紅景天苷在比格犬體內(nèi)絕對(duì)生物利用度研究

黃 彪，單曉菊，趙 鑫，曹永兵，周婷婷，范國(guó)榮 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433；. 科文斯醫(yī)藥研發(fā)（上海）有限公司，上海 003）

紅景天為景天科大花紅景天[Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba]的干燥根和根莖[1]，是一種多年生草本或亞灌木植物。大部分生長(zhǎng)于海拔3 500～5 000 m 的石灰?guī)r、花崗巖地冰川、山梁草地或山谷巖石上，享有“高原人參”、“雪山仙草”之美稱，被當(dāng)代醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“東方神草”，被全球醫(yī)藥界喻為“黃金植物”[2]，己被前蘇聯(lián)科學(xué)家確定為植物適應(yīng)原[3]。目前的研究表明，紅景天具有抗應(yīng)激、抗疲勞、抗氧化、抗癌、抗抑郁、保護(hù)肝腎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和神經(jīng)保護(hù)等作用[4-7]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅景天多集中于其藥效研究，體內(nèi)藥物含量測(cè)定和生物利用度研究又多以大鼠為研究對(duì)象。在以往研究的大鼠試驗(yàn)中，不同給藥途徑和不同劑量下，紅景天苷絕對(duì)生物利用度(Fabs)結(jié)果為32.1%～98%[8-11]，范圍之大可能和紅景天苷在體內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。而主要參與分子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)(SGLT1)在腸黏膜中所占的比例極其有限。在有限的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)下，劑量不同可能會(huì)導(dǎo)致生物利用度研究結(jié)果不同。當(dāng)口服紅景天苷劑量大于24 mg/kg時(shí)，大鼠腸道出現(xiàn)了飽和吸收過(guò)程，且證明此飽和過(guò)程與SGLT1 相關(guān)[12]。由于腸道中SGLT1 占比有限，若給藥劑量過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致藥物腸道重吸收較差，進(jìn)而體現(xiàn)為生物利用度降低。因此，為了更加科學(xué)地考察體內(nèi)生物利用度，合適劑量的選擇尤為重要。

關(guān)于測(cè)定比格犬體內(nèi)紅景天苷含量的分析方法研究報(bào)道較少。Mao 等[8]建立了測(cè)定犬血漿中紅景天苷含量的HPLC 法，線性范圍為0.83～520 μg/ml（r=0.992 6），最低定量下限為0.83 μg/ml。因定量限較高，不足以滿足其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)分析。陳帥等[13]應(yīng)用UHPLC-MS/MS 法，采用柱前衍生化的樣品處理同時(shí)測(cè)定了比格犬血漿中的紅景天苷和酪醇含量。其中，紅景天苷的定量下限為0.02 μmol/L，質(zhì)量濃度相當(dāng)于6.01 ng/ml。該方法的樣品處理方式為先用乙腈蛋白沉淀法去除基質(zhì)中的蛋白組分，上清溶液經(jīng)堿化后孵育進(jìn)行衍生化，最后用甲基叔丁基醚進(jìn)行液液萃取，氮?dú)獯蹈蓮?fù)溶后進(jìn)樣。雖檢測(cè)限滿足體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)分析，在批量處理樣品時(shí)條件苛刻且步驟復(fù)雜。且以上研究均未對(duì)紅景天苷在比格犬體內(nèi)絕對(duì)生物利用度進(jìn)行評(píng)估。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立準(zhǔn)確、快速、靈敏的LC-MS/MS 法測(cè)定比格犬血漿中紅景天苷含量，并對(duì)其絕對(duì)生物利用度進(jìn)行研究。血漿樣品預(yù)處理采用蛋白沉淀，并將驗(yàn)證后的方法應(yīng)用于臨床前藥動(dòng)學(xué)研究，包括生物利用度研究，為支持臨床藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Triple quad 5500 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（加拿大AB Sciex 公司）；島津液相色譜系統(tǒng)(包括DGU-20A3R型脫氣機(jī)、LC-30AD 型二元液相泵、SIL-30AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器和CTO-20A 型柱溫箱，日本島津公司）。Elma sonic P 300H 超聲波清洗器（德國(guó)埃爾瑪公司）；XPR6UD5和XPE205 型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

紅景天苷（海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，含量99.0%，批號(hào)：20180901）；天麻素（內(nèi)標(biāo)，上海同田生物技術(shù)有限公司，含量：98.9% 批號(hào)：4031921）。甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，Sigma-Aldrich 公司）；超純水（自制，Millipore 純水儀）。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

