副豬嗜血桿菌血清4型和13型的分子血清分型研究

李 忍，郭芳芳，郭 杰，崔一芳，曹曉亞，徐福洲

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)引起豬格拉澤氏病(Gl?sser＇s disease)，感染后主要表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前HPS有15個(gè)血清型，不同血清型菌株之間存在高毒力、中等毒力和無(wú)毒力等顯著差異，因而鑒定HPS血清型對(duì)該病的診斷和防治具有重要意義[3]。HPS血清4型、5型和13型是我國(guó)目前流行最多、分布范圍最廣且毒力較強(qiáng)的血清型[4-7]，因而快速準(zhǔn)確鑒定HPS優(yōu)勢(shì)流行血清型對(duì)該病原的流行病學(xué)調(diào)查和防控具有重要意義。

目前HPS常規(guī)血清型鑒定方法為在細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(GID)或間接血凝試驗(yàn)(IHA)與HPS所有單一血清型的陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)來(lái)判定血清型，通常需要3 d～5 d，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且約有30%的HPS分離菌株不能被準(zhǔn)確鑒定血清型[3,8-9]，嚴(yán)重影響該病的臨床診斷。為提高血清分型效率和準(zhǔn)確性，近年來(lái)分子血清分型方法越來(lái)越多地應(yīng)用于HPS血清分型，通過(guò)對(duì)HPS所有15個(gè)血清型莢膜多糖合成編碼基因座進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和血清型特異性基因鑒定[10]，建立和應(yīng)用了更加準(zhǔn)確高效的多重PCR分子血清分型方法[11-13]，大大降低了不能分型的HPS臨床分離株數(shù)量。

為提高臨床上HPS的快速鑒定，近年來(lái)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)用于檢測(cè)HPS菌株[14-15]，但尚未見LAMP用于HPS血清分型的報(bào)道，因而利用LAMP技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異且易于臨床應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，建立HPS流行優(yōu)勢(shì)血清型的血清分型方法，對(duì)HPS流行病學(xué)調(diào)查和疫苗防控具有重要意義。

在本試驗(yàn)中，參照HPS血清4型和13型特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，分別建立了簡(jiǎn)便快速鑒定HPS血清4型和13型的LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)方法的敏感性和特異性進(jìn)行鑒定，最后利用已知血清型的HPS臨床分離株對(duì)建立的LAMP方法進(jìn)行驗(yàn)證，研究結(jié)果將有助于臨床上HPS血清4型和13型分離株的快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌菌株 HPS所有15個(gè)血清型參考菌株由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Pat Blackall博士惠贈(zèng)；HPS臨床分離菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)蔡旭旺博士惠贈(zèng)；特異性檢測(cè)中使用的其他菌株或DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 胰酶大豆肉湯(TSB)、胰酶大豆瓊脂(TSA)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，BD Difco公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；BstDNA polymerase，NEB公司產(chǎn)品。PCR儀(5331)，Eppendorf公司產(chǎn)品；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)，ThermoFisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 凍存菌株劃線接種于TSA平板上，挑取單菌落接種TSB中，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL培養(yǎng)物用于抽提基因組DNA，提取方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，利用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度。

1.2.2 LAMP引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中HPS血清4型脂多糖合成蛋白基因wcip4序列(KC795356.1)和血清13型糖脂轉(zhuǎn)移蛋白基因gltP序列(KC795500.1)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計(jì)LAMP引物。引物名稱及序列如表1所示。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系 在25 μL反應(yīng)體系中，含有10×BstDNA polymerase buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 3.0 μL，0.25 mol/L MgSO40.2 μL，5 mol/L Betaine 0.5 μL，10 μmol/L FIP和BIP各2.0 μL，10 μmol/L F3和B3各0.5 μL，8 U/μLBstDNA polymerase 0.7 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。所有組分混合后95 ℃ 5 min，然后62 ℃ 60 min，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 LAMP所用引物

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化 對(duì)LAMP反應(yīng)體系中主要影響因子如dNTPs濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mmol/L)、BstDNA polymerase用量(0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 μL)、Mg2+濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mmol/L)、Betaine濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mol/L)、反應(yīng)溫度(60、61、62、63、64、65 ℃)、反應(yīng)時(shí)間(30、35、40、45、50、55、60、65 min)等分別篩選優(yōu)化，確定較好的LAMP反應(yīng)體系。

