離子色譜法同時測定尿液中草酸和硫氰酸鹽

張麗，黃選忠，杜宏山

（湖北興山縣疾病預(yù)防控制中心，湖北興山 443711）

人的尿液中含有大量的Cl-、HPO42-、SO42-和微量的SCN-等陰離子，其中Cl-、HPO42-、SO42-是人體正常代謝產(chǎn)物，而SCN-是有機和無機氰化物在人體內(nèi)的解毒產(chǎn)物，因此尿液中SCN-含量常作為人體接觸氰化物的一項生物接觸指標(biāo)［1］。SCN-可致甲狀腺腫，可阻滯甲狀腺激素合成，尤其對胎兒和嬰兒的智力以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育存在較大的風(fēng)險［2］，因此監(jiān)測人血液、尿液等生物標(biāo)本中的SCN-含量具有重要意義。目前，測定尿液中微量SCN-的方法主要有分光光度法［3-5］、衍生-頂空氣相色譜法［6-7］等，其中分光光度法和氣相色譜法均存在氰化物的干擾問題。

臨床資料顯示，約70%的尿結(jié)石為草酸鈣結(jié)石，草酸代謝異常所引起的高含量草酸尿是泌尿系結(jié)石形成的主要原因［8］，因此準(zhǔn)確測定尿液中草酸含量對研究結(jié)石形成機理、結(jié)石的鑒別等均具有重要意義。目前測定尿液中草酸的方法主要是光度法，包括絡(luò)合物褪色比色法［9］和催化光度法［10-11］、催化熒光法［12-13］、高效液相色譜法［14-15］和毛細(xì)管電泳法［16］等，而比色法、光度法、熒光法等光譜分析方法特異性差，樣品需進(jìn)行前處理，操作繁雜，高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法均需要專用儀器，應(yīng)用受限。

多組分同時測定歷來是分析工作者所追求的目標(biāo)，也是離子色譜法的優(yōu)勢。離子色譜法操作簡便、試劑消耗少、可自動化，現(xiàn)已成為陰離子分析的首選方法［17］，并已應(yīng)用于尿液中草酸［17-18］和SCN-［19-20］的分別測定，但用離子色譜法同時測定尿液中草酸和SCN-尚未見報道。筆者以SH-AC-3型陰離子交換柱為分離柱，10.0 mmol／L Na2CO3溶液為淋洗液，1.0 mL／min 的流量等度洗脫，建立了抑制電導(dǎo)檢測-離子色譜法同時測定尿液中草酸和SCN-的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：CIC-100 型，青島盛瀚色譜公司。

SPEIC-C18凈化柱：1 mL，青島盛瀚色譜公司。

電子天平：萬分之一，BT214D 型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

電子天平：千分之一，JA2003 型，上海菁海儀器有限公司。

離心機：LG10-2.4A 型，北京醫(yī)用離心機廠。

濾膜過濾器：0.22 μm，青島盛瀚色譜公司。

草酸（H2C2O4·2H2O）、硫氰酸鉀：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg／L，稱取0.140 1 g 草酸（H2C2O4·2H2O），用高純水溶解，定容至100 mL。

SCN-標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg／L，稱取0.167 3 g 烘干的硫氰酸鉀，用高純水溶解，定容至100 mL。

磷酸二氫鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

H2PO4-標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg／L，稱取0.140 2 g磷酸二氫鉀，用高純水溶解，定容至100 mL。

Cl-、SO42-標(biāo)準(zhǔn)溶液：均為1 000 mg／L ，編號分別為GBW(E) 080268、GBW(E) 080266，中國計量科學(xué)研究院。

無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、無水亞硫酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

試驗用水為高純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 溶液的配制

草酸、SCN-混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別取適量草酸和SCN-標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋，定容，分別制備成含草酸和SCN-均為10.0 mg／L（A液）、100.0 mg／L（B液）的兩種混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液A液0.20、0.50、1.00 mL 及B 液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00 mL 分別置于8 只10 mL 容量瓶中，加水定容至標(biāo)線，混勻，配制成含草酸和SCN-均為0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00、30.00 mg／L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

