高效液相色譜法測(cè)定著色劑食品黃3 中6 種磺酸類雜質(zhì)

梁文耀，李鑫宇，李焯原，王珍玉，汪毅，聶明霞，譚建華

（1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，國(guó)家化妝品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣州 511447； 2.廣東工業(yè)大學(xué)，廣州 510006）

食 品 黃3(CI 15985)，又 名 日 落 黃(Sunset yellow)，化學(xué)名稱為1-(對(duì)磺苯基偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二鈉鹽［1］。食品黃3 是一種人工合成著色劑，在食品和化妝品領(lǐng)域，都有較廣泛的應(yīng)用［2］?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）規(guī)定了食品黃3中6 種磺酸類雜質(zhì)［4-氨基苯-1-磺酸、3-羥基萘-2，7-二磺酸、6-羥基萘-2-磺酸、7-羥基萘-1，3-二磺酸、4，4'-雙偶氮氨基二苯磺酸、6，6'-羥基雙(2-萘磺酸)二鈉鹽］的限量值，其中6，6'-羥基雙(2-萘磺酸)二鈉鹽不超過1.0%，其余5 種總量不超過0.5%［3］，6 種磺酸類雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)圖見圖1?；撬犷愲s質(zhì)對(duì)人體有一定危害［4-5］，為了提高著色劑的質(zhì)量和安全性，需對(duì)食品黃3 的雜質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 6 種磺酸類雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)圖

磺酸類化合物的檢測(cè)方法主要有化學(xué)分析法［6］、液相色譜法［6-11］、分光光度法［11］、高效毛細(xì)管電泳法［12］、離子色譜法［13-14］、液相色譜-質(zhì)譜法［15］等?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于食品黃3 中磺酸類雜質(zhì)檢測(cè)的研究較少，主要采用液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法。通常參照GB 6227.1-2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑日落黃》［8］中附錄A 的方法對(duì)原料進(jìn)行檢測(cè)。但標(biāo)準(zhǔn)中缺少3-羥基萘-2，7-二磺酸和7-羥基萘-1，3-二磺酸的檢測(cè)方法，而且4-氨基苯-1-磺酸的保留較弱，易被干擾。因此，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法存在局限性，亟需建立著色劑食品黃3 中6 種磺酸類雜質(zhì)的檢測(cè)方法。

筆者采用乙腈和離子對(duì)試劑（四丁基溴化銨）水溶液作為流動(dòng)相，通過優(yōu)化提取溶劑、色譜條件等因素，建立快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，可為食品黃3 中6 種磺酸類雜質(zhì)的檢測(cè)提供有效的技術(shù)手段，滿足化妝品原料質(zhì)量安全檢測(cè)的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD），美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子天平：CPA225D 型，感量值為0.01 mg，德國(guó)賽多利斯公司。

渦旋振蕩器：MS3 basic 型，德國(guó)IKA 公司。

超聲波清洗儀：KQ-250DV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

聚醚砜濾膜：0.45 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

純水系統(tǒng)：Milli-Q 型，美國(guó)Millipore 公司。

6 種磺酸類雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度及編號(hào)列于表1，均購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

表1 6 種磺酸類雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度及編號(hào)

甲醇、乙腈：色譜純，德國(guó)默克公司。

四丁基溴化銨：分析純，上海阿拉丁試劑有限公司。

乙酸銨：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

食品黃3 原料樣品：市售。

實(shí)驗(yàn)用純水：電阻率為18.2 MΩ·cm，由Milli-Q 純水系統(tǒng)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取6 種磺酸類雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.01 g（精確至0.01 mg），分別用純水配制成1 000 mg／L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。各移取1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL 容量瓶中，用純水定容至標(biāo)線，配制成100 mg／L 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密移取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用純水定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、15.0 mg／L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

