枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道發(fā)育、腸道菌群和Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

郭聰聰 李艷茹 耿 萌 蓋塞倫 張滕勛 齊 威 李中媛 宋亞囝 羅學(xué)剛 張同存 王 楠*

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，教育部工業(yè)發(fā)酵微生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，天津300457；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制工程研究中心，天津300457)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，屬于芽孢桿菌屬，能夠耐高溫、耐擠壓、耐酸堿、耐胃腸道中各種酶，從而有效地定植于腸道內(nèi)，消耗腸道環(huán)境中的游離氧，造成厭氧環(huán)境，對動物生長和健康產(chǎn)生積極影響[1-2]。哺乳動物及禽類出生后的早期階段是腸道菌群定植的關(guān)鍵時期，對早期生長和腸道發(fā)育有重要作用[3]。目前對枯草芽孢桿菌的研究大多集中在其對斷奶后動物的生長性能、腸道發(fā)育及腸道微環(huán)境的研究，對于斷奶之前腸道菌群的定植以及作用機(jī)制的研究相對較少。因此，研究枯草芽孢桿菌對動物早期的生長、腸道發(fā)育和功能成熟、腸道菌群的影響及潛在的作用機(jī)制具有重要意義，可為今后的動物生產(chǎn)中由液體母乳喂養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)檫m口性較差的固體飼糧添加劑中科學(xué)、安全、有效地使用枯草芽孢桿菌提供理論依據(jù)。研究表明，25日齡仔豬飼糧中添加枯草芽孢桿菌WEI-62可以提高其生長性能，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低料重比，調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)[4]?？莶菅挎邨U菌PB6對7日齡宮內(nèi)生長遲緩的仔豬的生長、腸道發(fā)育和屏障功能、消化功能以及免疫功能有一定的改善作用[5]。補(bǔ)充枯草芽孢桿菌DSM32315可以改善42日齡肉仔雞的生長性能和腸道結(jié)構(gòu)，提高肉仔雞的平均體重和平均日增重，提高回腸絨毛長度和絨毛長度/隱窩深度[6]。Li等[7]發(fā)現(xiàn)，從藏牦牛中分離的枯草芽孢桿菌18能提高15日齡小鼠的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，改善黏膜形態(tài)。

Wnt信號通路的激活是腸上皮細(xì)胞分化和干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持所必需的[8]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能夠刺激基質(zhì)細(xì)胞和潘氏細(xì)胞分泌Wnt3配體，之后通過Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)途徑促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和腸上皮細(xì)胞的發(fā)育[9]。由此可見，益生菌可能對Wnt信號的激活產(chǎn)生一定的影響，從而調(diào)控腸道干細(xì)胞的增殖和分化。而枯草芽孢桿菌是否能夠影響腸道干細(xì)胞的增殖和分化，是否能激活Wnt信號通路目前尚未見相關(guān)報道。本實驗室前期從健康新生兒糞便中分離到1株枯草芽孢桿菌RZ001，證實其能夠在小鼠的腸道內(nèi)定植、增強(qiáng)腸黏膜屏障功能、改善葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[10]。但是枯草芽孢桿菌RZ001是否影響動物的早期生長發(fā)育、腸道菌群及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。因此，本試驗選用剛出生的小鼠乳鼠，旨在研究枯草芽孢桿菌對乳鼠的早期生長、腸道發(fā)育和功能成熟、腸道菌群及Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而揭示枯草芽孢桿菌影響動物早期腸道發(fā)育、功能成熟和腸道菌群的潛在作用機(jī)制，為今后動物飼料添加劑中科學(xué)、有效地使用枯草芽孢桿菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、動物、細(xì)胞、試劑和儀器

1.1.1 菌種、動物、細(xì)胞

枯草芽孢桿菌RZ001分離自健康新生兒糞便，經(jīng)16S rDNA測序為枯草芽孢桿菌(GenBank登錄號: NC 000964)，并保藏于中國微生物菌種保藏中心(保藏編號：CGMCC 17116)。