Symmetry RP18色譜柱（Waters 公司，100 mm×4.6 mm, 3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B：含0.1%甲酸和20%乙腈的甲醇溶液；等度洗脫比例為35%流動(dòng)相B；流速0.4 ml/min，進(jìn)樣量：2 μl。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源；負(fù)離子方式檢測(cè)；源噴射電壓為-4500 V；去溶劑溫度為550 ℃；霧化器壓力(GS1): 75 psi；輔助氣壓力(GS2): 60 psi；氣簾氣體壓力為35 psi；入口電壓(EP): -10 V；碰撞室出口電壓(CXP): -14 V；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，掃描時(shí)間為100 ms。霧化氣、氣簾氣、碰撞氣由氮?dú)獍l(fā)生器產(chǎn)生；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，離子監(jiān)測(cè)通道為：m/z 299.1→118.9（紅景天苷），m/z 285.1→122.9（天麻素）。紅景天苷和天麻素去簇電壓分別為-70 和-40 eV，碰撞能量分別為-19 和-17 eV。

1.3 溶液的制備

1.3.1 紅景天苷儲(chǔ)備液和工作溶液

分別精密稱取紅景天苷對(duì)照品2 份，用40%乙腈水溶液溶解并定容，獲得質(zhì)量濃度均為0.2 mg/ml 的紅景天苷儲(chǔ)備液2 份，分別用于配制標(biāo)準(zhǔn)系列樣品和質(zhì)控樣品工作液。按照一定的比例混合，用40%乙腈水溶液稀釋，獲得紅景天苷濃度為：0.2、0.4、2、8、32、80、180 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)系列樣品工作液和濃度為0.2、0.6、10、160 μg/ml 的質(zhì)控樣品工作液。于4 ℃保存，備用。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液和工作溶液

精密稱取天麻素對(duì)照品一份，用40%乙腈水溶液溶解并定容，獲得質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml 的天麻素儲(chǔ)備液一份。以40%乙腈水溶液稀釋內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液獲得4 000 ng/ml 的內(nèi)標(biāo)工作溶液，于4 ℃保存，備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列樣品和質(zhì)控樣品的制備

取 標(biāo) 準(zhǔn) 系 列 溶 液 或 儲(chǔ) 備 液50 μl 至1.5 ml EP 管中，加入比格犬空白血漿950 μl，渦旋10 s，獲得紅景天苷濃度為10、20、100、400、1 600、4 000、9 000、10 000 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)系列樣品以及濃度為10、30、500 和8 000 ng/ml 質(zhì)控樣品。標(biāo)準(zhǔn)系列樣品每日新鮮配制，質(zhì)控樣品于-20 或-70 ℃保存，備用。

1.5 血漿樣品處理

精密吸取血漿50 μl，置于Axygen 96 孔深孔板中，加入內(nèi)標(biāo)50 μl，渦旋1 min，加入450 μl 甲醇，渦旋3 min，3000 r/min 離心10 min，取出上清液300 μl，氮 氣 吹 干，加 入10%乙 腈200 μl，渦 旋3 min 后，取2 μl 進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分在上海新岡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)完成。比格犬，體重6～8 kg，雌雄各半；年齡24～30 周，給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥后4 h 統(tǒng)一進(jìn)食。

比格犬口服組（n=6，雌雄各半）給予紅景天苷原料藥15 mg/kg，分別于給藥前0.5 h 內(nèi)和給藥后即刻、15、30、45 min 及1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、16、24 h 經(jīng)前肢靜脈取血1 ml 置于肝素鈉抗凝試管中，離心10 min (3 000 r/min，4 ℃)分離血漿，-70 ℃保存待測(cè)。

比格犬靜脈注射組（n=6，雌雄各半）給予紅景天苷原料藥1.5 mg/kg，分別于給藥前0.5 h 內(nèi)和給藥后即刻、2、5、10、20、30、45 min 及1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 經(jīng)前肢靜脈取血1 ml 置于肝素鈉抗凝試管中，離心10 min（3000 r/min, 4 ℃）分離血漿，-70 ℃保存待測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

將所建立并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法應(yīng)用于紅景天苷動(dòng)物藥動(dòng)學(xué)研究。所得的血漿濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用Phoenix WinNonlin 8.1 (美國(guó)Pharsight 公司)軟件，以非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。絕對(duì)生物利用度（Fabs）計(jì)算方法見(jiàn)公式（1）：

