數(shù)字PCR技術在動物疫病診斷中的應用進展

郭宏偉，趙緒永，李華瑋，張 震，馬 輝，鄭 鳴

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南鄭州 450011)

1985年，美國科學家Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)技術，使得在體外條件進行核酸片段的無限擴增成為可能，但是該方法存在操作繁瑣、交叉污染風險較高等不足。1992年，實時熒光定量PCR的誕生不僅一定程度上避免了傳統(tǒng)PCR技術的缺陷，還能夠通過熒光信號、Ct值和靶基因的起始濃度3個參數(shù)實現(xiàn)對擴增產物或基因的表達水平進行定量分析。但是，由于實時熒光定量PCR技術的絕對定量依賴于Ct值和標準曲線，使得所謂的“絕對定量”在一定程度上只是相對的。同時，盡管實時熒光定量PCR在敏感性上能比傳統(tǒng)PCR技術提高至少1個數(shù)量級，但是對于低拷貝的靶基因、模板差異倍數(shù)不大的情況下，實時熒光定量PCR技術的檢測敏感性和精確度會受到限制。隨著低豐度樣品檢測、基因突變檢測應用需求的日益增加，真正可以實現(xiàn)絕對定量的數(shù)字PCR技術應運而生[1]。本文主要針對數(shù)字PCR的發(fā)展歷史、技術原理、與實時熒光定量PCR相比的優(yōu)缺點以及在動物疫病診斷中的應用等方面進行綜述，以期為提升動物疫病分子診斷能力提供借鑒。

1 數(shù)字PCR的發(fā)展歷史

1999年，美國約翰·霍普金斯大學的Vogelstein B等[2]首次提出了數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction)的概念，并在96孔板和384孔板上實現(xiàn)對結腸癌的致癌突變基因Kras進行了定量分析。但是此時的數(shù)字PCR方法是比較原始的、需要大量手工操作的勞動密集型技術，難以廣泛應用[1]。隨著微流體技術和納米制造技術的進步，數(shù)字PCR技術也迎來了突破技術瓶頸的契機。2006年，F(xiàn)luidigm公司利用其微流控技術的優(yōu)勢推出了第一臺基于芯片的商品化數(shù)字PCR平臺，可將48個樣品分布在770個微反應單元中。Quanta Life公司利用油包水微滴生成技術開發(fā)的微滴式數(shù)字PCR技術也是最早出現(xiàn)的相對成熟的數(shù)字PCR平臺。2011年Quanta Life公司被Bio-Rad公司收購，其微滴數(shù)字PCR平臺更名為QX100TM型號繼續(xù)在市場進行銷售。Bio-Rad公司的微滴數(shù)字PCR平臺也是目前我國應用比較廣泛的一個品牌。2012年，Rain Dance公司推出的RaindropTM數(shù)字PCR設備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術移植到數(shù)字PCR技術平臺，適用于處理更大濃度差異的樣品類型。2013年，Life technologies公司推出了Quant Studio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用高密度的納升流控芯片技術，樣品被均勻分配至20 000個單獨的反應孔中，可以有效防止樣品交叉污染，簡化了操作步驟[3]。在我國《“十三五”國家科技創(chuàng)新規(guī)劃》中，已經(jīng)將“突破微流控芯片、單分子檢測、自動化核酸檢測等關鍵技術、開發(fā)全自動核酸檢測系統(tǒng)”作為一項國家戰(zhàn)略。近年來，我國的北京新羿生物科技有限公司、西安天隆科技有限公司、蘇州銳訊生物科技有限公司等多家公司已經(jīng)開始了數(shù)字PCR平臺的研發(fā)工作，相信不久的將來市場上就會有國產品牌的數(shù)字PCR出現(xiàn)。

