白術(shù)黃連微丸結(jié)腸靶向膠囊的制備及體外釋放研究

唐曉萌，駱錦前，汪五清，顧永衛(wèi)，劉繼勇, （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 004；. 復(fù)旦大學(xué)附屬閔行中心醫(yī)院皮膚科，上海 099；. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥劑科，上海 000）

微丸是指直徑小于2.5 mm(或0.5～1.5 mm)的球形或類球形固體劑型[1]。相比傳統(tǒng)的中藥水煎劑和化學(xué)藥片劑，微丸具有能夠提高藥物與胃腸道的接觸面積，增加藥物的生物利用度；載藥范圍寬，流動(dòng)性好，體積小等特點(diǎn)；且單個(gè)微丸的缺陷不影響制劑的整體釋放效果，尤其適用于復(fù)方制劑的配伍，同時(shí)能夠提高藥物的穩(wěn)定性[2-4]。

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病[5]。傳統(tǒng)的UC 治療藥物包括腎上腺皮質(zhì)激素類（如潑尼松）、氨基水楊酸類（如美沙拉嗪）和免疫抑制劑類（如硫唑嘌呤）等，上述藥物針對(duì)輕重度患者均有較好的治療效果，但只能緩解癥狀，且長(zhǎng)期應(yīng)用副作用較大[6-7]。中醫(yī)藥在治療潰瘍性結(jié)腸炎方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，但劑型的落后、給藥方式的局限在很大程度上影響了中藥療效的發(fā)揮[8-9]。本研究選擇中藥臨床驗(yàn)方“白術(shù)黃連方[10]”為模型方劑，根據(jù)其組方特點(diǎn)和藥物成分特性，以膜控型包衣微丸為給藥載體，將其處方中的藥物分別制備成“胃溶微丸”和“腸溶微丸”，進(jìn)一步組合成結(jié)腸靶向給藥膠囊，以期為臨床潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供一種新的有效制劑，同時(shí)為復(fù)方中藥新藥開(kāi)發(fā)提供方法學(xué)借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

101A-2 型干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；AG285十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SB100D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；5804R 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；FlexStream? MP1 流化床、NICA? E140 擠出機(jī)、NICA? S450 滾圓機(jī)（德國(guó)基伊埃技術(shù)設(shè)備有限公司）；RCZ-6C3 型藥物溶出儀（上海黃海藥檢儀器廠）。

1.2 試藥

白術(shù)揮發(fā)油（批號(hào)：XC20170225）、黃連提取物（批號(hào)：XC20170113）、防風(fēng)提取物（批號(hào)：XC20170216）購(gòu)自西安小草植物科技有限公司；鹽酸小檗堿對(duì)照品（按含C20H18ClNO4計(jì)為86.7%，批號(hào)：5UVU-ZFW7）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；β-環(huán)糊精（β-CD，曲阜市天利藥用輔料有限公司，批號(hào)：161202）；微晶纖維素（MCC，湖州市菱湖新望化學(xué)有限公司，批號(hào)：P101D0516N09）；無(wú)水乳糖（ DMV-Fonterra Excipients GmbH & Co.KG，Germany，批號(hào)：10147P9）；交聯(lián)聚維酮（PVPP XL-10， 上 海 源 葉 生 物 科 技 有 限 公 司， 批 號(hào)：B22A7S19749）；丙烯酸樹(shù)脂EUDRAGIT?L30D-55（以下簡(jiǎn)稱L30，批號(hào)：B170314162）、丙烯酸樹(shù)脂EUDRAGIT?FS30D（以 下 簡(jiǎn) 稱FS30，批 號(hào)：C170265001）購(gòu)自Evonic Rolm GmbH 公司；羥丙甲基纖維素（HPMC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：K1717099）；檸檬酸三乙酯（TEC，上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司，批號(hào)：170712）；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿HPLC 含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（0.5%三乙胺，磷酸調(diào)至pH=3）等度洗脫，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μl。