式中：AUC0-∞ (po)為口服給藥后AUC0-∞統(tǒng)計(jì)值；AUC0-∞ (iv)為靜脈注射后AUC0-∞統(tǒng)計(jì)值；Dosepo為口服劑量；Doseiv為靜脈注射劑量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

分別取6 個(gè)不同來(lái)源的比格犬空白血漿樣品以及用相應(yīng)比格犬空白血漿配制的定量下限（LLOQ）樣品進(jìn)行LC-MS/MS 分析測(cè)定，考察不同來(lái)源空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

結(jié)果表明，比格犬空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾紅景天苷的測(cè)定，同時(shí)內(nèi)標(biāo)不干擾待測(cè)物的測(cè)定，待測(cè)物對(duì)內(nèi)標(biāo)也無(wú)影響。

2.2 色譜特性

在選定的條件下，紅景天苷和內(nèi)標(biāo)峰形良好，紅景天苷的保留時(shí)間約為1.6 min，內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為1.2 min，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測(cè)定?？瞻籽獫{、紅景天苷及內(nèi)標(biāo)、紅景天苷及內(nèi)標(biāo)加入空白血漿中的色譜圖、比格犬口服1.5 h 樣品中紅景天苷及內(nèi)標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 線性范圍

取“1.4”項(xiàng)下制備的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品50 μl，按照“1.5”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法操作，以每個(gè)待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)(W= 1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r 均＞0.998 6。比格犬血漿樣品中紅景天苷濃度在10～1 0000 ng/ml 與峰面積比線性良好，最低定量濃度為10 ng/ml。典型標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y =0.003 48X+0.000 397(r=0.999 1)。

2.4 定量下限

取比格犬LLOQ 血漿樣品（紅景天苷質(zhì)量濃度為10 ng/ml）進(jìn)行6 份樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d 并分別根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得每份樣本的測(cè)得濃度。求得該質(zhì)量濃度紅景天苷的日內(nèi)精密度分別為8.3%，日間精密度為7.3%，準(zhǔn)確度（RE）為6.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LC-MS/MS 法測(cè)定比格犬血漿中紅景天苷的定量下限為10 ng/ml。

2.5 精密度與準(zhǔn)確度

取比格犬低、中、高3 個(gè)濃度質(zhì)控樣品，按照“1.5”項(xiàng)下操作，每個(gè)濃度進(jìn)行6 樣本分析并在連續(xù)3 d 內(nèi)測(cè)試，分別根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每份樣本的測(cè)得濃度并根據(jù)QC 樣品結(jié)果計(jì)算本方法日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。

圖1 紅景天苷典型質(zhì)量色譜圖

紅景天苷質(zhì)控（QC）樣品的精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表1。待測(cè)物低、中、高質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品測(cè)定相關(guān)要求。待測(cè)物低、中、高質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品測(cè)定相關(guān)要求。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

分別取6 個(gè)不同來(lái)源比格犬空白血漿和一份空 白 溶 血 血 漿50 μl，不 加 內(nèi) 標(biāo) 溶 液（用50 μl 40%乙腈替代內(nèi)標(biāo)工作溶液），按照“1.5”項(xiàng)下操作，40 ℃氮?dú)庀麓蹈?，加?00 μl 由流動(dòng)相配制的相對(duì)應(yīng)的低、高濃度對(duì)照質(zhì)控溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦流后離心5 min，取2 μl 進(jìn)行LC-MS/MS 分析，獲得相應(yīng)峰面積(A)。同時(shí)，另取去離子水50 μl 代替比格犬空白血漿，按上述方法操作獲得相應(yīng)峰面積(B)。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，公式為A/B×100%，并以分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)比值計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化的常規(guī)基質(zhì)效應(yīng)和溶血血漿基質(zhì)效應(yīng)。

表1 紅景天苷精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

在比格犬常規(guī)血漿樣品中，紅景天苷低、高濃度經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的基質(zhì)效應(yīng)分別為96.3%和96.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為8.4%和4.1%。溶血血漿樣品中，低、高濃度經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的基質(zhì)效應(yīng)分別為99.4%和96.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為5.0%和7.0%。

結(jié)果表明，待測(cè)物紅景天苷在本試驗(yàn)選擇的色譜和質(zhì)譜條件下，可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.7 提取回收率

