中藥提取物對(duì)IBDV感染SPF雞的防治效果

朱買(mǎi)勛，唐紅梅，閆志強(qiáng)，陳春林，翟少欽

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

病毒的高度變異和抗病毒藥物的缺乏，增加了畜禽病毒性疫病的防控難度，尋求具有選擇性殺滅病毒而不損傷畜禽機(jī)體細(xì)胞的藥物是有效防控畜禽疫病的主要手段。中藥是中國(guó)流傳數(shù)千年的瑰寶，基于長(zhǎng)期的臨床經(jīng)驗(yàn)來(lái)篩選和研究有效抗病毒的藥物，實(shí)現(xiàn)“老藥”新用是現(xiàn)代挖掘抗病毒方法的有效途徑，有助于抗病毒類(lèi)新獸藥的研發(fā)。雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種免疫抑制病，該病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，并且可以通過(guò)垂直傳播和水平傳播的方式進(jìn)行擴(kuò)散[1-2]。IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙 RNA 病毒屬，基因組包括兩條雙鏈RNA，編碼的氨基酸區(qū)段存在高變區(qū)(Hypervariable region，HVR)，已經(jīng)從原來(lái)的經(jīng)典毒株漸漸變異成IBDV超強(qiáng)毒株(Very virulent IBDV,vvIBDV)，僅2018年，中國(guó)黑龍江、遼寧、河北、山東、江蘇、浙江、云南7個(gè)省檢測(cè)到 IBDV 新型變異株的流行，并在不斷蔓延[3]。美國(guó)紐約也分離出包含vvIBDV的新型毒株，且感染4周齡SPF雞，能在4 d內(nèi)達(dá)到100%發(fā)病和68.7%死亡[4-5]，發(fā)病雞法氏囊壞死并免疫抑制，免疫系統(tǒng)被嚴(yán)重?fù)p害，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[6-7]。2020年，OIE將vvIBDV造成的疫病列為117種烈性傳染病之一[8]。

對(duì)IBD的防控，現(xiàn)在主要以接種疫苗進(jìn)行預(yù)防為主，但由于病毒表面蛋白存在連續(xù)突變風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致免疫失敗，產(chǎn)生免疫盲區(qū)。藥物預(yù)防也是防治IBD的主要手段，尤其是中獸藥，富含大量的營(yíng)養(yǎng)成分和天然活性物質(zhì)，在增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和抗病毒方面均有其獨(dú)特效果。能干擾IBDV的復(fù)制和阻滯其穿入宿主細(xì)胞[9]，提高外周血和脾淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率，改變CD4+/CD8+比值，促進(jìn)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控[10]，提高抗體效價(jià)，有效保護(hù)雛雞法氏囊、胸腺和脾臟等免疫器官，減輕病毒對(duì)其的損傷程度[11]，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)防治IBDV的效果。本研究在中藥復(fù)方提取物可以增強(qiáng)免疫抑制雛雞的免疫功能和提高IBD疫苗免疫效果的基礎(chǔ)上[12-13]，采用IBDV人工感染SPF雞，旨在進(jìn)一步明確中藥復(fù)方提取物防治IBDV的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中藥提取物(Traditional Chinese medicine extract，簡(jiǎn)稱(chēng)TCME)，按2∶2∶1∶1的質(zhì)量比稱(chēng)取女貞子(LigustriLucidiFructus)、黃芪(AstragaliRadix)、枸杞子(LyciiFructus)、菟絲子(CuscutaeSemen)，經(jīng)過(guò)水提取、過(guò)濾，制備成浸膏，添加可溶性淀粉制成規(guī)格為每1.0 g提取物中含1.0 g的原生藥。

雞傳染性法氏囊病毒(CVCC編號(hào)：AV7)購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保存中心，由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所擴(kuò)增保存。

SPF雞胚和SPF雛雞均購(gòu)于濟(jì)南斯派瑞福禽業(yè)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒EID50的測(cè)定 利用雞胚測(cè)定病毒滴度， 10倍稀釋法用PBS將IBDV種毒稀釋10個(gè)梯度，每個(gè)梯度病毒稀釋液分別接種9～11日齡SPF雞胚的尿囊腔，每個(gè)梯度接種7胚，接種量為每胚100 μL，另選7胚接種等量的PBS作為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)，接種后每天照蛋觀察雞胚發(fā)育情況，記錄死胚數(shù)量，并采集雞胚尿囊液進(jìn)行ELISA檢測(cè)(購(gòu)于武漢Abebio公司)，接種后第7天，存活的胚胎處死后，檢測(cè)判定雞胚是否為陽(yáng)性。參照Reed-Muench法[14]計(jì)算病毒EID50。EID50=10-[A+(B-50)/(B-C)]

