當(dāng)今慢性乙型肝炎治療實(shí)踐對HBV核酸檢測方法的新需求

楊瑞鋒，陳紅松，魯鳳民

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是我國肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要病因。自20世紀(jì)90年代起我國開展HBV疫苗新生兒普種以來，我國一般人群的HBV表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性率已降到5%左右，但由于既往感染者眾多，現(xiàn)有慢性HBV感染者仍有8 000萬人[1]。目前，我國每年CHB死亡人數(shù)超過30.8萬，而診斷率僅為19%，治療率僅為10%～11%，達(dá)成世界衛(wèi)生組織提出2030年“全面消除病毒性肝炎作為重大公共安全威脅”的目標(biāo)仍任重而道遠(yuǎn)[2]。當(dāng)前，治療CHB以恩替卡韋(entecavir,ETV)、替諾福韋(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)和丙酚替諾福韋(tenofovir alafenamide,TAF)等一線核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analog,NUC]為主，可強(qiáng)效抑制病毒復(fù)制，阻滯CHB向肝硬化和HCC發(fā)展，但在啟動治療、療效監(jiān)測及停藥判定等方面，均存在一定困難或爭議。

1 對HBV低病毒載量血癥(low-level viremia,LLV)的關(guān)注：進(jìn)一步增加對HBV DNA試劑靈敏度的要求

LLV一般定義為血清HBV DNA持續(xù)或間歇高于最低檢測限(limit of detection,LOD)，同時(shí)<2 000國際單位(international unit,IU)/ml。有兩種不同類型的LLV被關(guān)注，一是處于HBV感染自然病程免疫控制期的患者，即e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)陰性的非活動性HBsAg攜帶狀態(tài)。有數(shù)據(jù)顯示，處于“非活動性”攜帶狀態(tài)的患者其HCC風(fēng)險(xiǎn)依然存在。如最近一項(xiàng)來自韓國的隨訪中位數(shù)為5.1年的回顧性研究[3]顯示，代償期肝硬化患者5年HCC發(fā)生率為13.7%(19/139)，而非肝硬化組HCC發(fā)生率也高達(dá)2.0%(17/867)。我國慢性HBV感染者基數(shù)依然龐大，并且隨感染者年齡逐漸增加，肝硬化、肝癌風(fēng)險(xiǎn)逐年增高。為進(jìn)一步通過抗病毒治療減少終末期肝病及肝癌的發(fā)生，我國《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》擴(kuò)大了CHB的治療適應(yīng)證[4]。降低抗病毒治療的“門檻”，不僅僅是一個(gè)科學(xué)問題，也關(guān)乎感染者的遠(yuǎn)期健康和國家的醫(yī)療負(fù)荷。當(dāng)前更多被討論的LLV狀態(tài)，則指CHB患者接受NUC治療但未取得完全病毒學(xué)應(yīng)答的情形。當(dāng)今即使在接受強(qiáng)效NUC治療的CHB患者中，LLV的情形也非罕見。日本Ogawa等[5]報(bào)道，經(jīng)ETV治療2年的CHB患者，仍有19.9%(38/191)處于LLV。我國Sun等[6]納入239例CHB患者，其中163例在基線時(shí)有明顯肝纖維化，經(jīng)ETV治療78周后，30%的患者仍可檢測到低水平HBV DNA。NUC治療中的LLV是預(yù)后不良的預(yù)測因素。