2 數(shù)字PCR技術原理

數(shù)字PCR的原理可以理解為分散成無數(shù)個獨立反應單元的定量PCR，從而實現(xiàn)單分子意義上的絕對定量檢測，也可以將數(shù)字PCR采用的策略簡單地理解為對每個模板分子分別進行“單分子模板PCR擴增”。即將1個樣本稀釋并分成數(shù)百個甚至數(shù)百萬個獨立的反應單元，使得所有獨立的反應單元中包含或者不包含1個或多個拷貝的DNA模板分子，進而對所有獨立的反應單元進行平行擴增。數(shù)字PCR采用終點定量的方法進行分析，即在擴增結束后讀取各個反應單元的陰性或者陽性熒光信號并采用泊松分布的統(tǒng)計學方法進行分析，就可以計算出原始樣本的模板拷貝數(shù)[4]。

3 數(shù)字PCR的優(yōu)缺點

數(shù)字PCR的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：數(shù)字PCR是一種絕對定量的PCR技術，與實時熒光定量PCR相比，其定量過程不需要依賴標準曲線，當在缺乏合適的參考物或校準物的情況下進行定量時，數(shù)字PCR的這一優(yōu)勢就愈發(fā)明顯；數(shù)字PCR定量的精確性更高，但是當分析物中模板的濃度非常低時，會因為數(shù)字PCR反應體系中不同分區(qū)里模板的隨機分布差異而引起其精確性降低[5-6]；數(shù)字PCR反應體系中，分析物的目的序列被分配到多個獨立反應體系中，可以顯著降低背景信號和抑制物(如SDS、EDTA和肝素等)對反應過程的干擾，基質效應大大降低。數(shù)字PCR的這一優(yōu)勢在檢測環(huán)境樣品和糞便樣品時最為明顯[3,7-8]。

數(shù)字PCR的不足主要包括：數(shù)字PCR檢測的動態(tài)范圍受到最大分區(qū)數(shù)的限制，對于模板濃度過高的樣品需要預先對檢測樣品的模板進行適當?shù)南♂專荒承?shù)字PCR平臺的檢測通量比實時熒光定量PCR低，且操作步驟更加復雜；某些數(shù)字PCR平臺(如微滴數(shù)字PCR系統(tǒng))在對反應體系分區(qū)和數(shù)據(jù)讀取的時候存在引入污染的風險；除此之外，數(shù)字PCR使用過程中還需要專門的儀器和耗材，單次檢測的成本明顯比實時熒光定量PCR要高[7]。以Bio-Rad公司的QX200微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)為例，其單次檢測試劑和耗材的價格就高達180元人民幣。昂貴的儀器和試劑耗材是目前阻礙數(shù)字PCR技術大范圍推廣的主要瓶頸。

4 數(shù)字PCR技術在動物疫病診斷中的應用

4.1 病毒檢測

4.1.1 非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 核酸類檢測方法是目前非洲豬瘟診斷的主要方法，當檢測含有較多量病毒的唾液、血液、組織等樣品時，實時熒光定量PCR和等溫擴增等核酸檢測技術尚能夠勝任，但是在檢測飼料、食品、環(huán)境中微量的ASFV時，這些方法的敏感性就會存在一定的局限性。鄔旭龍等[9]以ASFV的K205R基因作為診斷靶標設計一對特異性引物和TaqMan探針，建立了診斷ASFV的實時熒光定量PCR和微滴式數(shù)字PCR檢測方法，該方法最低檢測限為約20拷貝/反應體系，敏感性比使用相同引物探針的實時熒光定量PCR高10倍，具有良好的敏感性和特異性，由于文章發(fā)表時ASFV并未傳入我國，作者未使用該方法對臨床陽性樣品的檢測效果進行評估。原霖等[10]基于《OIE陸生動物診斷與疫苗手冊》中的實時熒光定量PCR方法也建立了ASFV微滴數(shù)字PCR方法，該方法的最低檢測限可以到達0.8 copies/μL，敏感性高于OIE推薦的實時熒光定量PCR，與豬瘟病毒(Classical swine fever，CFSV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)等豬常見的6種病毒均不發(fā)生交叉反應，而且重復性較好。使用該微滴數(shù)字PCR與OIE推薦的實時熒光定量PCR同時對78份臨床病料進行檢測，符合率可以達到100%。鑒于數(shù)字PCR的高敏感性和對不同樣品中抑制成分的高耐受性，可以充分彌補實時熒光定量PCR在檢測飼料、食品、環(huán)境樣品中極低含量的ASFV時的不足，對于非洲豬瘟的防控具有重要意義。