采用比格犬空白血漿配制的低、中、高3 個(gè)濃度的血漿樣品，按照“1.5”項(xiàng)下操作，每個(gè)濃度進(jìn)行6 樣本分析。同時(shí)另取比格犬空白血漿50 μl，不加內(nèi)標(biāo)溶液（用50 μl 40%乙腈溶液替代內(nèi)標(biāo)工作溶液），其余按照“1.5”項(xiàng)下操作，于40 ℃氮?dú)庀麓蹈珊?，加入?duì)應(yīng)的低、中、高濃度對(duì)照質(zhì)控溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦流5 min，取2 μl 進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)峰面積(n=3)。用提取后色譜峰面積與未經(jīng)提取的色譜峰面積之比計(jì)算提取回收率。

比格犬血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀處理后，紅景天苷在低、中、高濃度的回收率分別為91.8%、94.3%和89.5%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察了紅景天苷儲(chǔ)備液和工作溶液室溫6 h、比格犬血漿樣品室溫放置24 h、比格犬血漿樣品-20 ℃/-70 ℃經(jīng)歷5 次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性以及比格犬血漿樣品-20 ℃/-70 ℃經(jīng)歷22 d 冷凍后的穩(wěn)定性。全血樣品室溫/濕冰放置2 h、樣品處理后自動(dòng)進(jìn)樣器放置96 h。

結(jié)果表明，紅景天苷儲(chǔ)備液和工作溶液室溫至少6 h、血漿樣品中在室溫放置24 h、-20 ℃/-70 ℃凍存22 d、在-20 ℃/-70 ℃存放條件下反復(fù)室溫凍融5 次，以及樣品處理后，在自動(dòng)進(jìn)樣器放置96 h，紅景天苷能夠保持良好的穩(wěn)定性。自全血采集至分離待測(cè)血漿樣本的室溫/濕冰2 h 內(nèi)，紅景天苷在全血中保持穩(wěn)定。

2.9 稀釋效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)考察了血漿濃度超出定量上限的比格犬血漿樣品，經(jīng)空白比格犬血漿稀釋后的準(zhǔn)確度。取紅景天苷的稀釋質(zhì)控樣品（比格犬血漿樣品紅景天苷質(zhì)量濃度為80 000 ng/ml），用空白比格犬血漿稀釋20 倍后，按“1.5”項(xiàng)下操作，進(jìn)行6 份樣本分析。結(jié)果表明，比格犬血漿樣品經(jīng)空白比格犬血漿稀釋20 倍后測(cè)定不影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.10 紅景天苷在比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

比格犬單劑量口服給藥紅景天苷15 mg/kg 或靜脈注射紅景天苷1.5 mg/kg 后，按“1.6”項(xiàng)下采集的各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品，并按照“1.5”項(xiàng)下操作，進(jìn)行LC-MS/MS 分析，測(cè)定紅景天苷的比格犬血漿濃度?？诜o藥紅景天苷15 mg/kg 和靜脈注射紅景天苷1.5 mg/kg 后的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)曲線分別見(jiàn)圖2 和圖3。采用WinNonlin 軟件以非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（表2、表3）。

圖2 比格犬口服給藥紅景天苷（15 mg/kg）后的血藥濃度-時(shí)間曲線(± s, n=6)

圖3 比格犬靜脈注射紅景天苷（1.5 mg/kg）后的血藥濃度-時(shí)間曲線(± s, n=6)

本試驗(yàn)以比格犬單劑量靜注給藥紅景天苷1.5 mg/kg 后體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC0-∞為參比，計(jì)算比格犬單次口服給藥紅景天苷入血的絕對(duì)生物利用度?？紤]到比格犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)個(gè)體差異的特殊性，采用6 條比格犬（雌雄各半）單劑量口服給藥紅景天苷15 mg/kg 及6 條比格犬（雌雄各半）單劑量靜注給藥紅景天苷1.5 mg/kg 后，血漿AUC0-∞的平均值進(jìn)行比較，得到紅景天苷在比格犬體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度為（43.9±11.2）%。

表2 比格犬口服15 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s, n=6)

表2 比格犬口服15 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s, n=6)

