生防菌KD-16J的鑒定及其對番茄灰霉病的抑制作用

王笑笑，季小詩，劉芳，趙月，郭紅蓮

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

番茄，又名西紅柿，其味道酸甜可口，富含維生素、番茄紅素以及多種微量元素，具有極高的營養(yǎng)保健作用，有“蔬菜中的水果”之稱[1]，2018年全球種植面積達(dá)到4.76×106hm2[2]。然而，番茄在貯運(yùn)期間由于機(jī)械損傷、植物組織衰老等處于易受各種真菌侵染的狀態(tài)[3]，經(jīng)常造成大量經(jīng)濟(jì)損失。其中，引發(fā)果實(shí)灰霉病的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是最具破壞性的真菌之一[4-5]，嚴(yán)重制約著番茄果實(shí)貯運(yùn)和保鮮業(yè)的發(fā)展。盡管化學(xué)合成殺菌劑是目前最有效、最常用的控制采后病害的方法，但毒性更小、更不易產(chǎn)生抗藥性的生物防治技術(shù)近年來更加受到人們的青睞，尤其是將酵母作為拮抗劑應(yīng)用到采后果蔬中[6-7]。

拮抗酵母菌能夠通過營養(yǎng)和空間的競爭、重寄生、分泌抑菌物質(zhì)和提高宿主的抗性等[8]作用方式對多種植物病原菌產(chǎn)生抑制作用，目前已被國內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注。Zhang等[9]分離篩選出了一株對梨青霉病具有很好防治的菌株，經(jīng)鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；Meng 等[10]發(fā)現(xiàn)在葡萄采前噴施羅倫隱球酵母（C.laurentii）并結(jié)合殼聚糖的使用，可有效防止葡萄腐爛變質(zhì)；Paiva等[11]發(fā)現(xiàn)酵母菌與氣調(diào)包裝聯(lián)合應(yīng)用對櫻桃果實(shí)采后青霉病具有一定的抑制效果。除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)畢赤酵母對蘋果采后青霉病及番茄采后根霉果腐病具有很好的抑制作用[12-14]，膜醭畢赤酵母和殼聚糖復(fù)合處理對柑橘果實(shí)炭疽病具有很好的抑制作用[15]。

本文通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化以及內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列分析對菌株KD-16J進(jìn)行鑒定，并以該菌株為出發(fā)菌株，研究其在離體平板和番茄果實(shí)上對灰葡萄孢菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄：選取大小一致、色澤飽滿、無機(jī)械損傷和病蟲害的番茄果實(shí)作為試驗(yàn)材料，清洗后用2%（體積分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉進(jìn)行消毒（浸泡2 min），自來水充分沖洗2 min，放置在通風(fēng)處晾干備用。

灰葡萄孢菌：按組織分離法[16]從具有灰霉病的番茄上分離純化和保存。

生防菌KD-16J：天津科技大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品物流保鮮與加工研究室提供，經(jīng)ICR小鼠毒性經(jīng)口試驗(yàn)無急性毒性。

瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、蔗糖、尿素、硫酸銨、硝酸銨、（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乳糖（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

立式圧力蒸氣滅菌鍋（YXQ-LS-500）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈操作臺（ZHJH-CII09B）：上海智城分析儀器制造有限公司；迷你雙垂直電泳儀（DZCZ-24DN）：鼎國生物技術(shù)有限公司；基因擴(kuò)增儀（BLD8-PCR-2）：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生防菌KD-16J的鑒定

1.3.1.1 生防菌KD-16J形態(tài)特征觀察

參照馬巖石等[17]的方法，觀察生防菌KD-16J在PDA液體和固體培養(yǎng)基中的形態(tài)特征。

1.3.1.2 生防菌KD-16J生理生化試驗(yàn)鑒定

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[18]對菌株KD-16J進(jìn)行糖酵解、碳源同化、氮源同化以及生長溫度等生理生化反應(yīng)鑒定。

1.3.1.3 生防菌KD-16J ITS序列分析

提取生防菌KD-16J的基因組DNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增該菌株的ITS序列區(qū)域[19]。將純化后的PCR產(chǎn)物交給上海生工有限公司進(jìn)行測序，利用BLAST程序進(jìn)行相似序列搜索，下載同源性較高的序列，通過MEGA 7.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

1.3.2 生防菌KD-16J對灰霉病菌的離體抑制作用

1.3.2.1 不同濃度生防菌KD-16J對灰霉菌絲生長的影響

參照余巧銀等[20]的方法進(jìn)行。將培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢菌邊緣用打孔器接種到含不同濃度生防菌KD-16J的平板上，在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。每天從平板背面觀察，采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。每組處理重復(fù)3次。

