免疫層析技術研究及應用

劉 暢，楊琳燕，王藝霞，張 偉，李道穩(wěn)，李留安，李 存

(天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院/天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392)

免疫層析技術(immunochromatographic analysis，ICA)始于20世紀后期，是一種將色譜層析和免疫技術相結合的快速檢測技術[1]。由于檢測周期短、成本低、對儀器設備和人員沒有特殊要求，ICA在即時檢測(point-of-care testing,POCT)方面發(fā)揮著不可替代的作用，發(fā)展前景廣闊，其中最經典的一種標記檢測技術是膠體金ICA[2]。隨著納米技術的發(fā)展和新材料的應用，ICA技術不斷創(chuàng)新變革，將具有更廣泛的應用范圍和更廣闊的開發(fā)前景。

1 ICA技術簡介

1.1 ICA技術原理

以膠體金為例，ICA以膠體金標記抗原或抗體，層析過程中，膠體金標記物隨樣品溶液通過毛細作用在試紙條上移動，與測試線(test line,T線)上相應的受體結合，聚集后顯紅棕色[3]。T線的顏色深淺反映了樣品中待測物的含量。同時設質控線(control line,C線)，驗證檢測結果是否有效。

根據(jù)待測分子的大小和結合方式，ICA可分為夾心法和競爭法[2]。夾心法是指待測抗原的不同表位分別與兩種抗體結合，在試紙條上形成抗體1-抗原-抗體2夾心結構[4]，適用于大分子待測物。競爭法一般用于小分子，T線用待測抗原或抗原類似物處理，它與待測物競爭結合標記抗體，所以T線顏色強度與待測物的含量成反比[5]。

1.2 ICA的發(fā)展趨勢

1.2.1 靈敏度提高 高靈敏度、定量檢測和多元檢測是ICA技術的發(fā)展趨勢[6]。免疫標記材料是影響靈敏度的一個重要因素。膠體金是應用最早、應用最廣泛的標記材料，但靈敏度偏低[7]。量子點(quantum dot,QD)[8]、時間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microsphere,TrFM)[9]以及磁性微球(magnetic bead,MB)[10]等新型標記材料的出現(xiàn)使得ICA的靈敏度不斷提高。Lu T等[11]以膠體金和QD作為信號標簽，分別建立了兩種檢測Ⅱ型志賀毒素的ICA方法，膠體金ICA的檢測限為25 ng/mL，QD ICA方法為5 ng/mL，靈敏度明顯高于膠體金方法。

生物素-親和素系統(tǒng)(biotin avidin system，BAS)[12]、貴金屬[13]、脂質體[4]等信號放大系統(tǒng)的應用也對ICA技術靈敏度的提高起到了積極作用。BAS親和力極強，有信號放大作用，可與蛋白等生物分子結合而不破壞其活性。Serebrennikova K V等[12]依靠BAS提高了膠體金ICA的靈敏度，其靈敏度比常規(guī)膠體金方法提高了4倍。Anfossi L等[8]制備了CdSe QD，以金、銀納米粒子作為淬滅劑，建立了檢測玉米粉中伏馬菌素的ICA方法。通過淬滅劑的作用，熒光信號隨伏馬菌素的含量成倍變化，檢測限范圍在1.56 ng/mL～6.25 ng/mL之間，比普通方法低4倍。

1.2.2 半定量、定量檢測 ICA的半定量、定量方法也在逐步發(fā)展。Serebrennikova K V等[14]同時用3個不同濃度的金標抗體包被試紙條T區(qū)，制成多范圍梯度的ICA，可快速實現(xiàn)降鈣素原的半定量測定。Zhang X等[15]分別將赭曲毒素A(ochratoxin，OTA)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)的結合抗原噴涂在NC膜上，建立膠體金ICA方法，借助便攜式讀卡器能夠同時對玉米、小麥和飼料中的OTA、ZEN進行定量。Han M M等[16]構建了可同時檢測牛奶中的黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)、三聚氰胺以及6種抗生素的膠體金檢測卡，拍照后用Image J軟件分析能夠得到半定量結果。Li X M等[17]開發(fā)了一個Android應用程序，可以快速定量玉米和飼料中ZEN的ICA分析結果，并且支持檢測結果共享。熒光定量閱讀器[18]、磁信號閱讀[19]等儀器可用于量化檢測結果，自動化程度高，結果客觀、準確。

1.2.3 層析材料的變化 常用的ICA常用聚酯纖維、玻璃纖維、尼龍膜等作為固定材料，現(xiàn)在的固定材料以硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜)居多。NC膜對生物大分子的吸附性強[4]，性質穩(wěn)定，便于保存；親水性好，樣品溶液可以在膜上快速層析，從而實現(xiàn)快速檢測。有些公司已經開發(fā)一體化材料，同時作為樣品墊、結合墊、固定膜和吸水墊，推動免疫層析技術朝著更加簡便的方向發(fā)展。

