致病疫霉菌RXLR效應(yīng)蛋白AVR1-like寄主靶標(biāo)的酵母雙雜交篩選

張曉將,成 靜,單衛(wèi)星,杜 羽

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)長期遭到卵菌病原物致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病的侵?jǐn)_，晚疫病會危害馬鈴薯的葉片、葉柄、莖和塊莖，嚴(yán)重威脅全球馬鈴薯生產(chǎn)安全[1]。卵菌是一類形態(tài)上類似真菌的真核微生物，在生化代謝、細(xì)胞壁組成以及繁殖方式等方面與真菌存在差異[2]。卵菌包括許多重要的植物病原菌，可侵染自然界的許多植物，引起多種毀滅性病害，如大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)引起的大豆根腐病[3]、橡樹疫霉菌(Phytophthoraramorum)引起的橡樹猝死病[4]等，嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全。

致病疫霉菌通過分泌大量的效應(yīng)蛋白干擾植物免疫反應(yīng)，促進(jìn)病菌對植物的侵染。其中 RXLR類效應(yīng)蛋白在致病疫霉菌侵染植物過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)病菌侵染作用[5]。RXLR效應(yīng)蛋白N 端含有一個信號肽和一段保守的RXLR基序(R：精氨酸；X：任意氨基酸；L：亮氨酸)，負(fù)責(zé)效應(yīng)子的分泌和轉(zhuǎn)運進(jìn)入植物細(xì)胞；C端則是效應(yīng)蛋白的功能域，決定效應(yīng)蛋白的功能。

在植物-病原物長期的互作過程中，植物形成了一套有效的免疫體系來抵擋病原菌的入侵，同時病原菌通過進(jìn)化和改變其效應(yīng)蛋白組成，可以攻克植物的免疫體系以建立疾病。Jones和Dangl[6]提出的“zigzag”模型對植物-病原物的互作進(jìn)行了總結(jié)。在馬鈴薯與致病疫霉菌復(fù)雜的防御和侵染互作過程中，RXLR效應(yīng)蛋白起著非常關(guān)鍵的作用，這些效應(yīng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞并與寄主靶標(biāo)結(jié)合，達(dá)到調(diào)節(jié)寄主免疫反應(yīng)的目的，有些寄主靶標(biāo)蛋白對植物抗性起正調(diào)控作用，在植物中增強此類蛋白的表達(dá)會提高抗性，如Sec5[7]、C14[8]等；有些靶標(biāo)蛋白對植物抗性起負(fù)調(diào)控作用，這些蛋白在植物中增強表達(dá)會導(dǎo)致植物抗性降低，如PP1c[9]、StNRL1[10]等。

利用酵母雙雜交技術(shù)篩選病菌效應(yīng)蛋白寄主靶標(biāo)，揭示病菌侵染機制的研究較多。Du等[7]通過酵母雙雜篩選到致病疫霉菌效應(yīng)蛋白AVR1的寄主靶標(biāo)Sec5，發(fā)現(xiàn)AVR1與Sec5互作可以抑制INF1引發(fā)的壞死，推測AVR1可能通過靶向Sec5干擾植物細(xì)胞囊泡運輸來調(diào)控植物免疫；Bos等[11]同樣采用酵母雙雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白AVR3a通過穩(wěn)定其植物靶標(biāo)E3連接酶CMPG1來操縱植物免疫；陳姍姍等[12]通過酵母雙雜交篩選到辣椒疫霉效應(yīng)蛋白RXLR19781的寄主靶標(biāo)E2泛素連接酶，并驗證兩者之間的互作；Naveed等[13]通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到致病疫霉菌RXLR效應(yīng)蛋白Avrblb2的寄主靶標(biāo)CaM，研究發(fā)現(xiàn)Avrblb2通過與CaM相互作用來干擾植物中與Ca2+相關(guān)的防御機制。

致病疫霉菌RXLR效應(yīng)蛋白AVR1-like(AL)與AVR1高度同源，但AL不靶向AVR1的毒性靶標(biāo)Sec5，也不抑制INF1引發(fā)的壞死，推測其毒性機理與AVR1不同[7]。為了揭示AL毒性作用機理，本研究運用酵母雙雜交技術(shù)，對馬鈴薯晚疫病菌RXLR效應(yīng)蛋白AL寄主靶標(biāo)進(jìn)行篩選和鑒定，為揭示效應(yīng)蛋白AL的毒性機理提供基礎(chǔ)，對進(jìn)一步解析卵菌與寄主植物的互作機制有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