參數(shù) 雄性犬 雌性犬 平均值A(chǔ)UC0-t（ng·h/ml） 15 976±1 702 25 095±1 527 20 535±5 200 AUC0-∞（ng·h/ml） 16 005±1 703 25 211±1 692 20 608±5 266 MRT0-∞（t/h） 2.20±0.561 2.39±0.055 2.29±0.371 t1/2z（t/h） 1.02±0.108 1.61±0.845 1.31±0.628 CLz（L/h·kg） 0.945±0.105 0.597±0.039 0.771±0.203 Vz（L/kg） 1.39±0.232 1.35±0.613 1.37±0.415 cmax（ng/ml） 7 867±2 978 11 493±3 995 9 680±3 725 F(%) 34.2±4.9 55.2±7.4 43.9±11.2

表3 比格犬靜注1.5 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s, n=6)

表3 比格犬靜注1.5 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s, n=6)

參數(shù) 雄性犬 雌性犬 平均值A(chǔ)UC0-t（ng·h/ml） 4 735±1 050 4 557±415 4 646±721 AUC0-∞（ng·h/ml） 4 781±1 042 4 602±411 4 691±715 MRT0-∞（t/h） 1.010±0.064 1.030±0.048 1.020±0.052 t1/2z（t/h） 0.933±0.028 1.03±0.174 0.980±0.132 CLz（L/h·kg） 0.325±0.078 0.328±0.028 0.326±0.052 Vz（L/kg） 0.437±0.104 0.487±0.102 0.462±0.096 cmax（ng/ml） 9 000±1 526 9 620±2 037 9 310±1 645

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)紅景天苷的藥動(dòng)學(xué)研究多集中在小動(dòng)物種屬（大鼠、小鼠），僅有少量在比格犬上的研究，且絕對(duì)生物利用度未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的LCMS/MS 分析方法，并應(yīng)用于比格犬體內(nèi)紅景天苷絕對(duì)生物利用度的考察。

在前期的方法考察中，血漿提取方法考察了蛋白沉淀法[沉淀試劑考察甲醇、乙腈、甲醇（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）]、液-液萃取法（萃取試劑考察乙酸乙酯、氯仿和異丙醇）。紅景天苷在常規(guī)液液萃取溶劑中回收率較差。而蛋白沉淀法中基質(zhì)效應(yīng)較為明顯，紅景天苷及其內(nèi)標(biāo)天麻素在初始色譜條件下均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)抑制現(xiàn)象。

以往的研究中，并未見(jiàn)藥典中針對(duì)生物分析方法驗(yàn)證所要求的特殊基質(zhì)（溶血、高脂血等）基質(zhì)效應(yīng)的考察。因高脂血研究不適用于比格犬試驗(yàn)，固本次僅新增對(duì)溶血血漿中基質(zhì)效應(yīng)的考察。且前期發(fā)現(xiàn)在LC-MS/MS 檢測(cè)紅景天苷濃度時(shí)，溶血血漿在提取后嚴(yán)重抑制了紅景天苷的響應(yīng)，使其無(wú)法準(zhǔn)確定量。本實(shí)驗(yàn)最終采用甲醇作為沉淀試劑，蛋白沉淀后吹干的方式，對(duì)提取物進(jìn)行濃縮，并使用10%乙腈溶液復(fù)溶，減少了進(jìn)樣過(guò)程中的溶劑效應(yīng)，從而進(jìn)一步改善了峰型。同時(shí)，通過(guò)對(duì)色譜柱的篩選和流動(dòng)相成分的優(yōu)化，使得原始方法中血漿的內(nèi)源性共流出組分和待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)在不同時(shí)間出峰，很大程度上避免了干擾現(xiàn)象，并顯著改善了基質(zhì)效應(yīng)。

另外，結(jié)合以往對(duì)大鼠試驗(yàn)中對(duì)紅景天苷生物利用度差異和劑量關(guān)系的研究，說(shuō)明本試驗(yàn)在合理的給藥劑量下，所呈現(xiàn)的生物利用度數(shù)值有著很高的可靠度和參考價(jià)值。在較低的給藥劑量下，所建立的LC-MS/MS 方法，定量范圍為10～10 000 ng/ml，能充分滿足本實(shí)驗(yàn)研究的需要。且此方法的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等均符合方法學(xué)要求，方法可靠，能夠準(zhǔn)確測(cè)定比格犬血漿中紅景天苷的濃度，評(píng)價(jià)其在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為。

本研究填補(bǔ)了紅景天苷在比格犬體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度研究的空白，為以后臨床試驗(yàn)中推測(cè)人體內(nèi)暴露量，考察生物利用度提供了參考數(shù)據(jù)，同時(shí)為臨床選擇給藥途徑提供了依據(jù)。