雄性和雌性無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠(8周齡)購買于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(北京)。小鼠在控制條件(25 ℃、55%濕度、12 h光/暗循環(huán))下自由采食基礎(chǔ)飼糧，充分飲水，每2 d更換1次鼠料和墊料。所有動物試驗均按照天津科技大學(xué)試驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29(ATCC HTB-38)由本實驗室保藏。使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，24 h后換液，以后每2～3 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞長滿后，用2.5 g/L胰酶消化后傳代。

1.1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol試劑，北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green qPCR Master mix，DBI Bioscience公司；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、兔抗人β-catenin一抗，美國Santa Cruz公司；IRDye-800標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、IRDye-680標(biāo)記山羊抗兔二抗，美國Li-COR公司；小鼠黏蛋白2(mucin 2，MUC2)檢測試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 儀器

多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)，美國LI-COR公司；Stepone Plus實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；DG-250厭氧培養(yǎng)箱，英國Don Whitley Scientifi(DWS)公司；正置熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 試驗設(shè)計

在準(zhǔn)備試驗階段，將來自同一窩產(chǎn)的2只雌性小鼠、1只雄性小鼠置于同一籠中，直至分娩前1～3 d。產(chǎn)下的乳鼠由雌性小鼠自由喂養(yǎng)。正式試驗階段，從新出生的乳鼠中選擇4窩窩仔數(shù)量相同的乳鼠，并將它們分為2個組(試驗組和對照組)，每組2個重復(fù)。從出生后第2天開始，試驗組乳鼠連續(xù)14 d灌胃10 μL枯草芽孢桿菌RZ001(1×107CFU/d)，對照組乳鼠連續(xù)14 d灌胃10 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3 樣品采集

每天記錄乳鼠體重。出生后第16天頸椎脫臼處死乳鼠，取肝臟、腎臟、脾臟、胸腺稱重，計算器官指數(shù)：

器官指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100。

迅速剪取小腸組織回腸段約2 cm，用生理鹽水沖洗干凈后在4%多聚甲醛溶液中固定，之后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫(AB-PAS)染色。剩余小腸組織分段放于離心管中，液氮中速凍后置于-80 ℃冷凍保藏用于后續(xù)試驗檢測。取下整個盲腸，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱中保存，用于測定盲腸內(nèi)容物中微生物組成。

1.4 HE染色測定腸道黏膜形態(tài)

將多聚甲醛溶液中固定的小腸段取出，流水沖洗，進(jìn)行梯度無水乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)、展片、烤片，進(jìn)行HE染色。將帶有小腸組織的載玻片在二甲苯溶液中脫蠟，梯度無水乙醇復(fù)水，蘇木精染色，伊紅復(fù)染，梯度無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。所有標(biāo)本均在正置顯微鏡下觀察并拍照記錄。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組選取5張切片，每張切片計數(shù)4個視野中的絨毛個數(shù)，并取平均值，計算絨毛密度；每張切片選取6～8根絨毛和隱窩測量腸絨毛長度及隱窩深度，計算平均值，并計算絨毛長度/隱窩深度。

1.5 AB-PAS染色測定腸道組織杯狀細(xì)胞數(shù)量

將帶有小腸組織的常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，阿利新藍(lán)染色液染色20 min，蒸餾水洗，過碘酸溶液氧化5 min，水洗，Schiff染色液浸染20 min，水洗10 min，可選用蘇木素染色液染核1～2 min，分化、返藍(lán)、水洗，逐級無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色結(jié)果為杯狀細(xì)胞呈藍(lán)色(含酸性黏蛋白)、深紅/紅紫色(含中性黏蛋白)及深淺不同的紫色(同時含酸性和中性黏蛋白)。所有切片在正置熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行杯狀細(xì)胞計數(shù)，每組選取5張AB-PAS染色的石蠟切片，每張切片隨機(jī)取4個視野，統(tǒng)計杯狀細(xì)胞的數(shù)目，對計數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 實時熒光定量PCR測定基因mRNA相對表達(dá)量