TDF治療78周時(shí)血清HBV DNA可檢出(多在20～200 IU/ml之間)和飲酒是基線Ishak≥3分患者肝纖維化進(jìn)展的兩個(gè)促進(jìn)因素，表明持續(xù)、低水平的HBV DNA仍會促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展[6]。NUC治療中的LLV還會增加罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)，韓國Kim等[7]納入875例接受ETV單藥治療的CHB患者，隨訪中位數(shù)為4.5年。LLV組和持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答組5年進(jìn)展為HCC的風(fēng)險(xiǎn)比為1.98(14.3% vs 7.5%，P=0.015)，且風(fēng)險(xiǎn)集中于肝硬化患者。當(dāng)接受ETV或TDF治療的CHB患者出現(xiàn)LLV時(shí)該如何處理，是當(dāng)下臨床關(guān)心的問題：是繼續(xù)堅(jiān)持治療，還是換用或聯(lián)合另一種NUC或長效干擾素；如需調(diào)整，如何確定調(diào)整的時(shí)機(jī)；調(diào)整后，病毒學(xué)應(yīng)答率可提高多少；對患者的長期預(yù)后有多大改善。已有一些研究嘗試回答這些問題，如Ogawa等[5]在一項(xiàng)多中心、回顧性隊(duì)列研究中，連續(xù)納入313例日本CHB患者，經(jīng)ETV單藥(n=191)或NUC聯(lián)合治療(n=122)至少2年，其中ETV治療組34例維持LLV狀態(tài)，NUC聯(lián)合治療組9例仍維持LLV狀態(tài)。之后，所有受試者換為TAF治療，48周后，ETV經(jīng)治組和NUC聯(lián)合經(jīng)治組分別有97.1%(33/34)和77.8%(7/9)患者獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答，提示換用TAF可能有助于LLV問題的解決。此外，藥物用量、服藥方式和患者的依從性等現(xiàn)實(shí)因素也可能造成間歇性LLV，也應(yīng)納入考量[8～10]。例如，有學(xué)者通過觀察TDF治療8年的CHB患者隊(duì)列(n=641)，發(fā)現(xiàn)病毒學(xué)突破或DNA閃現(xiàn)(blip)事件41次，平均DNA水平1 356拷貝/ml；其中71%(29/41)與患者依從性欠佳有關(guān)，繼續(xù)用藥都能獲得病毒學(xué)抑制，也未發(fā)現(xiàn)TDF相關(guān)耐藥突變。Liu等[10]傾向于認(rèn)為，只要TDF治療時(shí)間足夠長，LLV并不至于觸發(fā)治療方案的改變。不過，該研究受試者為歐美人群，宿主和HBV基因型與亞洲均不同。未來需要更多的前瞻性、隨機(jī)雙盲對照臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步明確如何更科學(xué)地管理LLV，以及解決LLV能使患者有多少現(xiàn)實(shí)獲益等重要問題。目前各大指南對HBV DNA檢測靈敏度(或稱LOD)都提出了更高要求(見表1)。目前，國內(nèi)外主流的HBV DNA定量試劑靈敏度可達(dá)到1～2 log10IU/ml或以下，且結(jié)果重復(fù)性較好[11]，超敏試劑將有助于臨床更早發(fā)現(xiàn)LLV。進(jìn)一步說，病毒載量極低、接近檢測試劑LOD的LLV也應(yīng)引起重視。Kim等[7]認(rèn)為，間歇性、極低載量LLV同樣會導(dǎo)致不良預(yù)后。Sun等[6]發(fā)現(xiàn)，基線有肝纖維化、經(jīng)TDF治療的患者，即使HBV DNA“轉(zhuǎn)陰”(<20 IU/ml)，仍有6.3%的患者肝纖維化出現(xiàn)進(jìn)展。