4.1.2 豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV) 原霖等[11]以PCV1的ORF1基因作為診斷靶標，建立了可以對該病毒準確定量的微滴數(shù)字PCR方法，該方法的最低檢測限可達到7.8拷貝/20 μL，且與豬常見的病毒不發(fā)生交叉反應，在臨床樣品的檢測中檢測結果與實時熒光定量PCR結果一致。趙珊[12]以PCV2的ORF2基因為診斷靶標，建立了一種微滴數(shù)字PCR方法，不僅可用于豬血清和豬內臟組織等樣品的檢測，還可用于PCV2疫苗半成品中PCV2病毒含量的測定。該方法的最低檢測限為25拷貝/μL，其敏感性比實時熒光定量PCR高4倍，且不與PCV1、PRV、PPV、PRRSV和CSFV等豬易感的常見病毒發(fā)生交叉反應。使用上述兩種方法對PCV2疫苗半成品中的病毒含量進行檢測時，微滴數(shù)字PCR的檢測結果與傳統(tǒng)的TCID50方法測定的結果一致性更高。石磊等[13]針對PCV3的ORF2基因序列建立了用于該病毒檢測的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的最低檢測限達到4.4拷貝/μL，且與PCV1、PCV2、PRRSV、APP、PRV、PPV和CSFV等常見豬病病原無交叉反應。在進行臨床樣品的檢測時，PCV3微滴數(shù)字PCR方法比實時熒光定量PCR方法的靈敏度高10倍，其檢測結果不僅與實時熒光定量PCR的定性結果一致，還能夠對可疑的樣本進行定量分析，從而實現(xiàn)確診。除此之外，Liu Y等[14]和Zhang U等[15]也采用了微滴數(shù)字PCR平臺建立了針對PCV3的高敏感性檢測方法，最低檢測限分別達到1.68拷貝反應體系± 0.29拷貝/反應體系和1拷貝/μL。鑒于這些PCV3的檢測方法與前文中提到的類似，敏感性都優(yōu)于相應的實時熒光定量PCR并有良好的特異性，在此不做展開論述。

在多重檢測方面，Liu Y等[16]應用微滴數(shù)字PCR平臺建立了同時可以PCV2和PCV3的二重微滴數(shù)字PCR方法，該方法對于PCV2和PCV3的最低檢測限分別為2拷貝/μL和1拷貝/μL，比對應的二重實時熒光定量PCR技術要分別敏感3倍和10倍。在對300份臨床樣品進行檢測時，對PCV2的檢測結果微滴數(shù)字PCR方法與實時熒光定量PCR一致，而對PCV3的檢測，微滴數(shù)字PCR方法多檢測到了3份臨床樣品。由于PCV對養(yǎng)豬業(yè)的危害較大，以及新發(fā)現(xiàn)的PCV3引起人們的高度重視，在各種動物疫病的數(shù)字PCR檢測方法中，PCV數(shù)字PCR檢測方法的研究數(shù)量是最多的。這些單項和多重數(shù)字PCR的建立，也為未來PCV的實驗室檢測水平的提升提供了有力的技術保障。

