基因Ⅶ型新城疫病毒分離鑒定及免疫原性研究

薛景景，侯瑞卿，王婉冰，張盼濤，袁 月，郭麗霞，張 哲，田 輝，劉武杰*，田克恭*

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471000; 2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽 471000;3.河北省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北石家莊 050000)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的以呼吸道癥狀、消化道癥狀、神經(jīng)癥狀等為特征的烈性傳染病，是嚴(yán)重危害世界和我國養(yǎng)雞業(yè)的重要疫病之一，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。NDV亦被稱為禽Ⅰ型副黏病毒(Avian paramyxovirus type 1，APMV-1)，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)[4]，基因組由一條單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA分子組成，分別編碼包括核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)、大分子聚合酶蛋白(L)在內(nèi)的6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中F蛋白在NDV致病性中起重要作用[5]。根據(jù)NDV感染后的臨床表現(xiàn)，可將其分為緩發(fā)型、中發(fā)型和速發(fā)型3種，而根據(jù)基因組的大小和遺傳進(jìn)化距離，將NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ，ClassⅠ NDV毒力通常較弱；ClassⅡ NDV包含致病力強(qiáng)的毒株，分為21個亞型[6-7]。

在我國，ND為優(yōu)先防控的16種動物疫病之一，養(yǎng)殖場也高度重視ND免疫預(yù)防工作，但隨著NDV流行特點(diǎn)的變化，各地依舊發(fā)生高抗體水平雞群感染NDV的情況[8-9]?，F(xiàn)被廣泛應(yīng)用于ND防疫的La Sota疫苗株分離于1946年，屬于ClassⅡ基因Ⅱ型，而我國目前流行的強(qiáng)毒株則主要為基因Ⅶ型[10]。雖然NDV只有一個血清型，但近幾年分離的Ⅶ型強(qiáng)毒株與La Sota株基因組同源性越來越低，出現(xiàn)能夠逃避La Sota株免疫保護(hù)的強(qiáng)毒株[11]。

本研究分離鑒定了4株NDV流行毒株，并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其F基因高變區(qū)序列，通過遺傳進(jìn)化分析確定分離株均為基因Ⅶ型。根據(jù)分離株致病指數(shù)篩選出毒力最強(qiáng)的PLK-N-06株，研究其與當(dāng)前疫苗株的抗原性差異，通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)評價(jià)現(xiàn)用疫苗株的免疫保護(hù)效果，為新型新城疫疫苗的研發(fā)提供可用的生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2008年-2009年從江蘇、河南和山東等省份的發(fā)病雞場，采集病雞氣管、肺、腦、心臟及脾臟等組織病料。

1.1.2 SPF雞胚及實(shí)驗(yàn)動物 10日齡SPF雞胚及1日齡SPF雞，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司的種蛋自行孵化；30日齡和6周齡SPF雞，北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽性血清及毒株 NDV(基因Ⅶ型)血凝抑制試驗(yàn)(HI)抗原(PLK-N-06抗原)、PLK-N-06株高免血清和LaSota株高免血清，國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心病毒Ⅱ?qū)嶒?yàn)室自制；NDV HI抗原(基因Ⅱ型La Sota抗原)及陽性血清、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)陽性血清及陰性血清，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)H5亞型、H7亞型和H9亞型陽性血清，哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；La Sota毒株由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.4 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ)，Geneaid公司產(chǎn)品；One-Step RT-PCR SuperMix，大連TRANS公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；AGAROSE瓊脂糖，廣州美津生物有限公司產(chǎn)品；1%雞紅細(xì)胞和無菌PBS，國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心病毒Ⅱ?qū)嶒?yàn)室自制。

1.1.5 疫苗 NDV PLK-N-06株和La Sota株油乳劑滅活苗，國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心病毒Ⅱ?qū)嶒?yàn)室按現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝制備。