對此可能的解釋是，作者使用的LOD和線性范圍低限均為20 IU/ml，靈敏度仍未達(dá)到美國肝病學(xué)會(AASLD)推薦的檢測靈敏度(5～10 IU/ml)，且研究者沒有區(qū)分HBV DNA“未檢測到”和“<20 IU/ml”線性檢測下限兩種結(jié)果模式，后者表示有PCR擴(kuò)增曲線、仍有痕量DNA存在，只是無法準(zhǔn)確定量(見圖1)。這樣一來，那些被判斷為DNA“陰性”的肝纖維化進(jìn)展患者，實(shí)際上外周血可能仍存在痕量HBV DNA，即處于極低病毒載量的LLV狀態(tài)。據(jù)此我們建議，在LLV日益引起關(guān)注的當(dāng)下，檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)增加對超敏HBV DNA試劑各種結(jié)果模式的備注，以幫助臨床醫(yī)師，尤其肝病科醫(yī)師，清楚辨析這些復(fù)雜的結(jié)果模式(見圖1)。從檢驗(yàn)方法學(xué)角度分析，LLV風(fēng)險(xiǎn)和危害被不斷強(qiáng)調(diào)的當(dāng)下，臨床診治對HBV DNA檢測下限的要求似乎“進(jìn)無止境”，但我們究竟需要多么靈敏的HBV DNA檢測試劑？最近一項(xiàng)來自歐洲的獻(xiàn)血者和受血者的隨訪研究證實(shí)，抗-HBc陽性的隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)的獻(xiàn)血者血液中含有0.15 IU/ml的HBV DNA，即可導(dǎo)致受血者感染[12]，而當(dāng)前主流的HBV DNA定性或定量試劑，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到這個(gè)靈敏度要求。借鑒到臨床肝病診治的實(shí)踐中，我們還需待進(jìn)一步明確極低病毒載量HBV感染者的自然轉(zhuǎn)歸，以及通過更強(qiáng)效NUC治療方案解決LLV后患者的真實(shí)獲益。此外，片面強(qiáng)調(diào)試劑的靈敏度會導(dǎo)致污染產(chǎn)生的低值陽性結(jié)果被誤當(dāng)做LLV，從而給CHB的診治帶來困擾。PCR產(chǎn)物污染像一把懸于核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的“達(dá)摩克利劍”——一次充分反應(yīng)的PCR可產(chǎn)生多達(dá)1012拷貝的DNA片段，將其投入標(biāo)準(zhǔn)的奧林匹克游泳池稀釋，再從中取出和反應(yīng)體系相同體積的水，其中仍含有400拷貝的DNA片段，足以偽裝成LLV的假象[13]。面對LLV結(jié)果，應(yīng)從臨床和檢驗(yàn)方法學(xué)兩個(gè)角度辯證看待，如有必要，需動態(tài)監(jiān)測(見圖2)。此外，我們還需認(rèn)識到，大部分國產(chǎn)試劑屬于開放性試劑，可靈活適應(yīng)于不同的核酸提取平臺和PCR儀。但由此產(chǎn)生的問題是，操作過程及結(jié)果分析等步驟，易受操作者主觀因素影響，結(jié)果偏倚較大，這是既往報(bào)道的、國產(chǎn)試劑和進(jìn)口封閉性試劑性能有差距的重要原因。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染疫情客觀上促進(jìn)了核酸檢測人員的培養(yǎng)和場地、設(shè)備在醫(yī)療機(jī)構(gòu)的完善，全自動、封閉式的提取和擴(kuò)增平臺以及結(jié)果自動定量算法的建立[14]，都可進(jìn)一步減輕操作負(fù)擔(dān)，減少人為干擾，提高檢測靈敏度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性，應(yīng)成為未來幾年國產(chǎn)核酸檢測的發(fā)展方向。