式中：A為高于50%的病毒稀釋度；B為高于50%的百分?jǐn)?shù)，C為低于50%的百分?jǐn)?shù)。

1.2.2 動(dòng)物分組及管理 分組及飼養(yǎng)管理：150羽3周齡的SPF雛雞，預(yù)飼1周后，隨機(jī)分為5個(gè)組，分別為對(duì)照組、模型組和中藥提取物高、中、低劑量組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10羽雛雞。各組雛雞采用單籠立式隔離飼養(yǎng)，自由飲水，飼喂相同的飼料。

給藥：中藥提取物高、中、低劑量組分別在飲水中添加10.0、5.0、2.5 g/L的中藥提取物，連續(xù)添加7 d，對(duì)照組和模型組不添加任何藥物。

攻毒：給藥完成后，試驗(yàn)組雛雞分別通過(guò)滴鼻接種含100 EID50/100 μL的IBDV，對(duì)照組滴鼻等量的生理鹽水。攻毒后，連續(xù)2周觀察雛雞的生存狀態(tài)。

1.2.3 雛雞的生存分析 在整個(gè)試驗(yàn)期間，觀察雛雞的臨床變化，稱(chēng)量體質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)雛雞每天的死亡情況，計(jì)算每組雛雞的成活率(S)。

S=(N-D)/N×100%

N為試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)；D為死亡動(dòng)物數(shù)。

1.2.4 樣品的采集與處理 攻毒后2周，空腹 8 h稱(chēng)量雛雞體質(zhì)量，之后脫臼處死雛雞，無(wú)菌解剖，采集完整的胸腺、脾臟和法氏囊，稱(chēng)量質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)，稱(chēng)量之后剪碎，迅速放入液氮中保存，同時(shí)多點(diǎn)采集心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉(胸部和腿部)等組織，剪碎后迅速放入液氮保存，用于提取組織中病毒RNA。

I=Iw/Aw

I為免疫器官指數(shù)；Iw為免疫器官質(zhì)量(mg)；Aw為試驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量(g)。

1.2.5 臟器中病毒載量檢測(cè) 根據(jù)GenBank中IBDV毒株全基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增IBDVVP2基因的引物，上游引物：5′-TCCTTCTACAACGCTATCA-3′，下游引物：5′-TACCTCGTACCCCTTGTC-3′，內(nèi)參基因β-actin上游引物：5′-GCCAACAGAGAGAAGATGACAC-3′，下游引物：5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各組雛雞的肝臟、肺臟、胸腺、脾臟、法氏囊、腎臟、肌肉(胸部和腿部)等組織采用液氮冷凍研磨，提取RNA，通過(guò)核酸蛋白定量檢測(cè)儀測(cè)定提取的病毒RNA的質(zhì)量濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對(duì)VP2和內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，VP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等不同質(zhì)量濃度的模板，添加SYBR Primix ExTaqMix(2×) 10 μL，上下游引物各0.5 μL，不同質(zhì)量濃度PCR產(chǎn)物模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 30個(gè)循環(huán)；75 ℃延伸10 min，每個(gè)循環(huán)后進(jìn)行讀板，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成熔解曲線(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后，樣品均采用10 μL體系進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0中GLM模塊進(jìn)行方差分析；組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。熒光定量PCR試驗(yàn)中，為降低RNA定量、反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)效率的差異對(duì)結(jié)果的影響，VP2基因表達(dá)強(qiáng)度分別以絕對(duì)拷貝數(shù)/β-actin絕對(duì)拷貝數(shù)表示。將模型組的表達(dá)量設(shè)置為100倍，計(jì)算其他組雛雞各免疫器官中相應(yīng)基因相對(duì)于模型組的表達(dá)變化。數(shù)據(jù)以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒EID50測(cè)定結(jié)果

由表1可知，按照Reed-Muench法計(jì)算得出IBDV病毒液EID50為1×10-6.91/100 μL。

表1 病毒EID50的測(cè)定結(jié)果Table 1 The measurement results of viral EID50

2.2 雛雞成活率

由表2可知，對(duì)照組雛雞未出現(xiàn)死亡，成活率為100%。攻毒后第3天，除中劑量組外，其他組雛雞開(kāi)始出現(xiàn)死亡，攻毒后第4天～第7天為死亡高峰期，之后維持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)束后，模型組雛雞成活率低至30.00%，高劑量組為 86.67%，中劑量組為93.33%，低劑量組為 70.00%，說(shuō)明中藥提取物能提高雛雞的成活率。

表2 成活雛雞統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=30)Table 2 Statistical results of survival chicks(n=30)

2.3 免疫器官指數(shù)變化

由表3可知，雛雞在接種IBDV后，模型組雛雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而使用中藥提取物進(jìn)行預(yù)防的雛雞脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)明顯降低，高劑量組雛雞脾臟指數(shù)顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)，法氏囊指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。中劑量組胸腺指數(shù)顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)，法氏囊指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。