2.1.2 方法學(xué)考察

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品1.0 mg，用甲醇溶解定容于10 ml 容量瓶中作為儲(chǔ)備液，將此儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋成系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。取少量腸溶微丸研碎，稱取一定量粉末，加入甲醇，超聲提取30 min，3 000 r/min 離心后取上清，定容后過(guò)0.45 μm 濾膜得到供試品溶液。同法制備空白輔料溶液。方法學(xué)考察表明，鹽酸小檗堿在（0.05～50.00）μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=100 513X-5 262.7（r=0.999 9）。甲醇、空白輔料對(duì)腸溶微丸中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定沒(méi)有干擾，專屬性良好（圖1）。取濃度為10.0、20.0和50.0 μg/ml 的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄色譜圖峰面積，得到3 個(gè)濃度的鹽酸小檗堿的日內(nèi)精密度結(jié)果分別為0.19%、0.42%、1.52%，日間精密度分別為0.58%、1.43%、1.28%。稱取適量黃連提取物，分別加入濃度為10.0、20.0、50.0 μg/ml 的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，超聲提取30 min，3000 r/min 離心后取上清液，定容后過(guò)0.45 μm 濾膜，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，加樣回收率RSD 分別為0.85%、1.90%、0.60%，表明該方法可用于腸溶微丸中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定。

圖1 鹽酸小檗堿的HPLC 圖

2.2 腸溶微丸的制備

2.2.1 丸芯處方單因素篩選

載藥量、填充劑比例、潤(rùn)濕劑和黏合劑的用量對(duì)微丸的成型起到至關(guān)重要的作用。因此，我們采用單因素篩選的方法對(duì)上述4 個(gè)因素進(jìn)行了考察，評(píng)價(jià)的指標(biāo)分別為微丸的圓整度、目標(biāo)微丸的收率和物料黏性。

根據(jù)處方，黃連提取物與防風(fēng)提取物的比例為15∶12。固定MCC：乳糖=5∶2，PVPP 用量5%，水為潤(rùn)濕劑，6% HPMC 為黏合劑?？疾燧d藥量對(duì)微丸圓整度、收率及物料黏性的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 載藥量對(duì)微丸特性的影響

同樣采用單因素篩選的方法分別對(duì)填充劑比例、潤(rùn)濕劑用量和黏合劑用量進(jìn)行了考察。固定載藥量為27%，以水為潤(rùn)濕劑，PVPP 用量為5%，6%HPMC 為黏合劑，考察MCC 與乳糖之比對(duì)微丸圓整度、收率及物料黏性的影響；固定載藥量為27%，PVPP 用量5%，6% HPMC 為黏合劑，考察潤(rùn)濕劑的用量對(duì)微丸圓整度、收率及物料黏性的影響；固定載藥量為27%，PVPP 用量5%，水為潤(rùn)濕劑，考察黏合劑6% HPMC 的用量對(duì)微丸圓整度、收率及物料黏性的影響。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，綜合考慮微丸圓整度、收率和物料黏性等因素，最終確定優(yōu)化后的丸芯處方為：載藥量27%，PVPP 5%，MCC 與乳糖之比5∶2，潤(rùn)濕劑占干物料比重30%，黏合劑占干物料比重20%，并以此條件制備3 批丸芯進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明處方配比合理。

2.2.2 工藝參數(shù)的優(yōu)化

選取擠出速度、滾圓速度和滾圓時(shí)間進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。按照表2 分組進(jìn)行微丸的制備，每組按投入干物料100 g進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。計(jì)算目標(biāo)微丸收率Y（%，18～30 目）和微丸圓整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

結(jié)果表明，3 個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序?yàn)锽＞A＞C，表3 方差分析結(jié)果表明，3 個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分并無(wú)顯著影響(P＞0.05)?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中較大的滾圓速度有利于減少微丸細(xì)粉的產(chǎn)生并提高生產(chǎn)效率，最終確定優(yōu)化后的工藝參數(shù)為A1B2C3，即擠出速度20 Hz，滾圓速度700 r/min，滾圓時(shí)間7 min。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.3 隔離衣的包制