表1 最新指南中對HBV DNA檢測靈敏度的要求

圖1 超敏HBV DNA定量結(jié)果報(bào)告模式及對應(yīng)的解釋

圖2 從臨床和檢驗(yàn)方法學(xué)角度科學(xué)解讀和管理間歇性LLV

2 預(yù)測NUC治療停藥：HBV pgRNA有潛在價(jià)值

近年來，我國NUC藥品價(jià)格迅速降低，大大減輕了CHB患者長期服藥的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但長期服藥仍面臨藥物副作用、依從性、精神壓力等挑戰(zhàn)。各指南均推薦了NUC停藥標(biāo)準(zhǔn)(見表2)。HBsAg的消失和(或)血清學(xué)轉(zhuǎn)換是CHB功能性治愈的可靠標(biāo)志，但現(xiàn)有治療方案僅能使少數(shù)患者達(dá)到這一“理想終點(diǎn)”，因此HBsAg作為預(yù)測停藥標(biāo)志物，受眾有限。近年來，新標(biāo)志物如HBV前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)和核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)等被陸續(xù)報(bào)道用于預(yù)測NUC治療停藥。pgRNA和HBcrAg均可反映cccDNA活性[18,19]，且血清中兩標(biāo)志物水平也存在正相關(guān)[20]。在NUC治療中，兩個(gè)標(biāo)志物的消失晚于HBV DNA而又早于HBsAg，因此，作為預(yù)測停藥標(biāo)志物，理論上兼具靈敏性和特異性(見圖3)。Wang等[21]最早將pgRNA檢測用于停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)研究，發(fā)現(xiàn)若停藥時(shí)血清pgRNA陽性，則100%(21/21)停藥后24周出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)；若停藥時(shí)pgRNA測不到，則復(fù)發(fā)率僅為25%(3/12)。Fan等[22]納入127例HBeAg陽性、接受替比夫定聯(lián)合阿德福韋或替比夫定單藥治療的CHB患者作為實(shí)驗(yàn)組，這些患者獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換后停藥并隨訪4年。以停藥時(shí)血清HBV DNA和pgRNA作為臨床復(fù)發(fā)[HBV DNA>2 000 IU/ml，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)≥2倍正常值上限]的預(yù)測指標(biāo)，DNA和RNA“雙陰性”患者復(fù)發(fā)率為8%(2/25)，而DNA和(或)RNA陽性患者的復(fù)發(fā)率為31.4%(32/102，P=0.02)；此外，納入40例HBeAg陽性、接受ETV或TDF治療的患者作為驗(yàn)證組，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換后停止治療并隨訪5.5年，DNA和RNA“雙陰性”患者復(fù)發(fā)率為15.4%(2/13)，而DNA和(或)RNA陽性患者的復(fù)發(fā)率為33.3%(9/27，P=0.29)。Liu等[23]納入30例HBeAg陽性(n=17)和陰性(n=13)且符合一定停藥指征的CHB患者，隨訪2年，同樣發(fā)現(xiàn)pgRNA有停藥預(yù)測價(jià)值，相比停藥時(shí)血清pgRNA“陽性”患者，pgRNA“陰性”患者的臨床復(fù)發(fā)率更低(38.27% vs 17.50%，P=0.042)。從方法學(xué)角度看，HBV pgRNA的檢測技術(shù)壁壘較低，技術(shù)原理與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)或SARS-CoV-2 RNA類似，已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理的科研用試劑，LOD為50拷貝/ml，線性范圍為100～1×109拷貝/ml，不同試劑的定量結(jié)果也有一定的可比性[24]，但目前尚無國際標(biāo)準(zhǔn)品，也無獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)注冊的試劑。值得注意的是，考慮到RNA提取純化過程中HBV DNA殘留可能會導(dǎo)致RNA水平被高估，從臨床意義和技術(shù)特點(diǎn)兩方面考慮，我們不建議將HBV pgRNA試劑用于HBV DNA高值陽性樣本的檢測；如確有必需，可考慮采用基于核酸依賴序列擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)技術(shù)的pgRNA檢測方法，可特異性擴(kuò)增RNA而非雙鏈DNA[25]?？偨Y(jié)新近的pgRNA指導(dǎo)停藥研究可發(fā)現(xiàn)，即使停藥時(shí)HBV pgRNA“轉(zhuǎn)陰”，仍有一定概率復(fù)發(fā)，提示我們兩點(diǎn)：第一，各研究所使用的pgRNA檢測方法不同，靈敏度也不盡相同，pgRNA“轉(zhuǎn)陰”患者，實(shí)際上可能是試劑LOD之下的低RNA載量患者。第二，pgRNA單獨(dú)(或與HBcrAg等指標(biāo)并聯(lián))使用時(shí)，“陽性預(yù)測價(jià)值”(positive predictive value,PPV)更大，即“陽性”則提示有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，患者應(yīng)繼續(xù)規(guī)范用藥；檢測結(jié)果“陰性”提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低，但并非小到可以忽略，需綜合判斷。

表2 不同指南推薦的CHB患者停藥標(biāo)準(zhǔn)[4,12,13]

圖3 血清HBV DNA、RNA及HBcrAg、HBsAg在抗病毒治療過程中的動態(tài)變化[26]

