狹果茶藨子黃酮提取工藝優(yōu)化及其體外降血脂活性

李珊，劉耀耀，劉哲，趙永珍，馬虎，葉英，3*，王樹林，3*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海圣航農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司，青海 尖扎 811200；3.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

狹果茶藨子（Ribes stenocarpum Maxim.）又稱長(zhǎng)果醋栗，是茶藨子屬的一種植物，主要分布在我國(guó)甘肅、四川、貴州、青海等地區(qū)[1-2]。茶藨子屬植物是我國(guó)藏醫(yī)常用藏藥，青藏高原人民在長(zhǎng)期的生活實(shí)踐中，用茶藨子防治心腦血管疾病和感冒。茶藨子風(fēng)味獨(dú)特、天然無污染，又被稱為“第三代水果”[3]，其果實(shí)為漿果，營(yíng)養(yǎng)豐富，加工性能良好，可用作功能性食品的開發(fā)。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)茶藨子屬的黃酮[4]、花青素[5]、生物堿[6]以及脂肪酸類[7]等物質(zhì)進(jìn)行了研究報(bào)道，我國(guó)茶藨子植物品種資源豐富，但對(duì)其活性成分研究還較欠缺，該屬大部分植物無人問津，相關(guān)研究屈指可數(shù)。盧勝明[8]從川西茶藨子地上部分的95%乙醇提取物中分離鑒定了22種化合物，其中所得化合物為新的聯(lián)苯化合物，兩者對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別為10.2%（IC50值 1.00 mg/mL）、17.2%（IC50值 1.00 mg/mL）；何可群等[9]對(duì)貴州特有的野生茶藨子根的活性化學(xué)成分進(jìn)行了提取分離，得到東莨菪素、濱蒿內(nèi)酯等7個(gè)單體化合物；周霞[10]對(duì)貴州亨利茶藨子粗提物進(jìn)行了抗菌活性研究，測(cè)試結(jié)果表明根皮部分的氯仿提取物對(duì)小麥赤霉病菌的抑制活性達(dá)90.94%。

青藏高原茶藨子雖然分布廣泛，但大多為野生，目前尚未對(duì)其進(jìn)行有效的開發(fā)利用。因此，為了有效利用青藏高原分布較多的茶藨子資源，充分發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)效益，本研究將對(duì)青藏高原狹果茶藨子果實(shí)中黃酮進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，并對(duì)其體外降血脂活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為青藏高原茶藨子植物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狹果茶藨子：采自青海門源，50℃烘箱烘干48 h，粉碎后過60目篩，備用。

胰脂肪酶（90 U/mg）、膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉：上海阿拉丁生物科技公司；聚酰胺：江蘇長(zhǎng)豐化工有限公司；辛伐他?。涸迄i醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；蘆丁、聚乙烯醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯：天津市富宇精細(xì)化工公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；DHG-9031A恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-2恒溫水浴鍋、FA2204電子天平、PHS-3C pH計(jì)：上海力辰邦西儀器科技公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助提取狹果茶藨子黃酮單因素試驗(yàn)

以乙醇為提取溶劑，黃酮得率為指標(biāo)，考察提取時(shí)間（4、6、8、10、12 min），微波功率（300、400、500、600、700 W），料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化狹果茶藨子黃酮提取工藝

根據(jù)單因素結(jié)果，以提取時(shí)間、微波功率、料液比為考察因素，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，通過Design Expert V軟件優(yōu)化狹果茶藨子黃酮制備工藝，根據(jù)響應(yīng)面構(gòu)建的三維圖確定微波輔助提取狹果茶藨子黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)[11]。

1.3.3 狹果茶藨子黃酮粗提物的制備

按照最優(yōu)工藝條件，稱取一定量狹果茶藨子果粉，提取3次，合并濾液并濃縮至一定體積，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取[12]，收集有機(jī)相，制備得狹果茶藨子黃酮粗提物。