4.1.3 偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 為建立用于PRV檢測的微滴數(shù)字PCR方法，陳亞娜等[17]以PRV的gB基因作為靶基因，建立了可對其準確定量的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的最低檢測限為6.1拷貝/μL，比實時熒光定量PCR方法的敏感性高25倍，且特異性良好。在對臨床樣品的檢測中，該微滴數(shù)字PCR方法與病毒分離相比，符合率為97%。蘭德松等[18]分別針對PRV的gD和gE基因，設計了2對特異性引物和探針，建立了分別針對PRV gD和gE基因的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的對gD和gE基因的最低檢測限分別為3.9拷貝/μL和2.3拷貝/μL，比相應的檢測gD和gE基因的實時熒光定量PCR敏感性分別高10倍和5倍。同時，該方法的特異性好，批內和批間重復性的變異系數(shù)都較小，與實時熒光定量PCR方法的符合率為95.6%。值得注意的是，蘭德松等建立的針對gD和gE基因的檢測方法是兩個獨立的微滴數(shù)字PCR反應體系中進行的，如果能夠進一步優(yōu)化建立同時檢測這兩個基因的二重微滴數(shù)字PCR方法，將具有更高的應用價值。

4.1.4 其他動物病毒 Yang Q等[19]基于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF7建立了微滴數(shù)字PCR方法，該方法比實時熒光定量PCR敏感10倍左右，對125份疑似感染PRRSV的臨床樣品的檢測結果中，微滴數(shù)字PCR方法比實時熒光定量PCR多檢測出9份陽性樣品。

Wu X等[20]建立了用于日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)檢測的微滴數(shù)字PCR方法，該方法的最低檢測限可以達到2拷貝/20 μL，比實時熒光定量RT-PCR敏感100倍，且具有較好的特異性。在對103份豬臨床樣品的檢測中，微滴數(shù)字PCR的陽性檢出率比實時熒光定量PCR高了10.7%，這意味著該方法能夠檢測出更高效的對臨床樣品進行檢測。

除目前已發(fā)表的上述用于檢測動物病毒的數(shù)字PCR方法，中國動物疫病預防控制中心等單位也起草了《高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒微滴式數(shù)字RT-PCR檢測方法(T/CVMA6-2018)》《豬繁殖與呼吸綜合征病毒微滴式數(shù)字RT-PCR檢測方法(T/CVMA7-2018)》《動物A型流感病毒微滴式數(shù)字RT-PCR檢測方法(T/CVMA8-2018)》和《豬圓環(huán)病毒1型微滴式數(shù)字PCR檢測方法(T/CVMA9-2018)》《豬圓環(huán)病毒2型微滴式數(shù)字PCR檢測方法(T/CVMA10-2018)》《偽狂犬病病毒微滴式數(shù)字PCR檢測方法(T/CVMA11-2018)》等多個中國獸醫(yī)協(xié)會的團體標準。這些團體標準的發(fā)布，說明數(shù)字PCR技術在動物疫病診斷中的重要作用正在得到整個行業(yè)越來越多的認可。

4.2 細菌檢測

和病毒檢測的數(shù)字方法相比，用于細菌檢測的數(shù)字PCR的報道較少。石磊等[21]針對鏈球菌(Streptococcussuis，SS)中gdh基因的保守序列建立了可以對該細菌精確定量的微滴數(shù)字PCR方法，使用陽性質粒對該方法最低檢測限測定的結果為2.69拷貝/μL。同時該方法也具有較好的特異性，與常見的病原菌如大腸埃希氏菌、沙門氏菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌以及豬圓環(huán)病毒2型和偽狂犬病病毒等均無交叉反應。

為了建立高敏感性的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)檢測方法，石磊等[22]針對該細菌特異性基因apxⅣ的保守序列建立了微滴數(shù)字PCR方法，其最低檢測限為153.8拷貝/μL，比實時熒光定量PCR的敏感性提高兩倍，與其他常見豬病原無交叉反應。110份臨床樣品的檢測中，該方法與實時熒光定量PCR檢測結果的Kappa系數(shù)為0.952 9，表明這兩種方法檢測結果的一致性高，并且微滴數(shù)字PCR可對實時熒光定量PCR無法判定的可疑樣本進行定量分析。