小腸組織經(jīng)液氮研磨之后采用Trizol法提取總RNA，并用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成2 μg cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為25 μL。實時熒光定量PCR檢測目的基因mRNA相對表達(dá)量。PCR擴(kuò)增體系20 μL：qPCR master mix 10 μL，50×ROX 0.4 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，無菌蒸餾水7.6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s繪制熔解曲線。以GAPDH作為參考基因，2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。目的基因的引物序列見表1。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定MUC2含量

將小腸組織樣品從-80 ℃冰箱中取出平衡至室溫，按1∶10(質(zhì)量∶體積)的比例加入無菌pH 7.2的1×PBS，在4 ℃下用組織勻漿器破碎成粉末，于4 ℃、2 000 r/min離心20 min，取上清液，檢測MUC2含量。檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作如下：在96孔板中加入100 μL待測組織樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃溫育2 h；棄掉液體，加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，37 ℃溫育1 h；棄掉液體洗板之后，每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，37 ℃溫育1 h；棄掉液體洗板并加入90 μL反應(yīng)底物，37 ℃避光顯色30 min之后加入50 μL終止液終止反應(yīng)，在450 nm波長測定光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣本中MUC2含量。

表1 基因的引物序列

1.8 蛋白免疫印跡(Western blotting)法測定β-catenin蛋白相對表達(dá)量

枯草芽孢桿菌RZ001條件培養(yǎng)基的制備按文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。將保存在-80 ℃冰箱中的枯草芽孢桿菌RZ001常溫下解凍，按2%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化，經(jīng)過2次活化，終接菌于100 mL培養(yǎng)基中，同時以100 mL空白培養(yǎng)基為對照組，12 h后離心，取上清液，50 ℃旋蒸1.5 h左右，倒入玻璃培養(yǎng)皿中，放入-80 ℃冰箱24 h，于凍干機(jī)中凍干處理。凍干樣品重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中。

HT-29細(xì)胞以1×104mL/個的密度均勻鋪種在6孔板中培養(yǎng)2 d，加入5 mg/mL制備的枯草芽孢桿菌RZ001條件性培養(yǎng)基處理24 h后，收集總蛋白。蛋白進(jìn)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，浸入封閉液中封閉1 h。分別加稀釋后的β-catenin一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶3 000)，在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下分別用山羊抗兔(1∶10 000)和山羊抗鼠(1∶10 000)二抗避光孵育1.5 h，利用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.9 實時熒光定量PCR測定盲腸微生物種群豐度

將盲腸內(nèi)容物從-80 ℃冰箱中取出在冰上解凍，利用糞便基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。按照文獻(xiàn)[11]中報導(dǎo)的腸道微生物種群相對豐度檢測方法，利用實時熒光定量PCR測定腸道組織樣本中擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)在總菌中所占的比例。PCR反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系與測定目的基因mRNA水平表達(dá)條件相同。所用的引物序列參考文獻(xiàn)[12-14]，細(xì)菌種群的引物序列見表2。測定結(jié)果通過2-ΔΔCt法計算，與細(xì)菌總16S rDNA進(jìn)行比較，數(shù)值顯示為細(xì)菌總16S rDNA的相對豐度。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計及差異性分析。采用t檢驗比較2組間的統(tǒng)計學(xué)差異，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表2 細(xì)菌種群的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠體重和器官指數(shù)的影響

如圖1所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠從出生后第2天到第8天體重顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)。如表3和表4所示，與對照組相比，試驗組的脾臟、腎臟、胸腺重量和指數(shù)顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)，但肝臟重量和指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。以上數(shù)據(jù)表明，枯草芽孢桿菌RZ001可以促進(jìn)乳鼠的早期生長，但對后期的體重增加無顯著影響。

“A”表示與對照組差異極顯著(P<0.01)，“a”表示與對照組差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸黏膜形態(tài)的影響

如圖2所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸上皮細(xì)胞微絨毛長短一致、排列整齊且更加致密。此外，如表5所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠絨毛密度和絨毛長度均顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)，隱窩深度極顯著降低(P<0.01)，絨毛長度/隱窩深度極顯著增加(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)表明，枯草芽孢桿菌RZ001可以改變?nèi)槭笮∧c黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.3 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道黏膜屏障、緊密連接形成的影響