表3 雛雞免疫器官指數(shù)Table 3 The results of chicks’ immune organ index

2.4 病毒在組織中分布結(jié)果

由表4可知，雛雞在接種IBDV后，IBDV能在肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊、胸腺的組織中分布，對(duì)使用中藥提取物預(yù)防后的雛雞進(jìn)行組織中病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示高劑量組雛雞的腎臟、肺臟、肌肉組織中病毒核酸均為陰性，脾臟組織部分為陰性，肝臟、法氏囊、胸腺組織均為陽(yáng)性。中劑量組和高劑量組雛雞的腎臟、肺臟、肌肉組織均為陰性，脾臟和法氏囊組織部分為陰性，肝臟和胸腺組織為陽(yáng)性。低劑量組只有肺臟和肌肉組織為陰性，腎臟組織部分為陰性，法氏囊、脾臟、肝臟、胸腺組織均為陽(yáng)性。

表4 雛雞組織中病毒核酸檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of viral nucleic acid in chick tissues

2.5 免疫器官中IBDV的載量分析

由圖1～3可知，對(duì)照組雛雞的脾臟、胸腺和法氏囊中均未檢測(cè)到IBDV，表明雛雞未感染病毒。以模型組為基準(zhǔn)，高劑量、中劑量和低劑量組的雛雞脾臟組織中IBDV載量分別降至模型組的(0.26±0.08)、(0.20±0.06)、(0.86±0.16)倍，高劑量組和中劑量組極顯著低于模型組和低劑量組(P<0.01)；胸腺組織中IBDV載量分別降至(0.46±0.07)、(0.34±0.08)、(0.78±0.09)倍，高劑量組和中劑量組極顯著低于模型組和低劑量組(P<0.01)，低劑量組顯著低于模型組(P< 0.05)；法氏囊組織中IBDV載量分別降至 (0.59±0.11)、(0.44±0.05)、(0.80±0.10)倍，高劑量組和中劑量組極顯著低于模型組 (P<0.01)，且顯著低于低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著低于模型組(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

傳染性法氏囊病常發(fā)生于3～12周齡的雛雞或青年雞，IBDV入侵后主要在免疫器官內(nèi)大量繁殖，破壞免疫器官并導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，降低雛雞的抗病能力和對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答能力，甚至引起死亡[1]。本研究中，中藥提取物高、中、低劑量組雛雞成活率分別達(dá)到86.67%、93.33%和 70.00%，高劑量組雛雞脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)，中劑量組胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著低于模型組 (P<0.05)，說(shuō)明中藥提取物能有效緩解由于IBDV感染引起的免疫器官炎癥，改善雛雞免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，降低雛雞的死亡率。本研究中，中藥提取物由女貞子、黃芪、枸杞子、菟絲子等中藥組方后提取制備而成，含有大量的黃芪多糖、枸杞多糖、女貞子多糖等生物活性物質(zhì)，其作用機(jī)制可能是這些生物多糖具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、營(yíng)養(yǎng)免疫器官的功效，從而改善了IBDV感染引起的損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，達(dá)到提高雛雞成活率的效果。

IBDV在雛雞體內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖與機(jī)體的抵抗能力存在一定的對(duì)抗關(guān)系。IBDV入侵雛雞后，在肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊、胸腺等組織中廣泛分布并繁殖，造成組織損傷和功能抑制。本研究采用中藥提取物防治的雛雞，IBDV在組織中的生長(zhǎng)繁殖發(fā)生改變，高劑量組雛雞的腎臟組織全部轉(zhuǎn)為陰性，脾臟組織部分轉(zhuǎn)為陰性，中劑量組雛雞的腎臟組織全部轉(zhuǎn)為陰性，脾臟和法氏囊組織部分轉(zhuǎn)為陰性。分析IBDV在脾臟、胸腺和法氏囊組織中的載量，中藥提取物高劑量組和中劑量組雛雞的脾臟、胸腺、法氏囊中載毒量極顯著低于模型組(P<0.01)，脾臟、胸腺組織中病毒載量極顯著低于低劑量組(P<0.01)，法氏囊組織中病毒載量顯著低于低劑量組(P<0.05)，提示中藥提取物可以促進(jìn)機(jī)體清除IBDV。在雛雞清除病毒的過(guò)程中，中藥提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體分泌大量的細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)和抗病毒作用，中藥提取物中含有大量的多糖，黃芪多糖可以促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6等多種細(xì)胞因子[15]，枸杞多糖可以提高雛雞的免疫力，增強(qiáng)IL-2、IL-6基因mRNA的表達(dá)[16]。這些細(xì)胞因子主要由Th1和Th2分泌，在抗病毒過(guò)程中積極調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力[7]。但是部分雛雞的免疫器官中IBDV仍然為陽(yáng)性，尤其是低劑量組，由此可以推斷該中藥提取物對(duì)病毒的清除與藥物使用劑量存在一定的關(guān)系，較低劑量的中藥提取物對(duì)IBDV感染雛雞的防治效果不佳，臨床中防治IBDV時(shí)要制定雞場(chǎng)的科學(xué)用藥程序，有助于提高IBD的防治效果。