1.1.6 主要儀器設(shè)備 臺式高速冷凍離心機(jī)(CT15RT),上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀(C1000 Touch)和凝膠成像系統(tǒng)(GeL Doc TMXR)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-2C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；生物安全柜(BHC-1300 Ⅱ A/B3)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離與鑒定 取發(fā)病雞氣管、脾臟和肺臟等病變組織，按1∶3比例加入含雙抗(最終濃度為青霉素2 000 U/mL、鏈霉素2 000 μg/mL)的無菌PBS充分研磨，反復(fù)凍融3次，4 ℃作用4 h，然后經(jīng)3 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育72 h，收獲24 h～72 h死亡及存活的雞胚尿囊液，測定血凝效價(jià)，效價(jià)≥4 log2的尿囊液分別與NDV和EDSV陽性血清，AIV H5、H7和H9陽性血清及陰性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，血凝效價(jià)陰性的尿囊液在SPF雞胚上盲傳2代。鑒定后，將毒株用有限稀釋法連續(xù)純化3代，分別命名為PLK-N-02株、PLK-N-03株、PLK-N-06株和PLK-N-07株。

1.2.2 F基因高變區(qū)序列的測定和遺傳進(jìn)化分析 對比分析GenBank中多株雞源NDV基因，針對F基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增高變區(qū)序列的特異性引物，所設(shè)計(jì)引物送蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列為NDV-F：5'-CAAGATGGGCTCCAGACCTT-3'；NDV-R：5'-GGAGGAATGTTGGCAGCATT-3'，預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為460 bp。按照試劑盒說明書提取分離株雞胚尿囊液總核酸，RT-PCR擴(kuò)增F基因高變區(qū)片段，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃反轉(zhuǎn)錄25 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取RT-PCR產(chǎn)物5 μL，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，取擴(kuò)增片段大小正確的RT-PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

測序結(jié)果用DNA Star軟件分析其F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列。用MegAlign軟件比較測序結(jié)果和常用疫苗株F基因高變區(qū)序列的同源性。用MEGA 6.0軟件對比分離株與GenBank中公布的NDV經(jīng)典毒株基因序列，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹并確定基因型。NDV主要參考毒株登錄號在表1中列出。

1.2.3 病毒致病指數(shù)測定 按照世界動物衛(wèi)生組織(OIE)操作規(guī)程進(jìn)行最小致死量雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)及6周齡SPF雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)測定。

1.2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 取30日齡SPF雞25只，隨機(jī)分為3組，第1組10只腿部肌肉注射免疫PLK-N-06滅活苗20 μL/只，第2組10只腿部肌肉注射免疫La Sota滅活苗20 μL/只，第3組5只，注射等量生理鹽水作為攻毒對照組。免疫后21 d各組分別采血，分離血清，用PLK-N-06抗原和La Sota抗原測定NDV HI抗體。采血后各組雞分別肌肉注射105.0ELD50的PLK-N-06株病毒液，攻毒后連續(xù)觀察14 d，記錄攻毒雞的發(fā)病和死亡情況，攻毒后5 d分別采集泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離。

表1 系統(tǒng)進(jìn)化樹中NDV F基因參考序列的GenBank登錄號

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與鑒定

4份病料處理的上清液接種10日齡SPF雞胚，在24 h～48 h全部死亡，死亡雞胚的胚體全身出血，頭、腹、背和腿有明顯出血點(diǎn)。收獲雞胚尿囊液均能凝集1%雞紅細(xì)胞，效價(jià)為7log2～9log2。HI試驗(yàn)表明分離株可以被NDV陽性血清抑制，而不能被EDSV和AIV(H5、H7、H9)陽性血清抑制，表明分離到的4株病毒為NDV，經(jīng)雞胚有限稀釋法連續(xù)純化3代，分別命名為PLK-N-02株、PLK-N-03株、PLK-N-06株和PLK-N-07株。

2.2 F基因高變區(qū)序列的測定和遺傳進(jìn)化分析

提取病毒的核酸，用特異性引物擴(kuò)增PLK-N-02株、PLK-N-03株、PLK-N-06株和PLK-N-07株F基因的高變區(qū)序列，獲得大小約500 bp與預(yù)期結(jié)果一致的目的條帶(圖1)。