如圖3所示，AB-PAS染色結(jié)果表明，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯較多；數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

如圖4所示，利用實時熒光定量PCR和ELISA方法觀察到試驗組的乳鼠小腸中MUC2的mRNA相對表達(dá)量和MUC2含量均較對照組顯著增加(P<0.05)。

如圖5所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸中緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)、閉鎖蛋白(occludin，Ocln)、封閉蛋白-3(claudin-3，Cldn-3)的mRNA相對表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)。

以上數(shù)據(jù)表明，枯草芽孢桿菌RZ001能夠促進(jìn)乳鼠腸黏膜屏障的完整以及緊密連接的形成，從而促進(jìn)腸道屏障功能的成熟。

表4 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠器官指數(shù)的影響

圖2 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(HE染色)

2.4 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠Wnt信號通路相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖6所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠Wnt3、卷曲受體蛋白7(frizzled 7，F(xiàn)zd7)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein 5，Lrp5)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，Gsk-3β)、Ctnnb1、細(xì)胞性骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，C-myc)、軸蛋白抑制蛋白2(Axin2)和無張力同系物1(atonal homolog 1，Atoh1)的mRNA相對表達(dá)量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，但低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein 6，Lrp6)的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。此外，與對照組相比，試驗組的乳鼠腸道干細(xì)胞(intestinal stem cells，ISCs)標(biāo)記物富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5)和Ki67的mRNA相對表達(dá)量也顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。以上結(jié)果提示，枯草芽孢桿菌RZ001激活了乳鼠Wnt信號通路及靶基因的轉(zhuǎn)錄。

2.5 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸β-catenin蛋白相對表達(dá)量的影響

如圖7所示，與對照組相比，試驗組的乳鼠小腸β-catenin蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌RZ001促進(jìn)β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的積累，β-catenin隨后進(jìn)入細(xì)胞核中激活Wnt信號通路靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.6 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道菌群相對豐度的影響

如表6所示，門水平上，與對照組相比，試驗組的乳鼠盲腸中擬桿菌門的相對豐度顯著增加(P<0.05)，而厚壁菌門的相對豐度顯著降低(P<0.05)。屬水平上，與對照組相比，試驗組的乳鼠盲腸中雙歧桿菌屬的相對豐度極顯著增加(P<0.01)，乳桿菌屬的相對豐度也有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；而產(chǎn)氣莢膜梭菌的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，大腸桿菌的相對豐度也有所降低，但差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌RZ001可以調(diào)控乳鼠腸道微生物群的相對豐度。

表5 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖3 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響(AB-PAS染色)

A：實時熒光定量PCR分析小腸中MUC2的mRNA相對表達(dá)量；B：ELISA法分析小腸中MUC2含量。

圖5 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠生長的影響

遺傳、品種、疾病、飼糧結(jié)構(gòu)、飼養(yǎng)方式及環(huán)境濕度等因素都可以影響動物體重的增長。大量的研究結(jié)果表明，動物飼糧中添加一定量的益生菌制劑可以改善動物的生長性能[15]?？莶菅挎邨U菌是一種在飼料工業(yè)及畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用的益生菌?？莶菅挎邨U菌對腸細(xì)胞具有很強(qiáng)的黏附性，通過消耗腸內(nèi)氧氣在腸道微生態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，從而創(chuàng)造厭氧環(huán)境[16]。研究表明，枯草芽孢桿菌在胃腸道中的孢子萌發(fā)可以獨(dú)立進(jìn)行，也可以與小腸中的其他腸道微生物聯(lián)合進(jìn)行[17-18]。一些芽孢桿菌物種通過調(diào)節(jié)免疫功能來防止病原體感染，從而改善豬的腸道健康[19]。飼糧中添加枯草芽孢桿菌PB6能夠提高斷奶仔豬的生長速度、腸道發(fā)育和免疫功能[5]。本研究表明，枯草芽孢桿菌RZ001能夠顯著增加乳鼠早期的體重(出生后第2天到第8天)，同時顯著增加脾臟、腎臟、胸腺等器官指數(shù)，這些結(jié)果表明枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠的生長產(chǎn)生積極作用。