1.2.5 特異性鑒定 HPS所有15個(gè)血清型的17株參考菌株基因組DNA作為模板用于評(píng)價(jià)LAMP方法血清型特異性；同時(shí)利用其他14個(gè)不同種屬的19株細(xì)菌(胸膜肺炎放線桿菌5個(gè)血清型菌株、多殺性巴氏桿菌、豚放線桿菌、小放線桿菌、波氏桿菌、支原體、溶血性曼氏桿菌、豬丹毒桿菌、銅綠假單胞菌、豬霍亂沙門氏菌、獸疫鏈球菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌)基因組DNA作為模板評(píng)價(jià)LAMP方法對(duì)其他種屬細(xì)菌特異性。取每種細(xì)菌基因組DNA 100 ng作為模板進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 敏感性鑒定 分別利用HPS血清4型和13型參考菌株基因組DNA評(píng)價(jià)方法的敏感性，反應(yīng)體系中基因組DNA添加量分別為100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、5 pg、2.5 pg、1 pg、0.5 pg、100 fg、10 fg、1 fg。

1.2.7 HPS臨床分離株的檢測(cè) 取22株HPS臨床分離株，經(jīng)GID和IHA鑒定包括14株血清4型、1株血清5型、1株血清11型、1株血清12型、5株血清13型，過(guò)夜培養(yǎng)后取菌液1 mL，離心后取菌沉淀重懸于50 μL ddH2O中，煮沸5 min后離心取上清液1.0 μL作為模板，進(jìn)行LAMP檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

LAMP反應(yīng)體系中主要影響因子篩選結(jié)果顯示，dNTPs濃度在0.8 mmol/L～2.8 mmol/L時(shí)反應(yīng)呈陽(yáng)性，其中2.4 mmol/L～2.8 mmol/L反應(yīng)最佳；BstDNA polymerase加入量在0.5 μL～1.5 μL時(shí)反應(yīng)呈陽(yáng)性，其中0.7 μL～1.3 μL反應(yīng)最佳；Mg2+濃度為0～4.0 mmol/L時(shí)均呈陽(yáng)性，其中1.5 mmol/L～3.0 mmol/L反應(yīng)最佳；Betaine濃度為0.1 mol/L～0.8 mol/L 時(shí)均呈陽(yáng)性，其中0.4 mol/L～0.8 mol/L反應(yīng)最佳；反應(yīng)溫度61.0 ℃～65.0 ℃均呈陽(yáng)性，其中62 ℃反應(yīng)最佳；反應(yīng)時(shí)間35 min～65 min范圍內(nèi)均呈陽(yáng)性，其中60 min～65 min反應(yīng)最佳。

2.2 LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果

HPS血清型特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)的典型階梯狀陽(yáng)性條帶可見于血清4型參考菌株(圖1A)和血清13型參考菌株(圖1B)，而其他血清型無(wú)陽(yáng)性條帶出現(xiàn)；細(xì)菌種特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，代表14種不同種屬細(xì)菌的19個(gè)菌株反應(yīng)結(jié)果均呈陰性(圖略)。結(jié)果表明,建立的HPS血清4型和13型LAMP檢測(cè)方法具有較好的特異性。

A.血清4型；B.血清13型；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;N,ddH2O;1.血清 1-Ⅰ;2.Serovar 1-Ⅱ;3.血清2;4.血清3;5.Serovar 4;6.血清5;7.血清6;8.血清7-Ⅰ;9.血清7-Ⅱ;10.血清8;11.血清9;12.血清10;13.血清11;14.血清12;15.血清13;16.血清14;17.血清15

2.3 LAMP敏感性檢測(cè)結(jié)果

敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示，在25 μL反應(yīng)體系中，HPS血清4型和13型的基因組DNA最小檢測(cè)量分別為1 pg(圖2A)和2.5 pg(圖2B)。

2.4 HPS臨床分離株血清分型結(jié)果

對(duì)22株HPS臨床分離株檢測(cè)結(jié)果顯示，在HPS血清4型檢測(cè)體系中14株HPS血清4型分離株檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,而其他血清型菌株為陰性(圖3A)；在HPS血清13型檢測(cè)體系中5株HPS血清13型分離株檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而其他血清型菌株為陰性(圖3B)。結(jié)果提示建立的LAMP檢測(cè)方法可用于臨床HPS分離株血清4型和13型的鑒定。

A.血清4型； B.血清13型；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;N.ddH2O;1.1 fg;2.10 fg;3.100 fg;4.0.5 pg;5.1 pg;6.2.5 pg;7.5 pg;8.10 pg;9.100 pg;10.1 ng;11.10 ng;12.100 ng