SD-Leu-Trp-Ade-His、X-α-gal、鮭魚精DNA均購自TaKaRa試劑公司，2×YPDA、SD-Trp、SD-Leu、SD-Trp-Leu、SD-His-Leu-Trp均由蔬菜生物技術(shù)與種質(zhì)資源創(chuàng)新實驗室配制；pGADT7載體、pGBKT7載體、AH109菌株、Y187菌株、酵母文庫、DH5α菌株購自Clontech公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN公司，高保真DNA聚合酶Fast pfu DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase等購自TaKaRa 公司。

1.2 方 法

1.2.1 誘餌載體構(gòu)建 根據(jù)AL DNA序列設(shè)計1對含有EcoRI和BamHI酶切位點的特異引物(表1)，以致病疫霉菌菌株88069 DNA為模板，通過高保真DNA聚合酶PCR擴(kuò)增得到AL誘餌片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收純化，并與pGBKT7(BD)載體同時采用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切，采用T4 DNA Ligase將酶切過的PCR產(chǎn)物與載體進(jìn)行連接，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR檢測陽性克隆(引物序列見表1)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗證。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.2 誘餌載體自激活驗證 根據(jù)酵母手冊(clontech)的方法，將誘餌載體AL-pGBKT7與空載質(zhì)粒pGADT7共轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中，涂布在SD-Trp-Leu選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d。挑取菌落到SD-His-Leu-Trp加X-α-gal及SD-Leu-Trp-Ade-His加X-α-gal的平板上進(jìn)行互作驗證，2～3 d后觀察酵母生長情況。

1.2.3 酵母雙雜交 按照“1.2.2”的方法將誘餌載體轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中，根據(jù)酵母手冊(clontech)的方法進(jìn)行酵母雜交，將重懸液均勻涂布在SD-His-Leu-Trp的培養(yǎng)基上28 ℃ 5～6 d；之后將酵母菌落在加有X-α-gal的SD-His-Leu-Trp平板上劃線培養(yǎng)，篩選陽性克隆。利用pGADT7載體測序引物將陽性克隆進(jìn)行酵母菌落PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，對目的條帶進(jìn)行測序，測序結(jié)果均通過National Center for Biotechnology Information(NCBI)比對進(jìn)行分析。

1.2.4 酵母菌落PCR 在1.5 mL離心管中加10 μL ddH2O，將生長良好的陽性克隆挑至離心管中，封口膜密封，對酵母菌液進(jìn)行6次反復(fù)凍融(液氮中15 s，水浴鍋65 ℃ 1 min)，之后12 000 g離心10 s，用2 μL的模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物在10 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測目的條帶，對陽性結(jié)果的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。

1.2.5 酵母質(zhì)粒提取 將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)至2 mL離心管中，13 000 r/min 2 min；棄上清，用120 μL ddH2O重懸菌體，加入500 μmol/L的玻璃珠約120 mg，劇烈震蕩2 min(每震蕩30 s冰浴1 min)；14 000 r/min 2 min，上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管；加入40 μL Tris-飽和酚，充分震蕩混勻，室溫靜置10 min，加40 μL氯仿，充分震蕩混勻，冰上靜置10 min，12 000 r/min 10 min；上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管，加入1/2上清液體的7.5 mol/L的醋酸銨，加入1倍上清液體積的異丙醇混勻，-20 ℃放置2 h；12 000 r/min 15 min，棄上清，加入1 mL 80%的乙醇處理2 min，12 000 r/min 5 min；棄上清，超凈臺風(fēng)干2 min，加20 μL ddH2O，測濃度，保存在-20 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體構(gòu)建

以致病疫霉菌88069菌株的DNA為模板，ALY2HEcoRIF、ALY2HBamHIR為引物擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增得到的片段大小與預(yù)期誘餌片段AL大小相同(441 bp)(圖1-a)，利用膠回收試劑盒對目的基因進(jìn)行回收，之后將目的基因和pGBKT7均用EcoRI和BamHI雙酶切，pGBKT7已被線性化(圖1-b)，將酶切好的目的基因與載體用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，之后通過菌落PCR篩選陽性克隆，擴(kuò)增出440 bp左右的目標(biāo)條帶(圖1-c)，經(jīng)測序分析誘餌載體AL-BD構(gòu)建正確。