1.3.4 狹果茶藨子黃酮富集

選取聚酰胺樹脂為柱材料，以樹脂與樣品液的料液比1∶20（g/mL）上樣，待上樣吸附24 h后開始梯度洗脫（蒸餾水、20%、40%、60%、80%乙醇溶液及無水乙醇），每個(gè)梯度洗脫至流出液無色為止，毛細(xì)管吸取少量洗脫液點(diǎn)樣于濾紙上，噴涂1%三氯化鋁乙醇液使之顯色[13]，于365 nm紫外燈下觀察，收集檢測(cè)斑點(diǎn)顯黃色的洗脫液，濃縮后于-55℃條件下真空冷凍干燥，得純化后狹果茶藨子黃酮固體粉末。

1.3.5 狹果茶藨子黃酮得率的測(cè)定

參考白生文等[14]的方法，稱取蘆丁對(duì)照品，加入80%乙醇配制成2 mg/mL的標(biāo)品液，搖勻，再依次移取溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉體系進(jìn)行顯色，于505 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度為x軸，對(duì)應(yīng)濃度下吸光值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=11.735x-0.004（R2=0.999 3），按公式（1）計(jì)算。

式中：C為黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為測(cè)定液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.6 狹果茶藨子對(duì)胰脂肪酶抑制作用

1.3.6.1 胰脂肪酶活性測(cè)定

參考朱曉青等[15]的方法。將磷酸緩沖液5mL（pH7.4）和4%聚乙烯醇橄欖油乳化液4 mL加入錐形瓶中，振蕩搖勻后，在40℃反應(yīng)5 min后，加入1 mL 1 mg/mL的酶液，混勻并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，在40℃水浴中持續(xù)保溫30 min，結(jié)束后加入15 mL的95%乙醇，滴加1%酚酞指示劑，用0.025 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定，記錄消耗體積。空白對(duì)照組水浴后，先加入15 mL的95%乙醇，搖勻，最后加入1 mL酶液，用0.025 mol/L的NaOH溶液對(duì)空白組進(jìn)行滴定，記錄消耗空白組NaOH的體積。

1.3.6.2 狹果茶藨子對(duì)胰脂肪酶抑制率的測(cè)定

配制純化前后不同濃度的狹果茶藨子黃酮樣液及辛伐他汀溶液，按1.3.6.1胰脂肪酶活性測(cè)定方法操作，計(jì)算純化前后不同濃度狹果茶藨子黃酮樣液對(duì)胰脂肪酶的抑制率。

1.3.7 狹果茶藨子對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力

參考紀(jì)秀鳳等[16]的方法。配制純化前后不同濃度的狹果茶藨子黃酮樣液，分別取1 mL加入3支離心管中，再各加入4 mL的膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉溶液（0.3 mmol/L，pH=6.3），恒溫振蕩（37 ℃，1 h），離心（6 000 r/min，10 min），取2.5 mL上清液于玻璃管中，移取7.5 mL 60%硫酸溶液，輕輕混勻，在70℃下反應(yīng)20 min，再冰浴5 min，于387 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算純化前后狹果茶藨子不同濃度黃酮樣液對(duì)膽酸鹽的結(jié)合率，見公式（3）。

式中：A0為空白組吸光度值；A1為樣品組吸光度值；A2為對(duì)照組吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excle 2007和SPSS 22.0軟件分析，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取狹果茶藨子黃酮單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響見圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Influence of extraction time to the flavonoid yield

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮得率呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，可能原因是微波長(zhǎng)時(shí)間的作用導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)分解，且容易造成其它成分浸出。當(dāng)提取時(shí)間為8 min時(shí)，得率達(dá)到最高，故選取時(shí)間為8 min作為最佳提取時(shí)間。

2.1.2 微波功率對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響

微波功率對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響見圖2。

圖2 微波功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Influence of microwave power to the flavonoid yield

由圖2可知，當(dāng)微波功率小于500 W，狹果茶藨子黃酮得率隨著微波功率的增大呈上升趨勢(shì)，而微波功率在500 W時(shí)，黃酮得率最大，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。微波功率過大，導(dǎo)致溫度變化快，可能會(huì)導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)降解，甚至引起爆沸現(xiàn)象，從而影響黃酮得率。故狹果茶藨子黃酮提取的最佳微波功率選擇500 W。