石磊等[23]學者還基于副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)中OMP P2基因的保守序列建立了可對該細菌準確定量的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的敏感性高，最低檢測限可達到2.65拷貝/μL，高于實時熒光定量PCR方法。特異性方面，該微滴數(shù)字PCR方法與多種豬常見的細菌性和病毒性病原均無交叉反應。通過對臨床樣品的檢測結果表明，該微滴數(shù)字PCR方法具有敏感性高、特異性好的優(yōu)點，其檢出率高于實時熒光定量PCR方法。

除此之外，郭瑛等[24]基于布魯氏菌的IS711插入基因的保守序列還建立了針對布魯氏菌檢測的微滴式數(shù)字PCR方法。通過使用該方法對從一名在布魯氏菌病急性期感染期且經(jīng)過抗生素治療6周后仍有臨床癥狀的患者的血清中檢測到了布魯氏菌的核酸，而對該患者的血液進行分離培養(yǎng)也顯示為陽性。鑒于血清中數(shù)字PCR檢測結果與血液樣品分離培養(yǎng)結果吻合，可以看出數(shù)字PCR技術在布魯氏菌病患者治療效果判定中具有一定的應用價值。由于布魯氏菌是一種人獸共患病原，該方法在動物布魯氏菌病的診斷中，尤其是在檢測大罐奶樣品、養(yǎng)殖場環(huán)境樣品等病原含量較低的樣品時也具有一定的應用價值。

4.3 寄生蟲檢測

近年來，寄生蟲病數(shù)字PCR診斷方法的研究也較多，但是絕大多數(shù)研究是針對人類易感的寄生蟲病原的檢測[25]。在動物疫病相關寄生蟲的數(shù)字PCR檢測技術中，研究最多的日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)。Weerakoon K G等[26]基于日本血吸蟲的逆轉錄轉座子sjR2和nad1基因建立了一種用于日本血吸蟲核酸檢測的雙重微滴數(shù)字PCR方法。該方法的最低檢測限可以達到0.05 fg模板DNA，遠低于單個日本血吸蟲蟲卵的總DNA含量(約50 pg)。該方法與曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)、豬帶絳蟲(Taeniasolium)、肝片吸蟲(Fascioliasishepatica)、縮小膜殼絳蟲(Hymenolepisdiminuta)和細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)均無交叉反應。VAN Dorssen C E等[27]采用數(shù)字PCR方法和實時熒光定量PCR方法對山羊糞便中的日本血吸蟲蟲卵的核酸進行檢測，結果數(shù)字PCR檢測的陽性率為46.4%，而實時熒光定量PCR僅為6.9%。這說明數(shù)字PCR技術可以作為日本血吸蟲診斷和檢測的重要技術手段，尤其是流行率較低的地區(qū)。相比于低敏感性的顯微鏡觀察蟲卵法和低特異性的血清學檢測方法，數(shù)字PCR方法可以對多種宿主樣品(如糞便、血清、尿液和唾液)中微量的寄生蟲DNA進行檢測，極大地提高了檢測的敏感性和準確性。數(shù)字PCR技術的出現(xiàn)為提高寄生蟲病診斷水平提供了必要的技術手段。

5 展望

作為最新一代的PCR檢測技術，數(shù)字PCR相比實時熒光定量PCR有著無以比擬的巨大優(yōu)勢，比如更高的敏感性和準確度，能夠實現(xiàn)絕對定量等。目前該技術已經(jīng)在醫(yī)學診斷、轉基因定量分析、物種鑒定、食品安全等越來越多的領域得到應用。盡管由于較高的成本和比較繁瑣的操作步驟使得數(shù)字PCR目前還無法完全替代實時熒光定量PCR方法，但是隨著技術的進步和商品化的發(fā)展，相信不久的將來，數(shù)字PCR技術一定能夠在動物疫病診斷領域發(fā)揮越來越重要的作用。