1.3.2.2 不同濃度生防菌KD-16J對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的影響

參照Zhang等[9]的方法，將灰葡萄孢菌的孢子懸浮液分別加入含不同濃度生防菌KD-16J的液體PDA中，置于25℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔4 h在光學(xué)顯微鏡下測定孢子萌發(fā)率。試驗(yàn)重復(fù)3次。孢子萌發(fā)率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算（以孢子芽管長度超過孢子長徑視為萌發(fā)）。

1.3.2.3 生防菌KD-16J對灰霉菌抑制作用的顯微鏡觀察

將培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢邊緣用打孔器接種到含1×108CFU/mL酵母細(xì)胞的PDA平板上，以含無菌水的PDA平板作為對照組，5 d后分別挑取灰霉菌絲進(jìn)行顯微觀察。

1.3.3 生防菌KD-16J對番茄灰霉病的生防效果

1.3.3.1 生防菌KD-16J對番茄采后病害自然侵染的防效

將1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸液噴灑在已經(jīng)經(jīng)過預(yù)處理的番茄果實(shí)上，以無菌水組作為對照組，25℃條件下貯藏12 d，計(jì)算果實(shí)發(fā)病率。每次試驗(yàn)處理10個果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.2 生防菌KD-16J對有傷接種灰葡萄孢菌果實(shí)的防效

參照程雷等[21]的方法并修改，在經(jīng)過預(yù)處理的番茄果實(shí)上的腰部用無菌打孔器打兩個孔（長5 mm，深約3 mm）。自然晾干后分別噴灑濃度為1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸液和無菌蒸餾水，然后向每孔中定量注入10 μL濃度為1×105個/mL的灰葡萄孢菌孢子懸液。待菌液吸收后，使用保鮮袋進(jìn)行單果包裝，外罩保鮮膜以保持90%～95%左右的相對濕度，于25℃室溫條件下貯藏。每隔24 h進(jìn)行果實(shí)發(fā)病率的觀察測定。每次試驗(yàn)處理10個果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.3 生防菌KD-16J不同處理時間對番茄灰霉病害的防治效果

對經(jīng)過預(yù)處理的番茄果實(shí)進(jìn)行打孔處理，在接種灰霉菌孢子懸浮液之前的36、24、12、0 h以及接種孢子懸浮液之后的12、24、48 h，分別對果實(shí)進(jìn)行噴施濃度為1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸液，以無菌水的處理作為對照，檢測果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。每組處理3個果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處生長動態(tài)的測定

參照1.3.3.2的實(shí)驗(yàn)組的方法處理番茄果實(shí)，以接種l h后測定的生防菌KD-16J數(shù)目為起始值，每24 h取樣測定1次果實(shí)傷口處的酵母數(shù)。參照趙妍[22]的方法，用打孔器挖下傷口，放入盛有無菌磷酸鹽緩沖液的研缽之中，研磨成勻漿。用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，采用涂布平板法涂布于PDA平板上，培養(yǎng)48 h后測定拮抗酵母的數(shù)目。每組處理3個果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較法在P=0.05的水平下進(jìn)行檢驗(yàn)，Excel 2016分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌KD-16J的鑒定

2.1.1 菌株KD-16J形態(tài)觀察

菌株KD-16J形態(tài)觀察如圖1所示。

圖1 菌株KD-16J平板培養(yǎng)的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of the strain KD-16J on potato dextrose agar

菌株KD-16J菌落在PDA平板上呈乳白色奶酪狀，表面平滑濕潤有光澤，質(zhì)地黏稠，具有芳香味，前期菌落邊緣較整齊飽滿，后期菌落邊緣成發(fā)散性樹狀分枝。在液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)會產(chǎn)生一層質(zhì)地濕潤平滑的醭膜。

2.1.2 菌株KD-16J生理生化鑒定

對生防菌進(jìn)行生理生化鑒定，其結(jié)果如表1所示。

KD-16J菌株在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，但不發(fā)酵乳糖和可溶性淀粉。在有氧條件下可以同化葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉以及硝酸銨、硫酸銨、尿素。在低溫4℃下不生長，50℃時出現(xiàn)弱生長現(xiàn)象，高溫達(dá)到70℃也不再生長。

2.1.3 ITS結(jié)果分析與發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序結(jié)果通過BLAST分析，選取相似度較高的序列進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建，如圖2所示。

由圖2可知，該株拮抗菌與膜醭畢赤酵母菌（Pichia membranifaciens）的親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)和生理生化鑒定可確定生防菌KD-16J是膜醭畢赤酵母菌。