圖6 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸Wnt信號通路相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響

圖7 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠小腸β-catenin蛋白相對表達(dá)量的影響

3.2 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道發(fā)育的影響

小腸是動物機(jī)體消化與吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，小腸的消化吸收能力直接受到小腸絨毛長度和隱窩深度的影響[7]。絨毛長度增加，隱窩深度變淺，可以增加小腸與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，進(jìn)而增強(qiáng)小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收能力[4,15]。絨毛長度、絨毛長度/隱窩深度越高，說明小腸消化吸收能力強(qiáng)。已有研究發(fā)現(xiàn)動物飼糧中添加枯草芽孢桿菌可改善小鼠、斷奶仔豬、肉雞、肉牛、羔羊、鵝等動物的腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)小腸絨毛發(fā)育。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)18 d補(bǔ)充枯草芽孢桿菌可以改善15日齡小鼠的黏膜形態(tài)，增加絨毛與隱窩細(xì)胞的比例。研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬補(bǔ)充枯草芽孢桿菌可以顯著增加回腸絨毛長度，顯著降低回腸隱窩深度，極顯著增加回腸絨毛長度/隱窩深度[15,20]。鐘光等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著降低肉仔雞空腸的隱窩深度，改善肉雞空腸黏膜形態(tài)。本研究結(jié)果表明，乳鼠連續(xù)14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001后，小腸絨毛密度和絨毛長度顯著增加，而隱窩深度顯著降低，絨毛長度/隱窩深度顯著增加。

MUC2是腸上皮杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的一種黏蛋白，它是腸上皮黏液層的主要結(jié)構(gòu)成分，能夠保護(hù)腸上皮免受化學(xué)和微生物損傷。腸道黏液中MUC2分子受到破壞會增加腸黏膜通透性，進(jìn)而腸道中的毒素和病原微生物與上皮細(xì)胞的接觸增加，導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道損傷和炎癥反應(yīng)[22]。Shen等[23]發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)仔豬MUC2合成減少，腸黏膜屏障功能減弱，因而仔豬易患壞死性結(jié)腸炎。MUC2-/-小鼠因缺乏保護(hù)性黏膜屏障，使得宿主腸上皮直接與腸道菌群接觸，最終導(dǎo)致小鼠發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎[24]。已有文獻(xiàn)證實枯草芽孢桿菌能增加小鼠[25]和肉雞[26]的MUC2含量，防止腸黏膜損傷，促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)。Zhang等[25]利用AB-PAS染色證實枯草芽孢桿菌處理的小鼠MUC2的mRNA相對表達(dá)量增加。飼糧添加枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞腸道中MUC2的mRNA相對表達(dá)量[26-27]。本研究結(jié)果表明，乳鼠連續(xù)14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001后小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增加，小腸MUC2含量顯著提高。

緊密連接蛋白的形成對防止細(xì)菌和抗原細(xì)胞旁擴(kuò)散具有重要意義，一些重要的上皮性緊密連接蛋白，如ZO-1、Ocln和Cldn-3，有助于維持腸上皮屏障的完整性，對腸黏膜損傷的修復(fù)和腸道健康具有重要意義[28]。Gong等[29]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌通過上調(diào)閉合蛋白-1(claudin-1)、Ocln、連接黏附分子-A(JAM-A)和ZO-1等緊密連接蛋白的表達(dá)改善小鼠腸道屏障功能，減少腸道上皮損傷，減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎?？莶菅挎邨U菌HB3通過促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá)從而改善豬上皮屏障功能[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳鼠連續(xù)14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001提高了小腸中ZO-1、Ocln、Cldn-3的mRNA相對表達(dá)量，表明枯草芽孢桿菌RZ001能在早期提高乳鼠小腸緊密連接的形成以及改善腸屏障功能。這些結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌RZ001能夠促進(jìn)腸屏障功能的成熟。

表6 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道菌群相對豐度的影響

3.3 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠Wnt信號通路介導(dǎo)的上皮細(xì)胞生長分化的影響