分析序列測定結(jié)果顯示，4株毒株F蛋白裂解位點(diǎn)均為112R-R-Q-K-R-F117，有多個堿性氨基酸的插入，符合強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)的典型分子特征。用MEGA 6.0軟件，對比分析4株分離株與GenBank收錄的各基因型毒株的F基因高變區(qū)(47 bp～421 bp)核苷酸序列，以此繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明，4株分離株均屬于基因Ⅶd亞型，PLK-N-06株和PLK-N-07株位于同一個分支，與Chicken/Kyrgyzstan/2016/1-16(MK423875)和Chicken/EG-QU/NRC/2015(MF418019)遺傳距離最近，與同屬另一分支的分離株P(guān)LK-N-02和PLK-N-03親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，分離株相互之間的核苷酸同源性為93.3 %～98.4 %，而與La Sota等傳統(tǒng)疫苗株核苷酸同源性僅為78.9 %～82.6 %，說明分離株與傳統(tǒng)疫苗株在分子水平上具有一定差異。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.NDV陽性對照；2.陰性對照；3.PLK-N-02；4.PLK-N-03；5.PLK-N-06；6：PLK-N-07

■.NDV分離株；●.常用疫苗株

2.3 分離株致病指數(shù)的測定

測定PLK-N-02株、PLK-N-03株、PLK-N-06株和PLK-N-07株的MDT、ICPI和IVPI(表2)。按照OIE[15]公布的毒力判定標(biāo)準(zhǔn)，4株分離株的MDT均小于60.0 h 、ICPI大于1.60，IVPI大于2.0，由此可判定分離的NDV均屬速發(fā)型強(qiáng)毒力毒株。PLK-N-06株擁有相比其他3株NDV更小的MDT值和更大的ICPI值與IVPI值。因此，選擇毒力更強(qiáng)的PLK-N-06株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.4 雞胚交叉中和試驗(yàn)結(jié)果

將PLK-N-06株、La Sota株和相應(yīng)的高免血清進(jìn)行雞胚交叉中和試驗(yàn)，計(jì)算中和效價(jià)(表3)。根據(jù)中和效價(jià)得分離株P(guān)LK-N-06與La Sota疫苗株的抗原相關(guān)性R值為0.45，表明PLK-N-06株與La Sota株間存在顯著抗原性差異。

表2 不同毒株致病指數(shù)測定結(jié)果

表3 兩種血清對不同病毒的中和效價(jià)

2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

2.5.1 免疫后抗體水平檢測結(jié)果 將制備的PLK-N-06株和La Sota株油乳劑滅活疫苗免疫接種30日齡SPF雞，免后21 d以基因Ⅶ型PLK-N-06株和基因Ⅱ型La Sota株為抗原檢測血清HI抗體效價(jià)(表4)。結(jié)果表明，PLK-N-06株免疫組使用基因Ⅶ型抗原檢測效價(jià)高于基因Ⅱ型抗原檢測結(jié)果，且PLK-N-06滅活苗免疫組以PLK-N-06抗原檢測的抗體水平明顯高于基因Ⅱ型La Sota株免疫組以La Sota抗原檢測的抗體水平，說明基因Ⅶ型PLK-N-06株的免疫原性更好。

2.5.2 免疫后攻毒保護(hù)效果 PLK-N-06滅活苗和La Sota滅活苗免疫后21 d，連同攻毒對照組雞分別感染PLK-N-06株，攻毒后每天觀察各組試驗(yàn)雞的精神、采食、發(fā)病及死亡情況。對照組5 d內(nèi)5/5死亡，PLK-N-06株滅活苗和La Sota株滅活苗免疫組均未見明顯的臨床癥狀，但攻毒后5 d，采集泄殖腔棉拭子的病毒分離結(jié)果顯示(表5)，La Sota株滅活苗免疫組4/10病毒分離陽性，PLK-N-06滅活苗免疫組0/10病毒分離陽性。