2.2 生防菌KD-16J對灰霉病菌的離體抑制作用

2.2.1 生防菌KD-16J對灰葡萄孢菌菌絲生長的影響

將灰葡萄孢菌接種到含不同濃度生防菌KD-16J的培養(yǎng)基上，生長情況見圖3。

圖3（a）可以明顯看出，不含生防菌KD-16J的對照組的灰霉菌落長得非常迅速，試驗(yàn)組的病原菌得到了明顯的抑制。圖3（b）表明生防菌KD-16J濃度越高，對灰葡萄孢菌的抑制率越大。1×107CFU/mL和1×108CFU/mL的生防菌KD-16J處理下的灰霉菌落抑制率高達(dá)77.89%和85.53%，抑制作用顯著（P＜0.05）。

2.2.2 生防菌KD-16J對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的影響

生防菌KD-16J對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的影響見圖4。

如圖4所示，濃度為1×105CFU/mL的生防菌KD-16J處理的灰霉孢子的萌發(fā)率在初始階段要低于對照組，但隨著時間的延長，其萌發(fā)率會逐漸增大。當(dāng)生防菌的濃度為1×107CFU/mL時，萌發(fā)率顯著降低，最大值僅為22.5%，當(dāng)用濃度為1×108CFU/mL的生防菌KD-16J溶液處理時，對孢子萌發(fā)的抑制率基本達(dá)到了100%，即使在培養(yǎng)36 h甚至48 h之后，仍沒有明顯的孢子萌發(fā)現(xiàn)象。因此，生防菌KD-16J的最佳抑菌濃度為 1×108CFU/mL。

圖2 生防菌KD-16J系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of biocontrol strain KD-16J

圖3 不同濃度生防菌KD-16J懸液對灰葡萄孢菌生長的影響Fig.3 Inhibiting effects of various cell suspension concentration of strain KD-16J on colony diameter of B.cinerea

圖4 不同濃度生防菌KD-16J懸液處理對灰霉菌孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of various cell suspension concentration of the strain KD-16J on spore germination of B.cinerea

2.2.3 生防菌KD-16J對灰葡萄孢菌抑制作用的顯微鏡觀察

生防菌KD-16J對灰葡萄孢菌抑制作用的顯微鏡觀察結(jié)果見圖5。

圖5 生防菌KD-16J與灰葡萄孢菌在40倍顯微鏡下的相互作用觀察Fig.5 The interactions observed of the strain KD-16J and Botrytis cinerea with forty times electron microscope

如圖5（a）所示，對照組的菌絲生長相對規(guī)則粗壯、表面光滑，菌絲致密、簇?fù)沓蓤F(tuán)，菌絲隔清晰易辨，菌絲細(xì)胞內(nèi)容物飽滿且分布均勻；而試驗(yàn)組菌絲周圍緊密附著生防菌，且菌絲分枝處密度相對較高，菌絲生長粗細(xì)不均，雜亂無序，菌絲鈍化現(xiàn)象明顯，菌絲出現(xiàn)內(nèi)容物逐漸凝聚、空泡化，甚至出現(xiàn)滲漏等現(xiàn)象。

2.3 生防菌KD-16J對番茄灰霉病的生防效果

2.3.1 生防菌KD-16J對番茄采后病害自然侵染的防效

生防菌KD-16J對番茄采后病害自然侵染的防效如圖6所示。

圖6 生防菌KD-16J對番茄果實(shí)自然病害發(fā)病率的防治效果Fig.6 The control effects of the strain KD-16J on the disease incidence of naturally infection of tomato fruit

在番茄果實(shí)貯藏前，對其噴施1×108CFU/mL的生防菌KD-16J懸液，自然病害的發(fā)生機(jī)率較之對照組可以得到顯著降低（P＜0.05）。

貯藏第6天，和對照組的5.14%相比，拮抗酵母處理仍可以完全防治自然病害的發(fā)生。直至貯藏的第12天，與對照組的發(fā)病率為49.97%相比，噴施拮抗酵母處理的番茄果實(shí)自然病害發(fā)生率僅為16.67%，防治效果明顯。

2.3.2 生防菌KD-16J對番茄灰霉病有傷接種侵染的防效

生防菌KD-16J懸液噴灑處理對番茄灰霉病的抑制效果見圖7。

圖7 生防菌KD-16J懸液噴灑處理對番茄灰霉病的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of strain KD-16J suspension spraying on tomato gray mold