2 ICA標記材料的分類

2.1 膠體金

膠體金是用氯金酸溶液制成的穩(wěn)定的膠體溶液。膠體金技術的原理是用膠體金為標記材料，隨著抗原抗體反應的進行，膠體金在NC膜的T線集聚并顯出紅棕色[3]。具有操作簡便、迅速，不依賴任何儀器的特點。然而，由于靈敏度不夠理想，膠體金法一般用于對目標物的初篩檢測。Serebrennikova K V等[14]在傳統(tǒng)膠體金方法的基礎上進行改進，制得直徑為100 nm的納米金花并將其用于ICA，方法的靈敏度提高了5倍。Zeng Y Y等[20]用生物素和鏈霉親和素對金納米顆粒進行雙標記，構建了一種帶有熒光背景阻斷的新型膠體金ICA方法。該方法對于豬尿液中克侖特羅的檢測限為0.03 μg/L，靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金方法提高了60倍。

2.2 熒光標記材料

熒光ICA是以熒光材料標記抗原或抗體，待測物與之結合后形成帶有熒光標記的免疫復合物，通過測定免疫復合物的熒光含量即可推算待測物的濃度。熒光ICA方法的背景干擾小，靈敏度高；缺點是檢測結果肉眼不可見，需要與相關儀器聯(lián)用，而且熒光存在自然淬滅現(xiàn)象，保存成本較高[11]。

2.2.1 量子點 量子點(QD)主要由ⅡB族～ⅥA族或ⅢA族～ⅤA族元素構成，是能夠產生熒光的半導體納米顆粒[21]。QD具有優(yōu)良的標記特性和光化學穩(wěn)定性，激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄，熒光強度高[22]，是一種很好的標記材料。Huang Z等[23]針對豬尿液中的克侖特羅，在磁珠表面組裝QD，在此基礎上建立了一種靈敏度高、耐基質干擾的克侖特羅ICA檢測方法。QD可單獨作為一種標記材料，與MNP材料同時使用能夠簡化制備過程，同時結果判定方式變得多樣化。Xie S L等[18]使用不同的CdSe/ZnS QD建立了一種能夠同時檢測雞肉中金剛烷胺和氯霉素的定量ICA方法。分析結果與市售ELISA試劑盒檢測結果相符，對于金剛烷胺和氯霉素的檢測限分別為0.18 ng/g和0.016 ng/g。

2.2.2 時間分辨熒光微球 時間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microsphere,TrFM)由稀土元素構成，表面有豐富的官能團可用來偶聯(lián)抗體，Stokes位移大，熒光效率高[24]。Stokes位移是指熒光光譜較相應的吸收光譜紅移，是最大熒光發(fā)射波長與最大吸收波長之間的差值。較大的Stokes位移能夠增強熒光材料的抗干擾能力，提高信噪比，有助于提高檢測的靈敏度[25]。Li X M等[9]利用膠體金、乳膠微球和TrFM作為抗體標記示蹤劑，分別建立了3種檢測牛奶和豬肉中泰樂菌素和替米考星殘留的ICA方法。其中以TrFM為標記物的方法靈敏度高、制備成本較低、抗體消耗量少，有希望用于現(xiàn)場檢測和大批量樣本篩選。

2.2.3 上轉換納米顆粒 上轉換納米顆粒(upconversional nanoparticles,UCNP)由稀土金屬元素摻雜惰性氧化物構成，在近紅外光激發(fā)下表現(xiàn)出強熒光[26]，抗光漂白能力強，背景干擾小，發(fā)光壽命長[27]，具有天然材料所不具備的優(yōu)點。但UCNP的量子產率很低，在實際應用中受限制[28]。李丹陽等[27]使用磷酸化的黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)適配體包裹UCNPs，結合ICA方法快速定性并定量花生中的AFB1，檢測限為2.4 ng/mL，結果準確，具有潛在的實用價值。

2.3 磁性納米顆粒

以Fe3O4為代表的磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNP)是近些年發(fā)展起來的一種新型標記物。普通ICA通過T線的顏色強度反映待測物含量，但肉眼或讀卡器只能觀察記錄NC膜表面約10 μm厚度的顏色信號。如果以MNP為ICA的標記材料，磁信號閱讀器能夠對整個NC膜上(約150 μm厚)MNPs的磁場進行定量[5]；而且，一般生物樣品中不含磁信號，背景信號低，因此靈敏度更高。MNP也促進了ICA由定性向定量發(fā)展，使檢測過程更加快速、準確、高效。Mu X H等[19]以MNP為標記材料，用磁敏傳感器檢測試紙條上相應位置的磁場強度，建立了一種檢測蓖麻毒素的ICA方法，該方法克服了樣品背景色的干擾，檢測限為1 ng/mL，能夠滿足水、土壤和食物等模擬樣品的檢測要求。Wang C等[29]建立了可準確測定血清中非結合雌三醇的MNP ICA方法，磁信號穩(wěn)定，結果與TrFM ICA方法有較好的相關性。

