臟疾病、腫瘤等)致免疫力低下時可引起人和動物發(fā)病[4]。在美國，腸球菌是醫(yī)院內(nèi)感染的第二大原因，糞腸球菌和屎腸球菌分別占每年感染的6.8%和4.1%[5]。動物感染屎腸球菌因種屬不同及個體差異表現(xiàn)不同的癥狀。

本研究從病死狐的肺部分離到1菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查、16S rRNA鑒定、藥敏試驗、毒力基因檢測及致病性試驗確定為屎腸球菌感染。狐貍是一種重要的經(jīng)濟動物，但是國內(nèi)對于狐感染屎腸球菌的報道很少，通過藥敏試驗和動物試驗來確定該菌臨床用藥的敏感性和致病性，為該病臨床治療和流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來源于某狐貍養(yǎng)殖場送檢到獸醫(yī)院的死亡狐貍，從肺臟中采集的組織。

1.1.2 實驗動物 SPF小鼠7只，購自遼寧長生生物有限公司。

1.1.3 試劑和儀器 血平板，南京—基生化有限公司產(chǎn)品；rTaq酶、10×PCR buffer、dNTP，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，北京索萊寶生物有限公司產(chǎn)品；DHP-360電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司產(chǎn)品；DYY-Ⅲ型電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 16S rRNA的片段長度為1 500 bp，上游引物27F，引物序列為5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'，下游引物1429R，引物序列為5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

屎腸球菌的毒力基因cyt的片段長度為475 bp，上游引物為CYT-1，引物序列為5'ACTCGGGGATTGATAGGC3'，下游引物為CYT-2，引物序列為5'GCTGCTAAAGCTGCGCTT3'；屎腸球菌種屬基因包含hyl、asa、ace、gel、esp、tuf，基因hyl片段長度為276 bp，上游引物為HYL-1，引物序列為5'ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG3，下游引物為CYT-2，引物序列為5'GACTGACGTCCAAGTTTCCAA3'；基因asa片段長度為375 bp，上游引物為ASA-11，引物序列為5'GCACGCTATTACGAACTATGA3'，下游引物為ASA-12，引物序列為5'TAAGAAAGAACATCACCACGA3'；基因ace片段長度為320 bp，上游引物為ace1-F，引物序列為5'AAAGTAGAATTAGATCACAC3'，下游引物為ace2-R，引物序列為5'TCTATCACATTCGGTTGCG3'；基因gel片段長度為213 bp，上游引物為GEL-11，引物序列為5'TATGACAATGCTTTTTGGGAT 3'，下游引物為GEL-12，引物序列為5'AGATGCACCCGAAATAATATA3'；基因esp片段長度為510 bp，上游引物為Esp-14F，引物序列為5' AGATTTCATCTTTGATTCTTGG3'，下游引物為Esp-12R，引物序列為5'AGATGCACCCGAAATAATATA3'；基因tuf片段長度為112 bp，上游引物為tuf-F，引物序列為5'TACTGACAAACCATTCATGATG3'，下游引物為tuf-R，引物序列為5'AACTTCGTCACCAACGCGAAC3'。

1.2.2 細菌的分離與生化鑒定 用滅菌的接種環(huán)蘸取少許病狐的肺部組織，劃線接種于血清LB平板、麥康凱平板，血瓊脂平板中，37 ℃溫箱中培養(yǎng)18 h～24 h。觀察細菌生長情況和菌落特征并進行革蘭氏染色，接種于發(fā)酵管中進行生化試驗。

1.2.3 細菌的16S rRNA的測定 提取細菌的基因組，將菌液反復(fù)吸取混勻后，吸取200 μL 12 000 r/min離心1 min，棄去上清，保留沉淀。加入去離子水200 μL，沖洗，12 000 r/min離心1 min，棄去上清，保留沉淀，重復(fù)1次。加入1 mL溶菌酶，反復(fù)吹洗，搖床1 h，30 min，離心留沉淀，根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒上的步驟提取基因組。

