廣東10個(gè)屠宰場(chǎng)豬肉中3種食源性致病菌的檢測(cè)

韓依辛，田 雅，馬廣宇，丁 立，鄧森榮，魏琦麟，徐志宏，2，向 蓉，2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站， 廣東廣州 510640;2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心，廣東肇慶 526238)

隨著對(duì)肉、蛋、奶等動(dòng)物性食品需求的不斷增加，食品安全問(wèn)題也成為了一大熱點(diǎn)問(wèn)題。食品安全一直是我國(guó)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，其在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)中均有存在的可能。消費(fèi)者一旦誤食被食源性致病菌污染的食品，極易引起食物中毒，還易導(dǎo)致各類(lèi)食源性疾病的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命[1]。

腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7是一種全球性食源性致病菌，人感染后會(huì)引起腹瀉、出血性腸炎等，更嚴(yán)重的是通過(guò)產(chǎn)生的類(lèi)志賀菌毒素作用在腎臟、腸道，引起嚴(yán)重的溶血尿毒癥綜合征[2-3]。沙門(mén)氏菌在全球細(xì)菌性食物中毒中的分離率最高，在我國(guó)也有同樣的規(guī)律，攝入沙門(mén)氏菌后引起腸胃炎，典型癥狀包括包括發(fā)熱、嘔吐、嚴(yán)重的腹瀉，極端情況下可以發(fā)展為系統(tǒng)性感染[4-5]。空腸彎曲菌的內(nèi)毒素能侵襲小腸和大腸黏膜引起急性腸炎，亦可引起腹瀉的暴發(fā)流行或集體食物中毒[6-7]。腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7、沙門(mén)氏菌和空腸彎曲菌都是重要的人畜共患病致病菌和食源性病原菌。畜禽如果感染這3種細(xì)菌，可進(jìn)入到肉品中，再通過(guò)食物鏈傳遞到人。屠宰作為生豬生產(chǎn)和豬肉流通的“連接鏈”，只有做好每個(gè)環(huán)節(jié)的監(jiān)測(cè)，才能真正起到保障食品安全的作用。為了解廣東惠州和清遠(yuǎn)地區(qū)生豬屠宰場(chǎng)豬肉產(chǎn)品食源性致病菌的污染情況，在兩地各選5家生豬屠宰場(chǎng)，采集498頭豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，以期對(duì)當(dāng)?shù)赝涝篆h(huán)節(jié)的豬肉及肉制品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希氏菌O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC35150，腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC14028和空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC33291，均購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑 EC新生霉素增菌肉湯、SC(亞硒酸鹽胱氨酸增菌液)、Bolton肉湯基礎(chǔ)，山梨醇麥康凱瓊脂平板、DHL(膽硫乳瓊脂)和Skirrow血瓊脂，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；用于配制Bolton肉湯的頭孢哌酮、萬(wàn)古霉素、三甲氧芐胺嘧啶乳酸鹽、兩性霉素B、多黏菌素B、無(wú)菌脫纖維綿羊血，2×TaqPCR Master Mix、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、GeneRed核酸染料、瓊脂糖、甘油、Tris堿、冰乙酸，均購(gòu)自廣州順?shù)h生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS)，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱(LRH)：上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Eppendorf PCR擴(kuò)增儀(Mastercycler X50S)，德國(guó)艾本德股份公司(Eppendorf AG)產(chǎn)品；核酸電泳儀(PowerPacTM Basic)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(ZF-258)，上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)品；多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng)(MPI)，廣州市尤德生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 樣本 2019年，在廣東惠州和清遠(yuǎn)兩地各選5家生豬定點(diǎn)屠宰場(chǎng)，于凌晨屠宰過(guò)程中同步采集豬前排肉，每頭豬采集豬肉50 g，每個(gè)屠宰場(chǎng)約50份豬肉樣本，共采集生豬樣本498份。