2.1.3 料液比對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響

料液比對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響見圖3。

由圖 3 可知，當(dāng)料液比在 1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）范圍內(nèi)，狹果茶藨子黃酮得率隨溶劑體積增大而增高，料液比1∶30（g/mL）時(shí)得率最高，隨后呈下降趨勢(shì)，溶劑體積太大，因其它成分溶出而導(dǎo)致黃酮浸出效率變低，也可能會(huì)導(dǎo)致微波熱能負(fù)荷增大，溶劑競(jìng)爭(zhēng)吸收微波能量改變提取的溫度環(huán)境，不利于黃酮的浸出，從而影響黃酮得率。故選擇料液比為1∶30（g/mL）為宜。

圖3 料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Influence of solid-to-liquid ratio to the flavonoid yield

2.2 微波輔助提取狹果茶藨子黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和方差分析

根據(jù)單因素結(jié)果，對(duì)提取時(shí)間（A）、微波功率（B）、料液比（C）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

表3 二次回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic regression model

根據(jù)表2結(jié)果，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得回歸模型，擬合得到回歸方程：得率=22.35+0.029A+0.049B+0.12C-0.42AB+0.33AC+0.21BC-0.52A2-0.43B2-0.91C2。由表3可知，失擬項(xiàng)（P=0.859 1＞0.05）不顯著，模型呈極顯著水平（P＜0.000 1），R2=0.990 8，R2Adj=0.965 8，說明回歸模型有較好的擬合程度，可以用于狹果茶藨子黃酮微波輔助提取的分析和預(yù)測(cè)。表3表明料液比對(duì)狹果茶藨子黃酮得率有顯著影響，提取時(shí)間與微波功率的相互作用、提取時(shí)間與液料比的相互作用、微波功率與液料比的相互作用都極顯著，且A2、B2、C2分別達(dá)到極顯著水平。各因素對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響順序?yàn)椋篊＞B＞A。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖4為提取時(shí)間（A）、微波功率（B）、料液比（C）3個(gè)因素間交互作用對(duì)狹果茶藨子黃酮得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。

從圖4可以看出，兩兩因素的三維圖較陡，等高線圖都呈橢圓形，說明兩個(gè)因素對(duì)狹果茶藨子黃酮得率影響均顯著。

2.2.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)得最佳提取參數(shù)：提取時(shí)間8.11min，微波功率512.32 W，料液比1∶31.60（g/mL），黃酮得率為22.357%?；趦x器、試驗(yàn)條件進(jìn)行修正，即提取時(shí)間 8 min，微波功率 500 W，料液比 1∶30（g/mL），經(jīng)驗(yàn)證得黃酮得率為22.360%，與預(yù)測(cè)值無顯著差異。

圖4 各因素間交互作用對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plots and response surface for the effect of Ribes stenocarpum Maxim.on dissolution quantity of flavonoids

2.3 狹果茶藨子黃酮富集結(jié)果

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定純化前后狹果茶藨子黃酮含量，得粗提物黃酮含量為14%，而經(jīng)純化后黃酮含量為68.72%。說明聚酰胺樹脂對(duì)黃酮有較好的富集效果，可能是因?yàn)榫埘０肥且环N含有酰胺鍵結(jié)構(gòu)的縮聚高分子化合物，可以與含酚羥基的黃酮類物質(zhì)形成氫鍵締合[17]。

2.4 狹果茶藨子黃酮對(duì)胰脂肪酶抑制作用結(jié)果

胰脂肪酶與脂肪水解有密切關(guān)系，能催化其生成甘油和脂肪酸，然后在小腸中利用，如果能對(duì)胰脂肪酶活性進(jìn)行抑制，便能減少脂肪水解，從而控制肥胖[18-20]。狹果茶藨子黃酮對(duì)胰脂肪酶抑制作用結(jié)果如圖5所示。

圖5 胰脂肪酶抑制作用Fig.5 Effect of pancreatic lipase inhibition

隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，各樣品對(duì)胰脂肪酶抑制率逐漸增大，且純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)胰脂肪酶活性的抑制差異較大，當(dāng)濃度為32 mg/mL時(shí)，純化后的胰脂肪酶抑制率達(dá)91.6%，相較于純化前，提高了16.81%，略低于同濃度下辛伐他汀（抑制率93.28%），這可能是因?yàn)楠M果茶藨子粗提物中黃酮類物質(zhì)含量較高[21]，使得其本身具有一定的生物活性，而經(jīng)聚酰胺樹脂初步純化后，黃酮含量增大，對(duì)胰脂肪酶的抑制能力增強(qiáng)，進(jìn)一步表明狹果茶藨子黃酮可能是抑制胰脂肪酶的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.5 狹果茶藨子對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力的影響