PCR擴增：PCR擴增體系總體積20 μL，ddH2O 12.8 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mix 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物2F 1 μL，下游引物1492 R 1 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)進行條件，94 ℃ 5 min；94℃ 40 s,56℃ 50 s,72℃ 90 s，共25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.4 種屬引物測定 細菌基因組的提取步驟同1.2.3。PCR擴增：PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，ddH2O 11.8 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，49 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。產(chǎn)物經(jīng)鑒定后根據(jù)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒上的說明書進行回收，回收產(chǎn)物送由吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.2.5 藥敏試驗 藥物試驗采用KB法，選取20種常用的抗菌藥物進行試驗，以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株，試驗操作及判定標準按2009年美國NCCLS法規(guī)標準進行判定。將分離純化的菌株，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h～12 h后。用移液槍取200 μL菌液均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板上，自然干燥后，將頭孢噻呋鈉、萬古霉素、氯霉素，慶大霉素、氨芐西林，環(huán)丙沙星等20種藥敏片平貼于培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱放置24 h，判定結(jié)果，以抑菌圈直徑作為判定指標。

1.2.6 毒力基因鑒定 對屎腸球菌的主要毒力基因gel、esp、asa、cyt、ace、hyl，進行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，ddH2O 11.8 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min,49 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.7 致病性試驗 將分離純化的菌株于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)，腹腔注射5只健康小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射0.5 mL，攻毒劑量為5×108CFU，對照組2只小鼠腹腔注射LB液體培養(yǎng)基，隔離飼養(yǎng)，觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況。對未死亡小鼠5 d后剖檢，從肝臟中再次分離細菌。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離與生化鑒定結(jié)果

將病料接種到LB平板培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，可見大量蔓延生長的不溶血、不透明的小菌落；接種到麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，其生長情況為黃灰色光滑干燥小菌落。取少量菌體接種于液體LB中培養(yǎng)12 h～24 h，之后接種于血平板中，觀察溶血性，可見菌體不溶血。三糖鐵斜面培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察其生化反應(yīng)，結(jié)果為不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2S。菌體呈現(xiàn)橢圓形或圓形，革蘭氏染色陽性。

2.2 16S rRNA鑒定結(jié)果

2.2.1 16S rRNA擴增鑒定結(jié)果 凝膠塊的第一個孔加入DNA標準DL 2 000，分離株16S rRNA基因PCR結(jié)果是核酸電泳鑒定分離菌株在1 500 bp擴增出條帶。

2.2.2 16S rRNA序列鑒定結(jié)果 根據(jù)Blast序列比對，可以看出序列一致性為99%(圖1)。

2.3 種屬引物鑒定結(jié)果

該分離菌經(jīng)PCR擴增出了一條112 bp的條帶(圖2)。這與屎腸球菌片段大小相一致，結(jié)合2.2中的結(jié)果，序列同源性為99%，說明該分離菌為屎腸球菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

采用KB擴散法檢測藥物敏感性，結(jié)果如表1所示，檢測的20種抗菌藥物中，分離菌株11001對氯霉素和萬古霉素表現(xiàn)敏感，對β-內(nèi)酰胺類、林可酰胺類、四環(huán)素類、頭孢第三代抗生素、氨基糖苷類抗生素、喹諾酮類、多肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、及呋喃類抗菌藥表現(xiàn)耐藥。

圖1 分離株16S rRNA序列Blast結(jié)果

M.DNA 標準DL 2 000;1.tuf;2.陰性對照

表1 分離菌的藥敏試驗結(jié)果

2.5 毒力基因檢測結(jié)果

提取分離菌的DNA，對分離菌11001進行屎腸球菌毒力基因gel、hyl、esp、cyt、asa、ace的PCR鑒定，依次擴增出213、276、510、475、375、320 bp片段,與預(yù)期條帶的長度一致，說明分離菌11001攜帶屎腸球菌的毒力基因。部分毒力基因PCR結(jié)果如圖3所示。