2.2 效應(yīng)蛋白AL自激活的驗證

將建構(gòu)好的誘餌載體AL-BD與AD空載質(zhì)粒用酵母共轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中，涂布于SD-Trp-Leu培養(yǎng)基上，觀察酵母菌落生長狀況(圖2-a)，2～3 d后將生長良好的酵母單菌落在加有X-α-gal的SD-Leu-Trp-His平板上進(jìn)行互作驗證，2～3 d后觀察酵母生長的情況，發(fā)現(xiàn)與正負(fù)對照相比誘餌蛋白AL-BD不具有自激活活性(圖2-b)。

2.3 誘餌載體在酵母菌中的檢測

將構(gòu)建好的AL-BD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中，涂布于SD-Trp固體缺陷型培養(yǎng)基上，觀察酵母菌落生長狀況(圖3-a)，2～3 d后挑選直徑約2 mm的酵母菌落進(jìn)行菌落PCR檢測，以AL-BD質(zhì)粒為陽性對照，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，酵母菌落1-8均有條帶且與目標(biāo)條帶大小相同(圖3-b)，說明AL-BD質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入AH109中。

2.4 效應(yīng)蛋白AL寄主靶標(biāo)的篩選

以西北農(nóng)林科技大學(xué)茄科作物抗疫病基礎(chǔ)研究實驗室構(gòu)建的晚疫病菌侵染12 h后的番茄cDNA酵母雙雜文庫為材料，用效應(yīng)蛋白AL-BD為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選AL的寄主靶標(biāo)，最后涂布在SD-Leu-Trp-His的缺陷型培養(yǎng)基上，5～7 d后將生長良好的酵母菌落在SD-His-Leu-Trp + X-α-gal的缺陷型培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)(圖4-a)，將陽性克隆進(jìn)行酵母菌落PCR檢測(圖4-b)，將有條帶的PCR產(chǎn)物送測序分析，挑取22個陽性克隆，其中AL-8、AL-11、AL-14、AL-16、AL-18為單條帶直接將PCR產(chǎn)物送測序；AL-6、AL-9、AL-13、AL-15、AL-17、AL-19為多條帶，其余沒有條帶。

對AL-6、AL-9、AL-13、AL-15、AL-17、AL-19為多條帶的及沒有條帶但在SD-His-Leu-Trp+X-α-gal平板上生長良好變藍(lán)的菌落選擇采用SD-Trp-Leu液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，之后提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行陽性克隆的檢測(圖4-c)，對有條帶的提取大腸桿菌質(zhì)粒，并采用pGADT7的通用正向引物進(jìn)行測序分析。

最終獲得AL的候選靶標(biāo)，其中還包括熱休克蛋白同源蛋白、單脫氫抗壞血酸還原酶、過氧化物酶體蛋白等(表2)。

表2 AL的候選互作蛋白Table 2 Candidate interacting proteins of AL

2.5 AL與候選靶標(biāo)的初步互作驗證

為了進(jìn)一步驗證候選靶標(biāo)與效應(yīng)蛋白的互作，將陽性克隆進(jìn)行搖菌提取酵母質(zhì)粒，通過大腸桿菌純化質(zhì)粒后將質(zhì)粒分別與誘餌蛋白AL-BD和BD空載共轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109，在SD-Leu-Trp-His+X-α-gal上進(jìn)行點板驗證，查閱文獻(xiàn)選擇AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6、AL-7進(jìn)行互作驗證，發(fā)現(xiàn)在SD-Leu-Trp-Ade-His+X-α-gal上，與正負(fù)對照相比AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6與AL-BD強互作且無自激活，AL-7與AL-BD弱互作且無自激活(圖5)。