為研究純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合能力，以不同膽酸鹽結(jié)合率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)純化前后狹果茶藨子黃酮的體外降血脂能力。結(jié)果如圖6所示。

圖6 純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)膽酸鹽結(jié)合率的影響Fig.6 Effect of Ribes stenocarpum Maxim.flavonoids before and after purification on ability of bile salt-binding

純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)3種膽酸鹽結(jié)合能力具有一定的差異，純化前狹果茶藨子粗提物對(duì)膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率分別為32.97%、42.99%和35.60%，初步判定狹果茶藨子粗提物中含有較強(qiáng)的結(jié)合膽酸鹽的活性成分。經(jīng)聚酰胺樹脂進(jìn)一步純化后，對(duì)膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率高達(dá)61.71%、86.47%和84.79%，比純化前分別提高了28.74%、43.48%和49.19%，與純化后黃酮含量呈正相關(guān)，表明狹果茶藨子黃酮可能是體外結(jié)合膽酸鹽的主要化學(xué)成分。

2.5.2 狹果茶藨子黃酮質(zhì)量濃度對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力的影響

狹果茶藨子黃酮質(zhì)量濃度對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同狹果茶藨子黃酮質(zhì)量濃度對(duì)膽酸鹽結(jié)合率的影響Fig.7 Effects of Ribes stenocarpum Maxim.flavonoids mass concentration on ability of bile salt-binding

狹果茶藨子黃酮對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合能力隨質(zhì)量濃度的增大而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)?；悄懰徕c的結(jié)合率最高為96.70%，甘氨膽酸鈉與膽酸鈉的結(jié)合率相當(dāng)，分別為92.72%和91.64%，且對(duì)膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的IC50分別為3.301、1.499、1.847 mg/mL，明顯高于5 mg/mL的紅樹莓籽黃酮[22]。此外，這3種膽酸鹽結(jié)合效果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，狹果茶藨子黃酮對(duì)?；悄懰徕c的結(jié)合能力要強(qiáng)于其它兩種膽酸鹽，推測(cè)可能是由于該鹽中含有磺酸基團(tuán)，在中性環(huán)境下易發(fā)生離子化，且酸性遠(yuǎn)強(qiáng)于甘氨膽酸鈉和膽酸鈉中的羧基[23]，因此更易與黃酮化合物中的酚羥基結(jié)合。說明狹果茶藨子黃酮具有較強(qiáng)的體外結(jié)合膽酸鹽能力，可用作開發(fā)天然降血脂食品原料。

3 結(jié)論

本研究首次采用微波輔助提取法結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化狹果茶藨子黃酮提取工藝參數(shù)，以胰脂肪酶抑制率、不同膽酸鹽結(jié)合能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)純化前后狹果茶藨子黃酮體外降血脂活性。研究結(jié)果表明：狹果茶藨子黃酮微波輔助提取最佳工藝為：微波功率500 W，料液比 1∶30（g/mL），提取時(shí)間 8 min，此條件下黃酮得率為22.36%。相較于純化前，純化后黃酮含量達(dá)68.72%，狹果茶藨子黃酮體外降血脂活性更強(qiáng)，對(duì)胰脂肪酶的抑制率最高達(dá)91.6%，比純化前提高了16.81%；對(duì)膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的IC50分別為3.301、1.499、1.847 mg/mL，表明黃酮類化合物是狹果茶藨子發(fā)揮作用的主要活性成分，且青藏高原野生茶藨子植物豐富，尚未進(jìn)行有效開發(fā)利用，因此，研究結(jié)果可為茶藨子降血脂功能作用機(jī)制的研究及功能性食品的開發(fā)提供重要的理論支撐，有利于茶藨子資源的進(jìn)一步研究與開發(fā)。