M.DNA 標準DL 2 000;1.esp;2.asa;3.ace;4.hyl

2.6 致病性試驗結(jié)果

試驗組的5只小鼠，12 h后5只小鼠出現(xiàn)急性死亡，死亡體態(tài)呈現(xiàn)四肢蜷縮狀。對照組2只小鼠無明顯臨床癥狀。剖檢所見，試驗組5只小鼠脾臟均有淤血，大腸均充滿大量氣體，其他臟器未見明顯異常。

3 討論

目前，有關(guān)腸球菌感染的報道日漸增多。1899年最早報道腸球菌感染與人的感染性心內(nèi)膜炎有關(guān)[6]，之后的報道顯示腸球菌引起一系列醫(yī)院內(nèi)感染，包括新生兒敗血癥、盆腔感染及尿路感染等[7]。動物感染屎腸球菌表現(xiàn)各異，豬感染后多在1 d～3 d內(nèi)死亡，特征性表現(xiàn)結(jié)膜充血、分泌物增多，全身瘀斑及口鼻出血[8]；雛雞感染屎腸球菌主要表現(xiàn)肝臟腫大、出血等[9]。動物感染屎腸球菌的病例越來越多，狐貍感染的病例報道較少，應(yīng)引起足夠的重視。

本試驗從死亡狐貍的肺臟分離到細菌，為革蘭氏染色陽性，菌體呈現(xiàn)圓形或橢圓形，不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2S，滴加30 mL/L H2O2無氣泡產(chǎn)生，這與之前的報道中屎腸球菌的形態(tài)及生化特征相一致[3]。對分離株進行16S rRNA鑒定以及種屬引物PCR擴增，結(jié)果顯示分離株為屎腸球菌，且擴增結(jié)果與之相一致。藥敏試驗結(jié)果顯示，該分離株在被檢的20種抗菌藥物中，僅對氯霉素和萬古霉素表現(xiàn)為敏感，對其他抗菌藥物均表現(xiàn)耐藥，這可能是由于狐貍場在預(yù)防及治療疾病方面的用藥習(xí)慣導(dǎo)致的。對屎腸球菌毒力基因gel、hyl、esp、cyt、asa、ace的PCR鑒定，依次擴增出213、276、510、475、375、320 bp片段，與預(yù)期條帶長度一致，說明分離菌11001可能攜帶屎腸球菌的毒力基因。Hy1基因主要出現(xiàn)于臨床感染的屎腸球菌中，在屎腸球菌致病中起著重要的作用，可能是屎腸球菌的毒力基因之一[10]。分離株在致病性試驗中試驗組5只小鼠全部死亡，說明該株屎腸球菌有一定的致病性。

屎腸球菌通常存在于環(huán)境和機體腸道內(nèi)，屬于條件性致病菌，正常時不易發(fā)病[7]，抗菌藥物及其他抗菌藥物的不合理使用導(dǎo)致屎腸球菌的大量增殖，從而產(chǎn)生致病性[11]。所以應(yīng)注意公共衛(wèi)生，提高和加強飼養(yǎng)環(huán)境建設(shè)，減少疾病的發(fā)生。本試驗從患病狐貍肺臟著手，分離到屎腸球菌，這在之前狐貍體內(nèi)病原菌的研究中鮮少報道，其分離鑒定及病原分析結(jié)果能為狐貍屎腸球菌感染的研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)。但由于時間和試驗條件等因素的限制，沒有進行厭氧菌、支原體、螺旋體、寄生蟲等的培養(yǎng)分離，但不排除有這些病原的并發(fā)或繼發(fā)感染。今后將繼續(xù)深入研究狐貍感染屎腸球菌的發(fā)病原因及預(yù)防措施，為狐貍養(yǎng)殖業(yè)屎腸球菌感染的防控提供理論支持。