宏基因組技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用

孫 波，鄭光輝，高 陽，王亞東，洪維禮，呂 紅，張國軍，康熙雄

感染性疾病一直是全球的重大醫(yī)療負(fù)擔(dān)，2019年WHO發(fā)布的全球十大健康威脅中，有6種與感染性疾病有關(guān)，其中包括流感、抗生素耐藥、埃博拉或其他病毒、疫苗猶豫、登革熱及艾滋病。尤其是2020年，隨著新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)在世界范圍內(nèi)傳播，使感染性疾病的診斷和治療處在了更重要的位置[1]。目前對于感染性疾病的臨床實驗室診斷主要基于傳統(tǒng)的診斷方法，如病原體的培養(yǎng)[2]、核酸擴增檢測、免疫檢測[3]等。近年來，隨著新技術(shù)如16S基因測序[4]、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)[5]的臨床應(yīng)用，大大提高了實驗室應(yīng)對感染性疾病的診斷能力。但由于技術(shù)所限，許多傳統(tǒng)方法無法獲得病原體信息(如50%神經(jīng)系統(tǒng)感染無法獲取病原體[6])，故需要精密度更高、應(yīng)用更廣泛的新技術(shù)來應(yīng)對越來越復(fù)雜的感染性疾病。下一代測序(next generation sequencing，NGS)是一種可對成千上萬到數(shù)十億個DNA片段獨立和同時進行高通量、大規(guī)模并行測序的方法[7]。近年來，NGS已經(jīng)從研究工具轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床實驗室診斷方法，并且在臨床微生物實驗室中的應(yīng)用越來越廣泛。這些應(yīng)用包括全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)、下一代靶向測序(target next generation sequencing,tNGS)和宏基因組測序(metagenomics next generation sequencing,mNGS)等;而以上各種應(yīng)用由于其自身的側(cè)重點不同而使得操作程序有所差異[8]。其測序方法可以在不需要PCR擴增的情況下，直接對原始DNA/RNA樣品進行測序，對CG核苷酸沒有偏好，可以直接檢測和獲取甲基化信息。對宏基因組的研究最早可追溯到20世紀(jì)80年代，研究人員在一篇土壤微生物的研究報道中首次提出宏基因組學(xué)(metagenomics)的概念[9]。mNGS是一種可以直接從患者標(biāo)本中進行泛核酸檢測的方法，該方法不會有選擇地放大特定靶標(biāo)序列,因為它會對所有樣品中的核酸放大和并行測序,允許無差別檢測所有微生物(如細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌)、抗體、毒力因子,甚至宿主生物標(biāo)志物等[10～12]。與傳統(tǒng)實驗室診斷方法不同，mNGS允許直接從患者標(biāo)本進行泛核酸檢測，而無需病原體的培養(yǎng)。此方法將樣本內(nèi)的所有核酸提取并對其進行平行測序，包含對宿主和病原體的所有核酸進行測序，具有直接從患者標(biāo)本進行無假設(shè)診斷的優(yōu)勢，這種方法既可以將DNA作為測序目標(biāo)，也可將RNA作為研究對象，且針對RNA的mNGS可稱為宏轉(zhuǎn)錄組NGS[13]。此外，mNGS可以從感染源或游離DNA(cell free DNA,cfDNA)中檢測完整的微生物。cfDNA是微生物死亡裂解后過濾到血液或無菌體液中的小核酸片段，可作為遠(yuǎn)端感染部位(如肺炎時的肺部)的讀數(shù)[14,15]。了解這些方法的差異和局限性是很重要的。例如，若基于RNA的方法不包括在mNGS程序中，RNA病毒將無法被檢測到，或者基于轉(zhuǎn)錄組的分析將不能用于研究宿主的免疫反應(yīng)。已有大量的文獻(xiàn)證明，mNGS可以作為一種針對于多個系統(tǒng)感染的診斷工具，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[16]、血流感染[17]、呼吸道感染[18]、胃腸道感染[19]、假關(guān)節(jié)感染[20]、尿路感染[21]和眼部感染[22]。可鑒定出的病原體包括細(xì)菌、分枝桿菌、RNA病毒、DNA病毒、酵母、絲狀真菌和寄生蟲。在少數(shù)病例中，經(jīng)典的診斷手段仍然發(fā)揮著重要的作用，而mNGS在檢測以前治療過的患者中新的、罕見的、非典型病原體導(dǎo)致的感染方面特別成功，并且在多種病原體導(dǎo)致的協(xié)同感染與耐藥基因檢測方面也發(fā)揮著重要的作用。本文對mNGS在感染性疾病中的應(yīng)用進行綜述，以求更好地支持臨床診斷。