3 NUC抗病毒治療：對HBV DNA、pgRNA定量試劑結(jié)果有影響

對于未經(jīng)NUC治療的CHB患者，外周血病毒核酸以Dane顆粒包裹的松弛環(huán)狀DNA(relaxed-circular DNA,rcDNA)為主，還有7%～20%的雙鏈線性DNA(duplex-linear DNA,dlDNA)[27]，現(xiàn)有的商品化試劑可檢測兩者，而不能區(qū)分是rcDNA還是dlDNA。不同HBV DNA試劑定量結(jié)果差異，主要源于引物或探針設(shè)計(jì)區(qū)域病毒突變造成的擴(kuò)增效率降低，為避免這種情況，大多數(shù)HBV DNA試劑采用簡并引物或探針。而在NUC治療下，逆轉(zhuǎn)錄過程因NUC插入使rcDNA形成被抑制，血清HBV DNA主要由3′末端殘缺的不完整的負(fù)鏈DNA片段構(gòu)成。臨床HBV DNA檢測時(shí)，位于5′端最先被逆轉(zhuǎn)錄出的X片段最易被檢測到，位于3′端的PreC/C基因序列則最早消失。與此相反，pgRNA片段位于3′端的X區(qū)的序列最易被丟失，而5′端的序列更易被保留。不同品牌HBV DNA和pgRNA定量試劑，針對不同的區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針[28]，檢測NUC治療患者血清，結(jié)果會有差異(見圖4)。我們回顧性檢測10例接受替比夫定治療的CHB患者系列血清中的HBV DNA和RNA，發(fā)現(xiàn)rcDNA在治療開始后最先消失，前C/C、S和X區(qū)基因片段依次消失；而出現(xiàn)病毒學(xué)反彈的患者，X區(qū)DNA首先出現(xiàn)[29]。由此可見，NUC治療會對HBV DNA和pgRNA檢測造成影響，如有必要，可像SARS-CoV-2或HIV RNA檢測試劑一樣，采用針對≥2個(gè)目標(biāo)基因的引物和探針，以避免漏檢或低估病毒載量。此外，在pgRNA引物和探針區(qū)域的選擇上，還需考慮NUC治療下pgRNA剪接變異體的問題[30,31]。

圖4 NUC治療造成HBV DNA和RNA片段順次消失，從而影響不同品牌HBV DNA和pgRNA定量試劑結(jié)果

4 CHB診治現(xiàn)狀對檢測方法的需求：定性標(biāo)志物追求“定量”，而定量標(biāo)志物則追求“超敏”

HBV的血清學(xué)和分子生物學(xué)標(biāo)志物眾多，大部分已實(shí)現(xiàn)定量化檢測(見表3)，同時(shí)，定量標(biāo)志物又有進(jìn)一步提高靈敏度的需求[32]。然而HBV診治的新舊標(biāo)志物眾多，研究結(jié)論也有不盡相同甚至矛盾之處，反映出當(dāng)前我們對HBV的復(fù)制和病理機(jī)制仍然了解不足，CHB的治療仍然欠缺有效根除病毒的手段，cccDNA潛伏、NUC需長期治療、部分治療的患者肝硬化和肝癌仍在潛滋暗長，這些都是我們無法回避的痛點(diǎn)和難點(diǎn)。推廣HBsAg定量、開發(fā)抗-HBc、HBcrAg和HBV pgRNA等新型定量標(biāo)志物，苛求HBV DNA高靈敏度及準(zhǔn)確性，仍是當(dāng)前治療水平下、在根治性治療方法問世之前，實(shí)現(xiàn)CHB精準(zhǔn)治療所需。

表3 HBV定量標(biāo)志物的臨床診治價(jià)值及應(yīng)用前景

續(xù)表3

5 結(jié)語

理論研究有助于新標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，而現(xiàn)實(shí)世界中，可能面臨新技術(shù)難度大，可及性差，或新試劑性能缺乏全面評價(jià)，不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果變異大、PCR攜帶污染或氣溶膠污染造成假陽性DNA/pgRNA結(jié)果等現(xiàn)實(shí)問題，提示我們有必要在理論和實(shí)踐之間尋找平衡。不過，即使如此，我們?nèi)孕鑼ρ邪l(fā)新標(biāo)志物、不斷提高現(xiàn)有標(biāo)志物檢測性能保持熱情，以不斷促進(jìn)我們對HBV這一“狡猾”的病毒特性的理解。以“功能性治愈”甚至“根治”為目標(biāo)的新藥研發(fā)，也需要納入這些標(biāo)志物以評價(jià)有效性[33]。此外，從人類病毒學(xué)研究的歷史看，HBV的血清學(xué)和分子生物學(xué)標(biāo)志物的研發(fā)和應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，也可為其他病毒或新發(fā)病毒的診治提供有益借鑒。