1.2 方法

1.2.1 樣本的處理 屠宰場(chǎng)采集的豬前排肉無(wú)菌薄膜包裝后0 ℃～4 ℃條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，無(wú)菌剪取深層的肉樣10 g/份，共3份，剪碎。1份加入90 mL EC新生霉素增菌肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，用于大腸埃希氏菌O157:H7的增菌培養(yǎng)；1份加入90 mL SC肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，用于沙門(mén)氏菌的增菌培養(yǎng)；另1份加入90 mL Bolton肉湯(Bolton肉湯的配制參考GB4789.9-2014)，37 ℃預(yù)增菌4 h后轉(zhuǎn)入42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h，用于空腸彎曲菌的增菌培養(yǎng)。

移取2 mL 增菌液至滅菌EP 管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清，然后加入100 μL滅菌去離子水重懸沉淀，于沸水中加熱10 min～15 min，迅速轉(zhuǎn)冰浴5 min，再次10 000 r/min離心5 min，收集上清液，作為下一步PCR反應(yīng)模板。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 參考文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]，針對(duì)大腸埃希氏菌O157:H7的rfbE和fliC基因、沙門(mén)氏菌的invA基因和空腸彎曲菌的VS基因設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[8]，大腸埃希氏菌O157:H7的2個(gè)待檢基因采用多重PCR，其余2種細(xì)菌普通PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系：粗提DNA模板4 μL，上、下游引物各2 μL(多重PCR中rfbE和fliC基因上、下游引物各1 μL)，2×TaqPCR Ma-ster Mix 25 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，各自退火溫度下40 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增出目的條帶的切膠回收目的條帶后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選出疑似陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定。

表1 3種細(xì)菌的檢測(cè)基因引物序列

1.2.4 分離純化 PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣本增菌液，大腸埃希氏菌O157:H7增菌液劃線于山梨醇麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，沙門(mén)氏菌增菌液劃線于DHL平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，空腸彎曲菌增菌液劃線于Skirrow血瓊脂平板，42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h。

挑取疑似菌落繼續(xù)利用特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，確定陽(yáng)性的菌落再次劃線純化，挑單菌落加滅菌甘油-80℃凍存。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

大腸埃希氏菌O157:H7 rfbE和fliC基因多重PCR結(jié)果見(jiàn)圖1，疑似陽(yáng)性樣本在2個(gè)目的條帶處均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶。 沙門(mén)氏菌invA基因的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2，疑似陽(yáng)性樣本擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶。空腸彎曲菌VS基因的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3，除標(biāo)準(zhǔn)株陽(yáng)性對(duì)照之外，無(wú)樣本擴(kuò)出目的條帶。

1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3.陽(yáng)性樣品；4～8.陰性樣品；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

以上陽(yáng)性PCR產(chǎn)物測(cè)序序列在GenBank里經(jīng)Blast比對(duì)，均確定為目的基因。

1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3.陽(yáng)性樣品；4～8.陰性樣品；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

1.陰性對(duì)照；2～8.臨床樣本；9.陽(yáng)性對(duì)照；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

大腸埃希氏菌O157:H7增菌液劃線于山梨醇麥康凱瓊脂平板后，長(zhǎng)出呈淡褐色中心菌落，扁平透明，邊緣光滑，直徑約2 mm(圖4a)。

沙門(mén)氏菌增菌液劃線于DHL平板后，長(zhǎng)出無(wú)色半透明或粉紅色菌落，產(chǎn)硫化氫(H2S)，菌落中心黑色或幾乎全黑色(圖4b)。

空腸彎曲菌增菌液在Skirrow血瓊脂平板未有菌落長(zhǎng)出。

A.E.coli O157:H7;B.Salmonella

2.3 3種食源性致病菌檢出結(jié)果

大腸埃希氏菌O157:H7陽(yáng)性樣本數(shù)2份，檢出率0.4%；沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣本數(shù)70份，檢出率14.06%；空腸彎曲菌陽(yáng)性樣本數(shù)0。不同地區(qū)大腸埃希氏菌O157:H7和空腸彎曲菌檢出結(jié)果類(lèi)似，但沙門(mén)氏菌檢出情況不同，惠州地區(qū)檢出率明顯高于清遠(yuǎn)地區(qū)。沒(méi)有樣本同時(shí)檢出2種食源性致病菌(表2)。