亞硫酸鹽（SO32-）溶液：稱取0.5 g 無水亞硫酸鈉于砷化氫發(fā)生瓶中，加50 mL 高純水溶解，并向溶液中加入5 mL 10%硫酸溶液，迅速將導(dǎo)管插入200 mL 水中以吸收反應(yīng)產(chǎn)生的SO2氣體（可將砷化氫發(fā)生瓶置于約60 ℃水浴中），待反應(yīng)完畢后取10 mL吸收液用碘量法［21］測定SO32-的濃度，儲存于4 ℃冰箱備用。

模擬尿樣：Cl-、H2PO4-、SO42-等是正常尿液中含量較多的幾種陰離子［22］，根據(jù)其濃度，分別取相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液用高純水稀釋成含500 mg／L Cl-、300 mg／L H2PO4-和SO42-的模擬尿樣備用。

1.3 儀器工作條件

分 離 柱：SH-AC-3 型（250×4.0 mm，青 島 盛瀚色譜公司）；保護(hù)柱：SH-AC-3 型（50×4.0 mm，青島盛瀚色譜公司）；抑制器：自再生抑制器；檢測器：電導(dǎo)檢測器；定量環(huán)體積：25 μL；自動進(jìn)樣器（SHA-15 型，青島盛瀚色譜公司）；柱箱溫度：35 ℃；電流：75 mA；量程：1 檔；自動進(jìn)樣器：全定量環(huán)取樣，取樣后清洗（每針之間），置換量為70 μL，取樣量為25 μL，扎針深度為4 mm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1.2 制備的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，各管取1.5 mL 于樣品瓶中，啟動自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，分別測定，以草酸和SCN-的色譜峰面積（S）為縱坐標(biāo)，以色譜峰面積對應(yīng)的各組分質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1.5 尿樣的采集

將聚乙烯瓶清洗干凈、用高純水浸泡后烘干備用，采集尿樣50 mL 于聚乙烯瓶中儲存于4 ℃冰箱中，待測定。

2.2.3 精準(zhǔn)考核確保權(quán)責(zé)到位 加強民政和政府部門、衛(wèi)生部門等協(xié)作，將基層居家養(yǎng)老服務(wù)項目作為街道或社區(qū)政府績效考核的內(nèi)容，并加強對農(nóng)村居家養(yǎng)老服務(wù)意識的轉(zhuǎn)變。將農(nóng)村居家養(yǎng)老服務(wù)作為政府績效考評的內(nèi)容，從對農(nóng)村居家養(yǎng)老服務(wù)購買的效率與服務(wù)提供的質(zhì)量兩方面進(jìn)行考量。除此之外，還要考評轄區(qū)內(nèi)居家養(yǎng)老服務(wù)組織數(shù)目以及服務(wù)內(nèi)容落實情況等信息。從而保證考核標(biāo)準(zhǔn)的精準(zhǔn)，促進(jìn)組織的“活躍度”和可持續(xù)性發(fā)展，避免造成重硬件輕服務(wù)的“惡性競爭”。

1.6 尿樣測定

取新鮮尿樣經(jīng)8 000 r／min 離心10 min，取上清液用高純水稀釋10 倍，然后分別用C18柱凈化和0.22 μm 濾膜過濾，取1.5 mL 濾液于樣品瓶中，啟動自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，測定各組分的色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 淋洗液的選擇

以SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱，以Na2CO3-NaHCO3溶液為淋洗液，取模擬尿樣進(jìn)行測定，考察淋洗液對各組分的分離效果。當(dāng)Na2CO3-NaHCO3淋洗液的濃度配比在6∶1～6∶3 mmol／L時，均可將草酸和硫氰酸鹽與尿液中的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全分離，各組分相對于后續(xù)組分的分離度（R）不小于1.5，但硫氰酸鹽的保留時間（t）超過24 min，分析效率低下。為縮短硫氰酸鹽的保留時間，提高分析工作效率，以洗脫能力較強的Na2CO3溶液進(jìn)行了淋洗試驗，設(shè)置流量為1.0 mL／min，試驗結(jié)果列于表1。由表1 可知，當(dāng)Na2CO3溶液濃度分別為8.0、10.0、12.0 mmol／L時，草酸和硫氰酸鹽與尿液中的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽（當(dāng)Na2CO3溶液超過8 mmol／L 時磷酸鹽和硫酸鹽合并為一個色譜峰）等陰離子均可完全分離，且硫氰酸鹽的保留時間分別縮短至21、20 和19 min 左右?？紤]到Na2CO3溶液濃度增大，相應(yīng)的抑制電流也高，不利于抑制器的使用［17］，為保證適宜的分離度和較短的保留時間，選擇10.0 mmol／L Na2CO3溶液為淋洗液。

表1 Na2CO3 溶液濃度對分離結(jié)果的影響

2.1.2 色譜柱的選擇

以10.0 mmol／L Na2CO3溶液為淋洗液，流量為1.0 mL／min 進(jìn)行等度洗脫，取模擬尿樣進(jìn)行測定，考察了青島盛瀚色譜公司生產(chǎn)的SH-AC-1 型和SH-AC-3 型陰離子交換柱對草酸和硫氰酸鹽與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子的分離情況。結(jié)果表明，在此條件下SH-AC-1 型柱雖能將草酸與常見陰離子完全分離，但硫氰酸鹽在90 min 內(nèi)尚未出峰；而SH-AC-3 型柱不但可將草酸和硫氰酸鹽與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全分離，且硫氰酸鹽的保留時間小于21 min。故本實驗選擇SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱。

2.1.3 淋洗液流量的選擇

淋洗液濃度相同，流量不同時，組分的分離度和保留時間會發(fā)生改變?？疾?0.0 mmol／L Na2CO3為淋洗液，不同流量時草酸和硫氰酸鹽與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等陰離子的分離效果，試驗結(jié)果列于表2。由表2 可知，當(dāng)淋洗液流量從0.8 mL／min 增加至1.2 mL／min 時，氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽、草酸和硫氰酸鹽的保留時間逐漸變短，分離度逐漸下降，但氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽、草酸的分離度遠(yuǎn)大于1.5 達(dá)到完全分離的標(biāo)準(zhǔn)。在保證待測組分與干擾離子完全分離的前提下盡量使用較低的流量，以減少系統(tǒng)壓力，因此淋洗液流量選定為1.0 mL／min。

表2 不同Na2CO3 淋洗液流量試驗結(jié)果

2.1.4 柱箱溫度的確定

考察了柱溫分別在30、35、40 ℃時各組分的分離效果，結(jié)果顯示，在所選溫度下，草酸和硫氰酸鹽均能與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全的分離，且隨著柱溫的升高組分的保留時間稍微縮短，分離度逐漸下降，草酸的色譜峰面積隨著柱溫的升高而增長，從30 ℃上升35 ℃，增長10%左右，從35 ℃上升40 ℃，增長6%左右；硫氰酸鹽的色譜峰面積隨著柱溫的升高基本保持不變。在保證適宜的保留時間和較高的分離度的情況下，盡量采用較低的柱溫，本試驗確定柱箱溫度為35 ℃，這也是色譜柱使用說明書推薦的使用溫度。

2.2 線性關(guān)系與檢出限

按照1.2 配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，測定各管的色譜峰面積，以色譜峰面積（S）為縱坐標(biāo)，以各組分的質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

測定儀器30 min 的基線噪聲，以3 倍基線噪聲除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（3N／b）計算草酸和硫氰酸鹽的檢出限。