藥物在溶出時(shí)，完整的包衣膜決定了微丸內(nèi)部和介質(zhì)之間存在一定的滲透壓差。丸芯內(nèi)外壓差對(duì)藥物的釋放影響作用較大，因此，在處方篩選過(guò)程中，必須考察丸芯的隔離情況[11]。包制隔離衣后，也使后續(xù)包制的腸溶衣膜厚度更加均勻，保證了包衣過(guò)程的連續(xù)性。固定丸芯原輔料比例不變，分別考察了隔離衣增重為2%、4%、6%和8%時(shí)腸溶微丸中鹽酸小檗堿的釋放情況，累積釋放曲線如圖2A。結(jié)果表明隔離衣增重對(duì)累積釋放度的影響不顯著，最終采用4%的HPMC 溶液進(jìn)行隔離衣的包制，包衣增重為丸芯重量的2%。

圖2 對(duì)腸溶微丸累積釋放度產(chǎn)生影響的幾種因素

2.2.4 腸溶衣的包制

聚合物比例、增塑劑用量和包衣增重是調(diào)節(jié)膜控型微丸釋藥速率的3 個(gè)關(guān)鍵因素。因此，同樣采用單因素篩選的方法對(duì)上述3 個(gè)因素進(jìn)行考察，并繪制不同參數(shù)下的累積釋放曲線。

固定微丸的隔離衣增重為2%，腸溶衣增重為15%，考察聚合物不同比例對(duì)鹽酸小檗堿累積釋放度的影響，累積釋放曲線如圖2B 所示，結(jié)果表明，當(dāng)L30 與FS30 之比為1∶2，符合對(duì)累積釋放度設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)。

固定L30 與FS30 之比為1∶2，包衣增重為15%，考察增塑劑用量占干聚物比例為5%、10%、15%、20%和25%時(shí)對(duì)微丸中鹽酸小檗堿累積釋放度的影響。圖2C 結(jié)果表明，當(dāng)增塑劑用量為10%～25%時(shí)，藥物釋放基本滿足給定的標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)增塑劑用量變大時(shí)，微丸包衣難度加大，易產(chǎn)生粘連現(xiàn)象。最終將增塑劑用量定為10%，既能滿足釋放要求，又能保證較高的生產(chǎn)效率。

最后對(duì)包衣增重進(jìn)行篩選，固定L30 與FS30之比為1∶2，考察包衣增重為5%、10%、15%和20%時(shí)對(duì)微丸中鹽酸小檗堿累積釋放度的影響，結(jié)果如圖2D 所示，當(dāng)包衣增重為15%時(shí)，滿足對(duì)累積釋放度設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)單因素篩選的結(jié)果，最終確定包衣處方為：隔離衣增重2%，L30 與FS30 之比為1∶2，增塑劑用量10%，包衣增重為15%。按此處方制備3 批微丸進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，工藝參數(shù)如下：噴嘴直徑1 mm，輸液管直徑3 mm，霧化壓力1.8 bar，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速2.5 r/min，進(jìn)風(fēng)溫度32 ℃，進(jìn)風(fēng)量50 cm2，干燥溫度28 ℃，干燥時(shí)間30 min。結(jié)果表明，據(jù)此條件制備的腸溶微丸滿足對(duì)累積釋放度設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 胃溶微丸的制備

2.3.1 白術(shù)揮發(fā)油β-CD 包合物的制備

采用飽和水溶液法制備包合物。稱取規(guī)定量的β-CD 加入10 倍蒸餾水，置于70 ℃的恒溫水浴鍋中，攪拌使成飽和溶液。在30 ℃下邊攪拌邊緩慢滴加一定量（揮發(fā)油與β-CD 之比為1∶6）白術(shù)揮發(fā)油（用無(wú)水乙醇預(yù)先配置成1∶1 的溶液），恒溫?cái)嚢?.5 h，冷卻至室溫，在4 ℃冰箱中冷藏24 h，抽濾后用無(wú)水乙醇沖洗3 次（每次10 ml），40 ℃干燥4～5 h 即得白術(shù)揮發(fā)油β-CD 包合物[12]。