表2 3種細(xì)菌檢出結(jié)果

3 討論

食源性致病菌的監(jiān)測(cè)是保證食品安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。方忠意等[11]對(duì)河南5市生豬屠宰場(chǎng)抽取豬盲腸內(nèi)容物樣品進(jìn)行沙門(mén)氏菌分離，從840份樣品中共分離沙門(mén)氏菌45株，分離率為5.36%。本研究中沙門(mén)氏菌的檢出率較高，總檢出率達(dá)到14.06%，惠州地區(qū)高達(dá)21%，清遠(yuǎn)地區(qū)也達(dá)到7.2%，說(shuō)明沙門(mén)氏菌污染現(xiàn)象在惠州和清遠(yuǎn)地區(qū)屠宰場(chǎng)較為嚴(yán)重。洪偉彬等[12]對(duì)廣東東莞畜禽肉制品(凍肉)中大腸埃希氏菌O157：H7 進(jìn)行檢測(cè)，其中豬肉中檢出率為11.76%；朱文冠等[13]于2005年對(duì)廣東地區(qū)從各地屠宰場(chǎng)和肉菜市場(chǎng)采集的樣品中未檢測(cè)出大腸埃希氏菌O157：H7。本研究中大腸埃希氏菌O157：H7檢出率也較低，僅為0.4%，說(shuō)明該菌在這批生豬的攜帶率較低。四川省雅安市豬肉樣品中的空腸彎曲菌陽(yáng)性率為28.3%[14]，青島屠宰場(chǎng)采集的50份豬盲腸內(nèi)容物棉拭子，分離到16株空腸彎曲菌，分離率為32%[15]。本研究498份樣本中未檢測(cè)出空腸彎曲菌，結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，連續(xù)兩年對(duì)省內(nèi)多家屠宰場(chǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)均未檢出空腸彎曲菌，說(shuō)明廣東地區(qū)該菌在生豬屠宰過(guò)程中的污染率較低。

作為生豬生產(chǎn)和豬肉流通的“連接鏈”，屠宰環(huán)節(jié)的微生物污染是影響畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的最重要因素。生豬屠宰并不是在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，在進(jìn)入屠宰場(chǎng)之前，其體表或消化道內(nèi)就可能攜帶多種菌群，在屠宰加工過(guò)程中，也有很多不同環(huán)節(jié)可能導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)鮮肉污染，例如屠宰的刀具、接觸的工人、器皿以及屠宰環(huán)境等。本次檢測(cè)不同菌的檢出率不同可能跟各個(gè)環(huán)節(jié)都有關(guān)。我國(guó)近5年食物中毒統(tǒng)計(jì)資料表明，沙門(mén)氏菌食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中居首位。多發(fā)生在食用畜禽肉、禽蛋類(lèi)，此類(lèi)產(chǎn)品含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，非常適宜于沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)繁殖[16]。本次檢測(cè)的10個(gè)屠宰場(chǎng)中惠州市屠宰場(chǎng)的檢出率明顯高于清遠(yuǎn)市屠宰場(chǎng)，其主要原因可能如下：清遠(yuǎn)市屠宰場(chǎng)機(jī)械化程度高，易于消毒與清潔；清遠(yuǎn)市屠宰場(chǎng)所用屠宰用具消毒頻率高，能有效防止二次污染；清遠(yuǎn)市屠宰場(chǎng)在切除內(nèi)臟時(shí)沖洗胴體頻率更高。屠宰環(huán)節(jié)的微生物控制仍需加強(qiáng)，相關(guān)部門(mén)仍要加強(qiáng)畜禽產(chǎn)品加工、運(yùn)輸過(guò)程的衛(wèi)生監(jiān)管以及加強(qiáng)對(duì)宿主動(dòng)物糞便的無(wú)害化處理監(jiān)管，防止帶菌動(dòng)物及糞便污染以及動(dòng)物產(chǎn)品與其他食物之間的交叉污染，增加屠宰場(chǎng)的機(jī)械化程度，以及屠宰用具的消毒頻率，注意胴體的沖洗，保障豬肉及豬肉制品的安全，進(jìn)而保障消費(fèi)者的健康。