稱取食品黃3 原料樣品0.1 g（精確至0.000 1 g）于100 mL 容量瓶中，加純水定容至標(biāo)線，混勻，超聲提取5 min。冷卻至室溫，混勻，取適量樣品溶液，過0.45 μm 濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；流量：1.0 mL／min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：乙腈-10 mmol／L 四丁基溴化銨水溶液（4∶6）；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用配備二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，6 種磺酸類雜質(zhì)色譜峰的紫外吸收光譜圖見圖2。結(jié)果顯示，6 種磺酸類雜質(zhì)在240 nm附近均有較強(qiáng)紫外吸收，其中4，4'-雙偶氮氨基二苯磺酸在240 nm 和360 nm 有特征紫外吸收。在實(shí)際樣品測(cè)試過程中，可選擇240 nm 和360 nm 雙波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，但4，4'-雙偶氮氨基二苯磺酸在兩個(gè)波長(zhǎng)下響應(yīng)差別不明顯?？紤]到6 種磺酸類雜質(zhì)在240 nm 波長(zhǎng)的響應(yīng)值能滿足方法靈敏度的要求，所以選擇240 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 6 種磺酸類雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-25 mmol／L 乙酸銨水溶液、乙腈-10 mmol／L 四丁基溴化銨水溶液為流動(dòng)相，考察了6 種磺酸類雜質(zhì)的色譜峰形和分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，6 種磺酸類雜質(zhì)保留較弱且存在拖尾現(xiàn)象。在流動(dòng)相中添加乙酸銨后拖尾現(xiàn)象有所改善，但保留仍然較弱。加入離子對(duì)試劑四丁基溴化銨后，有效提高了6 種磺酸類雜質(zhì)在色譜柱上的保留、分離度和檢測(cè)靈敏度，且色譜峰形對(duì)稱。當(dāng)乙腈與水溶液體積比為4∶6，水溶液中四丁基溴化銨濃度為10 mmol／L 時(shí)，6 種磺酸類雜質(zhì)分離度最佳。因此，選用乙腈-10 mmol／L 四丁基溴化銨水溶液（4∶6）為流動(dòng)相。6 種磺酸類雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mg／L）色譜圖見圖3。

圖3 6 種磺酸類雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mg／L）色譜圖

2.3 色譜柱的選擇

考 察 了5 種 相 同 規(guī) 格（4.6 mm×250 mm，5 μm）不 同 品 牌（X-bridge C18、ZORBAX SB-C18、Pronto SIL-C18、Ultimate AQ C18和Dimansil C18）C18色譜柱的分離效果。結(jié)果顯示，在同等色譜條件下，6 種磺酸類雜質(zhì)在5 種C18色譜柱上色譜峰形差別不明顯，ZORBAX SB-C18色譜柱上的色譜峰形最優(yōu)，且與食品黃3 基質(zhì)分離良好。因此，最終選用ZORBAX SB-C18色譜柱進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 提取條件的選擇

根據(jù)6 種磺酸類雜質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，分別考察了純水、25 mmol／L 乙酸銨水溶液、10%乙腈水溶液、10%甲醇水溶液對(duì)食品黃3 中6 種磺酸類雜質(zhì)的提取效果。結(jié)果顯示，4 種提取溶劑均能地很好溶解目標(biāo)物，且回收率接近，均大于95%，考慮到操作簡(jiǎn)便和溶劑毒性，選用純水作為提取溶劑。超聲可以加快目標(biāo)物溶解析出，在較短的時(shí)間內(nèi)獲得較好的提取效果，為了保證樣品的充分提取，最終選擇先渦旋分散樣品，再超聲提取5 min 作為提取條件。

2.5 線性方程與檢出限

在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)1.2.1 配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物的色譜峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度（X，mg／L）進(jìn)行線性回歸分析。以3 倍信噪比計(jì)算檢出限，以10 倍信噪比計(jì)算定量限。線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表2。由表2 可知，6 種磺酸類雜質(zhì)在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999。方法的檢出限和定量限均可滿足食品黃3 中6 種磺酸類雜質(zhì)的檢測(cè)需要。

表2 6 種磺酸類雜質(zhì)的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限及定量限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

稱取食品黃3 樣品0.1 g（精確至0.000 1 g），共18 份，分別添加低、中、高3 個(gè)濃度水平的6 種磺酸類雜質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各6 份，按1.2.2 方法制備加標(biāo)樣品溶液，按1.3 儀器條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表3。由表3可知，6 種磺酸類雜質(zhì)在3 個(gè)加標(biāo)濃度下的平均回收率為94.3%～99.3%，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～3.95%（n=6）。說明顯示該方法有良好的回收率和精密度。

表3 6 種磺酸類雜質(zhì)的加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 實(shí)際樣品分析

采用所建立的方法對(duì)10 批次來源于化妝品生產(chǎn)企業(yè)的食品黃3 原料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果列于表4。由表4 可知，10 批次均檢出4-氨基苯-1-磺酸和6-羥基萘-2-磺酸，有3 批次檢出7-羥基萘-1，3-二磺酸，有8 批次檢出6，6'-羥基雙(2-萘磺酸)二鈉鹽，所檢10 批次樣品所含雜質(zhì)含量均符合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）［3］要求。

表4 實(shí)際樣品中6 種磺酸類雜質(zhì)的測(cè)定結(jié)果 %

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品黃3 中6種磺酸類雜質(zhì)的分析方法。該方法前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、精密度好，適用于食品黃3 原料樣品的檢測(cè)。對(duì)10 批次樣品進(jìn)行了測(cè)定，4 種磺酸類雜質(zhì)有檢出，且以6-羥基萘-2-磺酸的檢出含量最高。該方法對(duì)化妝品用食品黃3 著色劑的質(zhì)量安全檢測(cè)提供了有效的技術(shù)支持。