2.3.2 丸芯處方的單因素考察

參照腸溶微丸的處方篩選過(guò)程，對(duì)胃溶微丸的處方同樣進(jìn)行單因素篩選。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，包合物由于粉末較為細(xì)膩，在與微晶纖維素和乳糖混合后，僅需加入少量水作為潤(rùn)濕劑就可以得到塑性良好的濕物料，且易于擠出-滾圓成丸，因此，胃溶微丸的處方中不再添加黏合劑。僅對(duì)載藥量、填充劑比例和潤(rùn)濕劑用量進(jìn)行考察。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)篩選后最終確定優(yōu)化后胃溶微丸的丸芯處方為：載藥量50%，PVPP5%，微晶纖維素與乳糖之比2∶1，潤(rùn)濕劑占干物料比重40%，并以此條件制備3 批丸芯進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明處方可行。

2.3.3 擠出滾圓工藝參數(shù)的優(yōu)化

同樣選取擠出速度、滾圓速度和滾圓時(shí)間進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。按照表4 分組進(jìn)行微丸的制備，每組按投入干物料100 g 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。計(jì)算目標(biāo)微丸收率Y（%，16～24 目）和微丸圓整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序?yàn)锽＞C＞A，方差分析結(jié)果（表5）表明，3 個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分并無(wú)顯著性影響(P＞0.05)?？紤]到簡(jiǎn)化制備過(guò)程以降低成本，最終確定優(yōu)化后的工藝參數(shù)為A1B1C2，即擠出速度20 Hz，滾圓速度500 r/min，滾圓時(shí)間5 min。

表5 方差分析結(jié)果

2.3.4 胃溶衣的包制

配制濃度為4%的HPMC 溶液，流化床底噴包衣進(jìn)行胃溶衣的包制，包衣增重為2%。包衣參數(shù)如下：噴嘴直徑1 mm，輸液管內(nèi)徑3 mm，霧化壓力1.5 bar，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速2.5 r/min，進(jìn)風(fēng)口溫度45 ℃，進(jìn)風(fēng)量50 m3/h，干燥溫度40 ℃，干燥時(shí)間30 min。

將胃溶微丸與腸溶微丸按照質(zhì)量比1∶1 的比例裝入0 號(hào)硬質(zhì)膠囊，得到白術(shù)黃連微丸口服結(jié)腸靶向膠囊。

2.4 體外釋放度的測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》2015 版四部通則0931 溶出度與釋放度測(cè)定法第二法：槳法，評(píng)價(jià)腸溶微丸的釋藥特性。溶出介質(zhì)體積為750 ml，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度（37±0.5）℃。分別在pH 1.2 的人工胃液中釋放2 h，pH 6.8 的人工小腸液中釋放4 h，pH7.6 的人工結(jié)腸液中釋放18 h，溶出介質(zhì)體積均滿足漏槽條件。分別于1～14 h 之間每1 h 一次，14～24 h 之間每2 h 一次，定時(shí)取樣1 ml，隨后立即補(bǔ)加同溫同體積介質(zhì)1 ml，將收集的樣品過(guò)0.45 μm 濾膜后按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算體外累積釋放度，釋放曲線如圖3 所示。結(jié)果表明，按照最優(yōu)處方制備出的腸溶微丸在人工胃液中2 h 基本不釋放，人工小腸液中4 h 累積釋放量小于10%，人工結(jié)腸液中緩慢釋放，24 h 基本釋放完全，兼具緩釋和結(jié)腸靶向的特性。

圖3 鹽酸小檗堿的體外累積釋放度( ±s，n=6)