表4 免后21 d各組對應(yīng)試驗(yàn)雞的HI抗體

表5 各免疫組對PLK-N-06株的保護(hù)效果

3 討論

NDV是自然界鳥類群體中常見的病原體，主要侵害雞、鴨和鵝等家禽以及賽鴿、鸚鵡和鴕鳥等特種經(jīng)濟(jì)禽類，已報(bào)道該病毒可感染的禽類品種超過250種[6]。OIE將ND列為必須報(bào)告的動物疫病，而我國也將其列為一類動物疫病[16]。NDV基因組編碼的F蛋白位于病毒囊膜的表面，其必須在一些蛋白水解酶的作用下，從F0惰性前體狀態(tài)裂解成F1和F2片段，才可發(fā)揮介導(dǎo)病毒囊膜和宿主細(xì)胞融合的作用[17]。強(qiáng)毒株F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸為112R/K-R-Q-R/K-R-F117，因?yàn)榘鄠€R/K堿性氨基酸，可被宿主全身細(xì)胞的蛋白酶識別，而弱毒株的F蛋白裂解位點(diǎn)有兩處堿性氨基酸被替換為中性氨基酸，變成112E-R-Q-G/E-R-L117，導(dǎo)致其F蛋白只能在呼吸道和消化道的細(xì)胞中被裂解，引起局部感染[18-19]。分離的4株NDV 測定F基因高變區(qū)序列，推斷其裂解位點(diǎn)氨基酸序列均為112R-R-Q-K-R-F117，與ND強(qiáng)毒株的分子特征一致，顯示4株分離株可能為強(qiáng)毒株。

因?yàn)椴煌琋DV之間毒力差異顯著，所以O(shè)IE嚴(yán)格規(guī)定，只有NDV的ICPI≥0.7，且F蛋白擁有強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)特征，才判定發(fā)生ND疫情[15]。根據(jù)致病性的不同，NDV分為速發(fā)型(強(qiáng)毒株)、中發(fā)型(中等毒力毒株)和緩發(fā)型(弱毒株)，分類依據(jù)為MDT、ICPI和IVPI 3個毒力指標(biāo)[20]。經(jīng)測定4株分離株MDT≤51 h，ICPI≥1.61，IVPI≥2.55，均符合新城疫強(qiáng)毒株的標(biāo)準(zhǔn)，該結(jié)果與F蛋白裂解位點(diǎn)特征相符合。PLK-N-06株的MDT=42 h， ICPI=1.70，IVPI=2.69，毒力強(qiáng)于另外3株分離株，更具有免疫原性研究和疫苗研發(fā)的潛在價(jià)值。

雖然NDV只有一個血清型，但卻在抗原性、基因組結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化等方面存在差異。在遺傳性上，NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ，ClassⅡ又劃分為多個基因型，世界范圍內(nèi)廣泛流行的NDV為基因Ⅴ型和Ⅶ型[21]。對分離株F基因高變區(qū)的遺傳進(jìn)化分析顯示4株分離株屬于Ⅶd亞型，與國內(nèi)近年的研究報(bào)道一致，屬于目前流行的優(yōu)勢基因型[22]。雞胚交叉中和試驗(yàn)表明PLK-N-06株與La Sota疫苗株抗原相關(guān)性R值<0.5，說明兩者之間存在顯著的抗原性差異，這一結(jié)論與秦卓明[23]的研究結(jié)果相符合。

報(bào)道顯示La Sota疫苗株對基因Ⅶ型毒株有一定的保護(hù)作用[11,24]。趙明等[11]分離鑒定一株Ⅶ b亞型NDV，用此毒株感染免疫La Sota株滅活疫苗的雞，不出現(xiàn)臨床癥狀但可檢測到排毒。Mahmoud N K[24]研究基因Ⅱ型La Sota株滅活疫苗對基因Ⅶ型毒株保護(hù)效果時(shí)也觀察到相同的現(xiàn)象。本研究攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，La Sota株疫苗免疫后，在HI抗體效價(jià)幾何平均值為6.1 log2的情況下，感染PLK-N-06分離株，雖不表現(xiàn)臨床癥狀，卻在攻毒后5 d出現(xiàn)4/10排毒，說明不同基因型毒株之間交叉保護(hù)作用有限。目前我國使用最多的疫苗基因型為Ⅱ型，其在遺傳進(jìn)化和抗原性上與現(xiàn)在流行的基因Ⅶ型毒株存在顯著的差異，導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗在對抗流行毒株感染時(shí)，雖能保護(hù)雞只不出現(xiàn)臨床癥狀，但不能有效避免感染及排毒[25]。開發(fā)與流行毒株基因型匹配的新型疫苗對防控ND具有重要的意義，而PLK-N-06株的分離為上述疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。