典型Wnt/β-catenin信號通路對腸隱窩基底部ISCs的存活和維持具有重要意義。腸道隱窩的分裂是由Wnt信號介導(dǎo)的，用Wnt激動劑局部治療可促進(jìn)腸道生長。Wnt3是一種經(jīng)典的Wnt信號配體，與受體Fzd7和共受體Lrp5/6結(jié)合，阻止β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的降解，從而積聚并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核[31]。隨后，靶基因Lgr5、C-myc、Axin2和Atoh1被轉(zhuǎn)錄激活[32]。本研究證實，乳鼠連續(xù)14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001顯著上調(diào)了乳鼠小腸Wnt3、Fzd7、Lrp5、Gsk-3β、Ctnnb1、C-myc、Axin2和Atoh1的mRNA相對表達(dá)量。此外，枯草芽孢桿菌RZ001也能夠增加小腸β-catenin的蛋白相對表達(dá)量。這些結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌RZ001可能通過激活Wnt信號通路促進(jìn)腸道發(fā)育，且Lrp5可能是一個必需的共受體。近年來，一些學(xué)者報道了其他益生菌對腸道發(fā)育和ISCs生長分化的影響。新生小鼠體內(nèi)鼠李糖桿菌GG(LGG)定植促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和分化[33]。乳桿菌D8通過加速ISCs再生從而保護(hù)腸黏膜的完整性，改善DSS誘導(dǎo)的腸黏膜損傷[34]。雙歧桿菌和乳酸桿菌促進(jìn)ISCs的增殖以及腸上皮細(xì)胞的再生[9]。而枯草芽孢桿菌是否能影響腸道干細(xì)胞的生長分化，是否能激活Wnt信號通路目前尚未見相關(guān)報道。在本研究中，乳鼠連續(xù)14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001可增加小腸組織中ISCs標(biāo)記物L(fēng)gr5和Ki67的mRNA相對表達(dá)量，暗示其促進(jìn)新生小鼠腸道發(fā)育、腸道屏障成熟和細(xì)胞增殖的作用可能是通過激活Wnt信號通路進(jìn)而促進(jìn)ISCs介導(dǎo)的上皮細(xì)胞生長分化而實現(xiàn)的。

3.4 枯草芽孢桿菌RZ001對乳鼠腸道菌群的影響

腸道微生物的早期定植是維持和調(diào)節(jié)腸道屏障功能的必要條件[35]。腸道共生菌群通過促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖以及改善腸上皮完整性參與屏障功能的維持[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳鼠連續(xù)14 d灌胃枯草芽孢桿菌RZ001能夠增加乳鼠盲腸中擬桿菌門、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對豐度，降低厚壁菌門、大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的相對豐度。與本研究結(jié)果相似，Yang等[37]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充枯草芽孢桿菌KT260179顯著增加了昆明小鼠盲腸中有益細(xì)菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，而顯著減少了條件致病菌大腸桿菌的數(shù)量。枯草芽孢桿菌18可以增加小鼠腸道中乳酸桿菌的數(shù)量[7]。已有報道證實乳酸桿菌和雙歧桿菌產(chǎn)生的乳酸可以通過激活Paneth和腸基質(zhì)細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)ISCs介導(dǎo)的上皮細(xì)胞的發(fā)育[34]。而枯草芽孢桿菌RZ001可以增加乳酸產(chǎn)生菌的相對豐度，這可能是其發(fā)揮作用的主要原因。因此，枯草芽孢桿菌RZ001可能通過增加乳酸產(chǎn)生菌在腸道內(nèi)的早期定植，促進(jìn)ISCs介導(dǎo)的腸上皮發(fā)育和成熟。

4 結(jié) 論

早期應(yīng)用枯草芽孢桿菌RZ001能夠促進(jìn)乳鼠生長，改善腸道形態(tài)，促進(jìn)腸道屏障功能成熟，從而促進(jìn)早期腸道發(fā)育。早期應(yīng)用枯草芽孢桿菌RZ001還能夠激活乳鼠的Wnt信號通路，降低腸道致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的相對豐度，增加腸道益生菌雙歧桿菌屬的相對豐度。

致謝：

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