1 mNGS作為常規(guī)臨床檢測手段的前景

有研究表明，與傳統(tǒng)的診斷相比，mNGS具有更高的敏感性，因此對mNGS的應(yīng)用前景更具有指導(dǎo)意義。一項針對于不同標(biāo)本來源的橫向?qū)Ρ葘嶒烇@示，mNGS的總體臨床檢測敏感度和特異度分別為50.7%和85.7%，而傳統(tǒng)方法的診斷敏感度和特異度分別為35.2%和89.1%，值得注意的是，mNGS在結(jié)核桿菌、病毒、厭氧菌和真菌方面的檢測尤其突出[23]。此外，與液體培養(yǎng)相比，mNGS在鑒定假關(guān)節(jié)感染中的病原體方面顯示出更高的敏感度，可達(dá)到88%[95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)，77.1%～94.5%]，特異度為80%(95%CI，71%～88%)[24]。越來越多快速測序技術(shù)的發(fā)展，有助于將mNGS轉(zhuǎn)化為傳染病的常規(guī)診斷工具。由于微生物實驗室目前依然采用傳統(tǒng)微生物鑒定方法，即使是自動化的儀器依然依賴基于生長的方法，需要較長時間得到結(jié)果，導(dǎo)致漏診或延遲診斷以及臨床醫(yī)師通過經(jīng)驗性地使用廣譜抗生素或抗真菌藥物的濫用。因此我們認(rèn)為mNGS可以作為一種非侵入性的替代工具，用于分析那些感染患者的容易獲得的樣本(如血液、尿液等)。我們需要更多的臨床經(jīng)驗來支持這些新的檢測思路的實施，例如，在mNGS鑒定病原體時，需要明確哪些傳染病和這些疾病的哪些階段適合收集易于獲取的樣本等。2020年在中國發(fā)布了《中國宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識》，該共識對于宏基因組學(xué)在病原菌的檢測、耐藥基因檢測、宿主免疫監(jiān)測、病原體定量、疑難罕見病等領(lǐng)域中推動感染性疾病精準(zhǔn)診療的發(fā)展。

2 mNGS對于罕見病原體的檢測

有文獻(xiàn)報道1例罕見的慢性神經(jīng)鉤端螺旋體病，患者為14歲男孩，急性發(fā)作后持續(xù)數(shù)月，傳統(tǒng)的方法如腦脊液培養(yǎng)、血清學(xué)試驗和實時熒光定量PCR都未能發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致感染的病原體。特別是各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中檢測較為罕見的侵入性病原體。對腦脊液樣本進行mNGS檢測，確定了鉤端螺旋體特異性序列，隨后的血清學(xué)檢測和PCR檢測也確認(rèn)了鉤端螺旋體感染[25]。另一案例顯示，臨床醫(yī)師通過mNGS分析腦脊液樣本，診斷出1例致死性腦膜腦炎，并迅速鑒定出一種罕見的傳染源Balamuthia mandrillaris[26]。Ai等[27]于2017-07報道了1例由偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的傳染性眼內(nèi)炎，結(jié)果表明，PRV可能通過與豬污染物的直接接觸而感染人類。Wylie等[28]使用mNGS發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌(皮膚正常菌群的一部分)是慢性腦膜炎的原因之一，與對照組相比，臨床樣本中痤瘡丙酸桿菌特異性序列數(shù)量更多，基因組覆蓋率高，治療效果也支持他們的結(jié)論。以上案例顯示，mNGS可以為罕見病原體提供精準(zhǔn)診斷思路，更好地解決臨床感染問題。在神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中，建議mNGS與常規(guī)微生物檢測聯(lián)合應(yīng)用，可提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原學(xué)診斷。