其線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（回歸曲線的截距、斜率和相關(guān)系數(shù)由儀器軟件給出）、檢出限列于表3。由表3 可知，草酸和硫氰酸鹽的質(zhì)量濃度在0.20～30.0 mg／L 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性良好，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 29、0.999 49，檢出限分別為0.04、0.03 mg／L。

其中，含10.0 mg／L 草酸和硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

表3 草酸、SCN–線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 共存陰離子及抗壞血酸的影響

由于尿液中含有大量的有機物和氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等陰離子，尿樣通過C18柱的凈化可以消除有機物的影響，尿液經(jīng)10 倍稀釋以降低氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的影響?？疾炝寺然锏? 種陰離子對草酸和硫氰酸鹽測定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的保留時間遠(yuǎn)小于草酸和硫氰酸鹽的保留時間，且500 mg／L Cl-、300 mg／L H2PO4-、SO42-（H2PO4-、SO42-完全分不開合并為一個峰）不影響50 mg／L 的草酸、3 mg／L 的硫氰酸鹽的測定，分離色譜圖見圖2。

圖2 常見陰離子與草酸和硫氰酸鹽分離色譜圖

尿液中可能含有抗壞血酸，在堿性條件下，抗壞血酸易發(fā)生降解反應(yīng)，而草酸是抗壞血酸的降解產(chǎn)物之一，可能會影響草酸的準(zhǔn)確測定，有研究顯示在15.0 mmol／L NaHCO3溶液(pH=8.3)中40 mg／L 的抗壞血酸在80 min 內(nèi)未降解為草酸［17］，本試驗使用10.0 mmol／L Na2CO3溶液（pH≈11.1）為淋洗液，pH 值遠(yuǎn)大于8.3，樣品從進(jìn)樣到草酸出峰超過11 min，這段時間尿液中的抗壞血酸可能降解生成草酸而影響測定。觀察用純水配制30 mg／L的抗壞血酸的降解情況，結(jié)果表明本試驗條件下30 mg／L 的抗壞血酸降解產(chǎn)生約0.3 mg／L 的草酸。試驗采用亞硫酸鹽（SO32-）抑制抗壞血酸的降解，這與在易氧化藥物制劑中加入亞硫酸鹽以提高藥物穩(wěn)定性的方法原理相似。

試驗結(jié)果顯示，50 mg／L 的SO32-可抑制30 mg／L 抗壞血酸的降解，且至少在120 min 內(nèi)30 mg／L 抗壞血酸對10.0 mg／L 的草酸的色譜峰面積與峰高無明顯影響（增加值＜5%）。同時50 mg／L 的SO32-對草酸和硫氰酸鹽的測定結(jié)果無明顯影響（誤差＜5%）。

2.4 加標(biāo)回收試驗

取3 份1.5 mL 樣液于樣品瓶中，按1.6 步驟操作，測得草酸和硫氰酸鹽的含量。在3 份尿樣中分別添加2.0、5.0、10.0 mg／L 的草酸和硫氰酸鹽，平行測定5 次，并計算草酸和硫氰酸鹽的回收率及測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。由表4 可知，3 份尿液草酸和硫氰酸鹽的測定結(jié)果分別為4.71～14.83 mg／L 和0.21～0.72 mg／L，加 標(biāo)回收率分別為95.0%～101.1%和95.5%～100.5%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.34%～2.06%和1.56%～2.91%。尿液的加標(biāo)色譜圖見圖3。

表4 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

圖3 尿液及其加標(biāo)（尿液加5 mg／L 草酸和硫氰酸鹽）色譜圖

3 結(jié)語

建立了抑制電導(dǎo)檢測-離子色譜法同時測定尿液中草酸和硫氰酸鹽的分析方法。該方法具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，操作簡便快速，尿樣通過C18柱的凈化可以消除有機物的影響，尿液稀釋10倍后可降低氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的影響。該方法以自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，降低檢驗人員的工作強度，提高了工作效率，適用尿液中草酸和硫氰酸鹽的同時測定。