3 討論

由于HPS培養(yǎng)條件相對(duì)要求較高，體外分離培養(yǎng)經(jīng)常失敗，而且非致病性血清型菌株在豬上呼吸道等部位的定植，給臨床疫病診斷和防控帶來(lái)困難[16]。為快速鑒定HPS流行血清型，分子血清分型方法如多重PCR雖有優(yōu)勢(shì)[11-12]，但多重PCR由于不易判定，難以在臨床中簡(jiǎn)便快速的應(yīng)用。本試驗(yàn)建立的鑒定HPS血清4型和13型LAMP方法，具有簡(jiǎn)單、快速、易于臨床應(yīng)用等特點(diǎn)，對(duì)臨床上HPS優(yōu)勢(shì)流行血清型的流行病學(xué)調(diào)查和疫苗應(yīng)用提供一種替代方法。為進(jìn)一步優(yōu)化該方法，便于現(xiàn)場(chǎng)使用，我們擬優(yōu)化該檢測(cè)方法，如使用臨床采集樣品直接進(jìn)行反應(yīng)鑒定、使用顯色方法替代電泳判定方法等。

雖然HPS目前已鑒定出15個(gè)血清型，但國(guó)內(nèi)外研究均顯示，HPS血清4型、5型和13型是世界范圍內(nèi)目前流行最多、分布范圍最廣且為毒力較強(qiáng)的血清型[1,5-7]，因而檢測(cè)這些優(yōu)勢(shì)血清型將提高臨床上HPS診斷和防控效率。本試驗(yàn)建立了檢測(cè)血清4型和13型的LAMP方法，但對(duì)于血清5型，我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]選擇了wcwK和funK基因分別設(shè)計(jì)LAMP引物進(jìn)行檢測(cè)，雖然設(shè)計(jì)了多組引物，但始終無(wú)法將血清5型與其他血清型完全區(qū)分，特別是血清5型與12型的交叉反應(yīng)。Howell K J等[11]報(bào)道的多重PCR同樣無(wú)法區(qū)分這兩種血清型。Jia A等[12]將多重PCR方法進(jìn)行了改進(jìn)，分別選用funK基因和一個(gè)假定基因(hypothetical gene)用于檢測(cè)血清5型和12型，本試驗(yàn)改用funK基因設(shè)計(jì)引物也沒(méi)有取得特異性檢測(cè)結(jié)果，針對(duì)血清5型的檢測(cè)需要更多的基因組序列分析。

在設(shè)計(jì)LAMP引物進(jìn)行HPS單一血清型鑒定時(shí)，血清型特異性基因的選擇至關(guān)重要。最初的KRG血清分型方案基于表面抗原之間的差異，將HPS分為15個(gè)血清型[3]，表明15個(gè)血清型中存在表面抗原編碼基因序列的差異，在對(duì)HPS莢膜多糖合成編碼基因座進(jìn)行多樣性和血清型差異性比對(duì)后，獲得了不同血清型的特異性基因序列[10]。本試驗(yàn)選用wcip4基因和gltP基因分別進(jìn)行HPS血清4型和13型特異性引物設(shè)計(jì)，雖然Blast結(jié)果顯示所選的基因具有較好的血清型特異性，但我們?cè)O(shè)計(jì)的多組引物進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果顯示，多數(shù)引物組對(duì)不同血清型出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，通過(guò)大量篩選后選擇目前試驗(yàn)中的這組引物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)并取得較好的結(jié)果。

A:血清4型；B:血清13型；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;N.ddH2O;1-14.血清4型分離株;15.血清5型分離株;16.血清11型分離株;17.血清12型分離株;18-22.血清13型分離株

LAMP檢測(cè)方法雖然具有簡(jiǎn)便、快速、易于臨床應(yīng)用的顯著優(yōu)點(diǎn)，但由于其容易出現(xiàn)氣溶膠污染導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，給該方法的推廣應(yīng)用帶來(lái)極大限制。近年來(lái)報(bào)道了一些同時(shí)多通道的檢測(cè)方法如微流控蝶式芯片[17]和一步實(shí)時(shí)PCR[18]等，這些方法即可避免LAMP檢測(cè)中的污染問(wèn)題，且可同時(shí)檢測(cè)多種病原種屬，極大地提高了檢測(cè)效率，有助于臨床上多重感染的鑒別診斷。目前我們正在研制檢測(cè)HPS不種血清型的微流控蝶式芯片檢測(cè)方法，對(duì)HPS感染的分子血清分型和疫苗防控將具有重要意義。