3 免疫層析技術的應用

3.1 獸藥殘留檢測

獸藥殘留問題與人體健康和環(huán)境安全息息相關，雖然我國對獸藥的休藥期和殘留限量作了規(guī)定，但獸藥的不規(guī)范使用、非法濫用現(xiàn)象依然存在。ICA技術對儀器的依賴性小，數(shù)分鐘內即可觀察檢測結果，適合即時檢驗(point-of-care testing，POCT)和大批量樣本初篩。顧娟紅等[30]制備了金磁復合微粒，并以此為標記物實現(xiàn)對鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的定性、定量檢測。對于二者的檢測限分別為0.25 ng/mL和0.5 ng/mL，特異性良好。金磁復合微粒兼有MNPs的磁性和納米金的光學性質，檢測結果既可以眼觀，也可通過磁定量分析儀快速定量，靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金方法有所提高。郭會燦[31]采用QD ICA技術快速檢測4種硝基呋喃類代謝物，對3-氨基-2-惡唑烷酮、1-氨基-2-乙內酰、氨基脲和5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮的檢測限分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L，交叉反應率在0.1%以下，能夠滿足常規(guī)檢測的要求。獸藥殘留一般采用競爭性ICA檢測，T線變淺或消失意味著樣品呈陽性。相比于消色，顯色無疑是一種更靈敏的方式，Sheng W等[32]以ZnCdSe/ZnS QDs作為熒光標記，金納米粒子作為淬滅劑，建立了一種檢測四環(huán)素類抗生素的ICA方法，在紫外燈照射下，T線的熒光強度與待測物含量成正比，該方法對于牛奶和動物肌肉組織中四環(huán)素類抗生素的檢測限分別是20 μg/L和40 μg/kg。

3.2 食品安全檢測

玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒毒B1(AFB1)等霉菌毒素一般存在于霉變的農作物中，動物源性食品中也常有檢出，采用ICA技術可以靈敏、快速的檢出食品中的霉菌毒素和其他有害物質。何方洋等[33]建立了檢測谷物中ZEN的膠體金ICA法，方法的檢測限為100 μg/kg，靈敏度為99%，特異性為94%。Yao X L等[34]以MNP作為信號標簽建立了一種用于檢測食品中17 β-雌二醇(17 β-estradiol,E2)的新型ICA方法，對于牛奶、對蝦、魚類和雞肉中17 β-雌二醇的最低檢測限是0.4 ng/mL。沙志聰?shù)萚7]采用QD標記的ICA檢測谷物中的赭曲霉毒素A，該方法的特異性良好，結果準確，檢測限為0.5 μg/L。激素類藥物有利于動物的生長和繁育，但食品中激素殘留超標可能導致人體的激素代謝紊亂或引起其他疾病。Yao X L等[34]以游離的抗17 β-雌二醇單克隆抗體作為檢測抗體，MNP標記的山羊抗小鼠IgG作為間接信號探針，建立了一種用于檢測食品中E2的新型ICA方法，對牛奶、對蝦、魚類和雞肉中E2的最低檢測限是0.4 ng/mL，靈敏度是常規(guī)競爭性ICA方法的5倍。

3.3 動物疾病診斷

病原微生物入侵動物機體后能夠刺激機體產生抗體，利用該原理可以對抗原進行檢測，診斷動物疾病。肖妍等[35]建立了一種檢測奶樣中布魯氏菌抗體的免疫層析方法，敏感性98.0%，特異性96.0%，與其他常見病原無交叉反應，適用于大批量樣本的篩選檢測和奶牛場布魯氏菌病的快速診斷。Bian H等[36]建立了一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的膠體金ICA方法，檢測限為0.47 μg/mL(5.9×103TCID50/mL)，與其他豬病病毒無交叉反應。

4 小結

ICA檢測過程簡便、快速，在獸藥殘留、食品安全、環(huán)境監(jiān)測以及動物疾病診斷等領域表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。高靈敏度、定量和高通量檢測是ICA方法的發(fā)展趨勢。熒光材料、MNPs和脂質體等開始代替膠體金，新型材料的使用對于靈敏度的提高有積極作用。ICA結果的評價方式也隨著檢測需求而變化，既可以通過肉眼觀察直接定性，也可以使用熒光定量儀、磁閱讀器或相關軟件準確定量。隨著新型標記材料的發(fā)展和定量分析儀器的應用，ICA技術也會得到巨大的提升，在POCT方面發(fā)揮更重要的作用。