2.5 腸溶微丸釋藥行為考察

將腸溶微丸的釋藥曲線分別按零級(jí)、一級(jí)和Higuchi 方程進(jìn)行擬合[13]，得到的結(jié)果如表6 所示。結(jié)果表明，其釋放行為符合Higuchi 方程釋藥模型（r=0.9054）。

表6 腸溶微丸不同釋藥行為的擬合方程

3 討論

本研究首先將處方中黃連的有效成分黃連生物堿和防風(fēng)的有效成分色原酮、多糖等采用L30與FS30 混合包衣，制備腸溶微丸；再將白術(shù)的有效部位——揮發(fā)油類成分通過(guò)環(huán)糊精包合成揮發(fā)油β-CD 包合物，制備成胃溶微丸；然后將兩種微丸按比例混合裝入膠囊，得到口服結(jié)腸靶向膠囊。藥物口服后，能夠發(fā)揮“兩步釋放”的效果，白術(shù)的有效成分首先在胃內(nèi)釋放；黃連生物堿和防風(fēng)色原酮等成分在結(jié)腸部位緩慢釋放，二者合一，體現(xiàn)了中醫(yī)藥整體與局部相結(jié)合的治法治則[14]。

腸溶微丸的制備采用擠出-滾圓工藝和流化床包衣技術(shù)，工藝穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。腸溶微丸中藥物的釋放主要通過(guò)膜控來(lái)實(shí)現(xiàn)，而高分子材料丙烯酸樹(shù)脂L30 和FS30 分別在pH＞5.5 和pH＞7.0 環(huán)境中溶解。因此，可通過(guò)混合并調(diào)節(jié)兩者的用量，獲得在小腸末端開(kāi)始釋放，到達(dá)結(jié)腸后大量釋放的混合材料，起到緩釋和結(jié)腸定位的雙重作用。同時(shí)，本研究使用混合材料進(jìn)行單層衣膜的包制，簡(jiǎn)化了包衣步驟，降低了多層包衣造成的成本損耗。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)處方工藝連續(xù)制備3 批腸溶微丸，釋放度結(jié)果顯示該3 批微丸均具有良好的緩釋效果，且批間差異小，表明本處方工藝合理，簡(jiǎn)單易行，重現(xiàn)性良好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

經(jīng)口服進(jìn)入胃內(nèi)的藥物在2～4 h 后基本會(huì)全部通過(guò)，隨后進(jìn)入小腸繼續(xù)吸收，這一過(guò)程需要5～6 h，最后進(jìn)入結(jié)腸被進(jìn)一步重吸收，12～24 h后才會(huì)排出體外[15]。因此，將微丸中鹽酸小檗堿的釋放度標(biāo)準(zhǔn)定為，在pH1.2 的人工胃液中2 h 基本無(wú)釋放（＜5%），pH6.8 的人工小腸液中4 h 累積釋放度＜10%，pH7.8 的人工結(jié)腸液中6 h 累積釋放度＞60%。聚合物比例決定了腸溶衣膜溶解的速率，進(jìn)而影響藥物的釋放度。適量增塑劑的加入可降低玻璃化溫度和最低成膜溫度，有助于提高包衣膜的完整性，檸檬酸三乙酯類的增塑劑還能夠增加包衣膜的柔性。通過(guò)對(duì)包衣增重的調(diào)整，也可以使藥物的釋放度符合預(yù)期的設(shè)計(jì)。

將白術(shù)揮發(fā)油包合后，能夠有效掩蓋藥物的不良?xì)馕?，同時(shí)增加有效成分的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了液體藥物向固體制劑的轉(zhuǎn)化。胃溶微丸在口服后，表面衣膜與介質(zhì)接觸后不斷溶脹，由于溶脹層較薄，丸芯中的MCC 和乳糖吸水后大幅膨脹導(dǎo)致微丸迅速崩解成細(xì)顆粒，溶出介質(zhì)將包合物溶解后形成濃度差，促進(jìn)了藥物的擴(kuò)散釋放，有利于藥物迅速吸收入血，發(fā)揮全身作用。