如圖7所示，提前噴灑生防菌KD-16J懸液的采后番茄灰霉病害發(fā)病率顯著低于對照組（P＜0.05）。貯藏初期，對照組果實(shí)發(fā)病率快速增加，至貯藏第5天，所有對照組的果實(shí)已經(jīng)完全發(fā)病，而噴灑處理的拮抗酵母由于在番茄果實(shí)表面快速繁殖生長，起到很好的防治效果，因而貯藏初期試驗(yàn)組果實(shí)的發(fā)病率較低，至貯藏第5天拮抗酵母處理組發(fā)病率僅為57.12%，到貯藏結(jié)束仍沒有達(dá)到完全發(fā)病。

2.3.3 生防菌KD-16J的不同噴灑時間對番茄灰霉病害的防治效果

生防菌KD-16J的不同噴灑時間對番茄灰霉病害的防治效果見圖8。

圖8 生防菌KD-16J的不同噴灑時間對番茄灰霉病害的防治效果Fig.8 The inhibiting effects of application times of the strain KD-16J on tomato gray mold disease

如圖8（a）所示，通過測量計(jì)算番茄傷口處的發(fā)病率和病斑直徑，發(fā)現(xiàn)生防菌噴灑時間對番茄果實(shí)的灰霉病斑直徑影響顯著。如圖8（b）所示，至貯藏期結(jié)束，生防菌KD-16J先于灰霉菌36 h處理時，其發(fā)病率僅為29.12%，病斑直徑平均僅為6 mm，顯著低于對照組（P＜0.05）。隨著生防菌KD-16J噴灑時間的延遲，番茄果實(shí)發(fā)病率會逐漸增加，生防菌噴灑時間晚于灰霉菌48 h的番茄果實(shí)至貯藏期結(jié)束則已完全發(fā)病，番茄果實(shí)的病斑直徑也隨之增大。根據(jù)Filonow等[23]的研究表明，拮抗酵母菌能夠從果汁或糖溶液中快速消耗糖，利用糖類物質(zhì)比灰葡萄孢菌更具優(yōu)勢，所以將生防菌KD-16J和灰霉菌同時接種到番茄果實(shí)上，酵母菌利用糖類的速度比病原菌快，可以在短時間內(nèi)利用果實(shí)傷口處的營養(yǎng)迅速繁殖，搶占生存空間，成為主導(dǎo)菌，從而抑制病原菌的生長。

2.4 生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處生長動態(tài)的測定

生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處的生長動態(tài)見圖9。

圖9 生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處的生長動態(tài)Fig.9 Population dynamics of the strain KD-16J in wounds of tomato fruit

圖9結(jié)果表明，拮抗酵母KD-16J可以較好地適應(yīng)番茄果實(shí)傷口處的環(huán)境，培養(yǎng)初期生防菌KD-16J數(shù)量增殖較快，至第48小時生防菌KD-16J繁殖量達(dá)到最大值。此后，生防菌KD-16J數(shù)量基本維持在較高的濃度范圍內(nèi)，并始終高于初始測定值。

3 結(jié)論與討論

酵母菌是人類應(yīng)用最早的微生物，也是目前人們研究最為透徹的微生物[24]。酵母菌之所以能夠成為化學(xué)殺菌劑的潛在替代品，除了其對多種植物病原菌如灰霉菌、青霉菌等具有拮抗作用外，它還具有定殖能力強(qiáng)，營養(yǎng)要求簡單，干燥環(huán)境下也能存活，以及不會產(chǎn)生致敏性孢子和霉菌毒素等特點(diǎn)[25]。本試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室分離篩選的一株生防菌KD-16J，通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)以及ITS序列分析，鑒定為P.membranifaciens的一株。通過離體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生防菌KD-16J對灰葡萄孢菌菌落擴(kuò)展、孢子萌發(fā)均存在明顯的抑制作用，且隨著酵母細(xì)胞濃度的增大，抑制效果也逐漸增強(qiáng)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與生防菌KD-16J共培養(yǎng)的灰葡萄孢菌菌絲粗細(xì)不均，鈍化現(xiàn)象明顯，會出現(xiàn)內(nèi)容物逐漸凝聚、空泡化現(xiàn)象。活體試驗(yàn)（番茄）表明生防菌KD-16J具有抑制番茄灰霉病、降低番茄發(fā)病率的作用，同時，噴灑生防菌KD-16J的時間越早，抑菌效果越好。番茄果實(shí)傷口處生長動態(tài)發(fā)現(xiàn)KD-16J能夠很快在番茄表面定殖，這進(jìn)一步表明和病原菌競爭營養(yǎng)與生存空間是該株酵母重要的拮抗機(jī)理。本試驗(yàn)不僅為P.membranifaciens防治番茄灰霉病提供一定的理論參考，也為生物防治技術(shù)應(yīng)用于果蔬保鮮提供了依據(jù)。