3 討 論

RXLR效應(yīng)蛋白通過靶向植物蛋白來調(diào)控寄主免疫。目前只有極少數(shù)的RXLR效應(yīng)蛋白寄主靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)[14]。通過對效應(yīng)蛋白寄主靶標(biāo)的篩選與鑒定，能夠為揭示效應(yīng)蛋白的毒性機理提供基礎(chǔ)，對進(jìn)一步解析卵菌與寄主植物的互作機制有重要的意義。本研究采用酵母雙雜交的方法對晚疫病菌RXLR效應(yīng)蛋白AL的寄主靶標(biāo)進(jìn)行篩選和鑒定。首先構(gòu)建AL-BD載體，并對AL-BD構(gòu)建的自激活活性進(jìn)行鑒定，證明AL-BD不存在自激活活性，可以進(jìn)行酵母雙雜交篩選。研究還對轉(zhuǎn)化AL-BD載體的酵母進(jìn)行酵母菌落PCR鑒定，證明AL-BD成功轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中。之后通過酵母雙雜交篩選，初步得到12個候選互作蛋白，通過查閱文獻(xiàn)分析候選互作蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)Al-1以及AL-8、AL-9、AL-10、AL-11和AL-12與植物免疫無關(guān)，推測其可能為假陽性互作蛋白。因此，選擇AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6、和AL-7進(jìn)行初步互作驗證。結(jié)果顯示AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6與AL-BD強互作，AL-7與AL-BD弱互作(圖5)，候選互作蛋白均無自激活現(xiàn)象。研究表明AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6、AL-7均為AL的候選寄主靶蛋白。由于酵母雙雜交技術(shù)存在一定的假陽性結(jié)果[15]，需要通過例如蛋白質(zhì)免疫共沉淀、雙分子熒光互補、蛋白體外pull-down等其他蛋白質(zhì)互作技術(shù)對候選靶標(biāo)與AL的互作進(jìn)行進(jìn)一步的 鑒定。

AL-3編碼一個過氧化物酶體蛋白，有研究表明葡萄霜霉菌(Plasmoparaviticola)RXLR效應(yīng)蛋白RXLR10可以靶向植物過氧化物酶蛋白VvP42，在轉(zhuǎn)錄水平抑制其表達(dá)進(jìn)而抑制植物的PTI反應(yīng)，從而調(diào)控植物免疫[16]。本研究篩到的過氧化物酶體蛋白可能也參與調(diào)控植物免疫，在致病疫霉菌RXLR效應(yīng)蛋白AL發(fā)揮毒性的過程中發(fā)揮重要的作用。AL-4編碼的熱休克蛋白(HSP70)，研究表明沉默熱休克蛋白可以抑制不同病毒對本氏煙草的感染，具有負(fù)調(diào)控植物免疫的作用[17]。關(guān)于HSP70調(diào)控卵菌侵染的機制尚未有明確的研究，因此篩選到的熱休克同源70 ku蛋白(heat shock cognate 70 ku protein 2-like)在卵菌侵染過程中的功能以及效應(yīng)蛋白AL是否依賴其發(fā)揮毒性作用還有待進(jìn)一步研究。AL-6編碼的單脫氫抗壞血酸還原酶蛋白(MADR)、AL-2編碼的ABC(ATP binding cassette)C家族轉(zhuǎn)運蛋白、AL-5編碼的Zeta類谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶類蛋白(GSTZs)以及AL-7編碼的磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶蛋白(PIP5K9)，主要參與植物根系、果實的生長發(fā)育、細(xì)胞增殖等過程[18-21]，效應(yīng)蛋白可能通過影響植物的基礎(chǔ)代謝、生長發(fā)育等過程來降低植物免疫力，從而促進(jìn)病原菌侵染。

此外，由于效應(yīng)蛋白可能通過靶向不同寄主靶蛋白，利用不同的機理調(diào)控植物免疫[22-23]，因此針對候選靶標(biāo)還需要進(jìn)行進(jìn)一步抗、感病功能鑒定，確定其是否參與植物抗感病過程；通過進(jìn)一步分析AL毒性功能是否依賴與靶標(biāo)蛋白的互作，最終才能確定AL真正的靶標(biāo)蛋白，并揭示AL的毒性作用機理。本研究為進(jìn)一步分析AL靶標(biāo)的抗、感病功能和進(jìn)一步解析AL毒性作用機理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建致病疫霉菌RXLR效應(yīng)蛋白AL的誘餌載體，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選晚疫病菌侵染12 h后的番茄cDNA文庫，最終獲得6個AL的候選寄主靶標(biāo)，通過酵母雙雜交的方法，證明AL與6候選靶標(biāo)之間存在相互作用關(guān)系，為后續(xù)分析靶標(biāo)的抗、感病功能、揭示效應(yīng)蛋白AL的毒性作用機理提供理論基礎(chǔ)。