3 mNGS對于協(xié)同感染的檢測

mNGS的另一個優(yōu)點是它可以在一次試驗中同時檢測到多種病原體，協(xié)同感染的患者表現(xiàn)出不同的免疫特征(對病原體攻擊的抵抗)，而且一個病原體可能在不同的患者中表現(xiàn)出毒性差異。2016年，Sardi等[29]通過mNGS檢測，在巴西2例已確診寨卡病毒感染的患者身上發(fā)現(xiàn)了寨卡和基孔肯雅病毒(Chikungunya fever，CHIKV)的協(xié)同感染。在這兩個案例中，CHIKV的結(jié)果都被特異性的RT-PCR驗證，這強調(diào)了無偏倚的mNGS在鑒定協(xié)同感染方面的潛在應(yīng)用價值。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)艱難梭菌可能與產(chǎn)氣梭狀芽胞桿菌和腹瀉患者糞便樣本中的4種病毒屬同時存在，雖然可以通過其他方法證實這些微生物的存在，但無法區(qū)分是哪種病原體導(dǎo)致了疾病。而對臨床醫(yī)師來說，確定候選治療的主要藥物是一項挑戰(zhàn)，聯(lián)合治療是對抗協(xié)同感染的常見策略，但隨著mNGS技術(shù)越來越多地應(yīng)用于臨床，個別病例中可能同時檢測到更多假定的病原體。只有深入了解這些病原體的致病特性，才能解決協(xié)同感染的問題。

4 mNGS對于耐藥基因的檢測

mNGS可以對病原體進行耐藥基因的檢測，常規(guī)藥敏試驗(antimicrobial susceptibility test,AST)或傳統(tǒng)耐藥基因檢測方法需要對病原菌進行分離，耗時較長且操作復(fù)雜，對不可培養(yǎng)的細(xì)菌無能為力。mNGS能夠檢測病原體的基因組(部分或全部長度)，因此在整個細(xì)菌群落中對耐藥相關(guān)基因具有極大的檢測能力。2017年，一項研究證明，在單微生物和多微生物樣本中，經(jīng)mNGS檢測，可分別預(yù)測94.1%和76.5%的骨和關(guān)節(jié)感染病原體正確的抗生素敏感性[30]。同時mNGS在HIV耐藥基因的檢測和分型方面具有明顯的優(yōu)勢[31]。

5 結(jié)語

mNGS在泛病原體檢測試驗中的潛力已在許多研究和臨床背景中得到證實，其可以在不需要患者感染信息的情況下檢測不常見和協(xié)同感染病原體，在耐藥性預(yù)測方面具有優(yōu)勢，為危重患者或免疫缺陷患者難以診斷的感染提供新的診斷線索。隨著測序成本的持續(xù)降低，以及診斷和信息學(xué)的自動化程度越來越高，更多的大中型實驗室可能會實施mNGS，因為與一代測序替代方法相比，其成本更具競爭力，而且這些方法將成為標(biāo)準(zhǔn)化方法，甚至超越使用探針或特異性PCR擴增子的16S擴增方法[32]。對于mNGS的臨床應(yīng)用，各種樣品類型的方法將會有更多的標(biāo)準(zhǔn)化和改進，包括如何解釋和量化樣品中復(fù)雜微生物群(如呼吸菌群、尿液菌群)中的病原體。此外，人們很可能看到這些測試轉(zhuǎn)化為精確的醫(yī)學(xué)診斷，整合病原體、微生物組和宿主轉(zhuǎn)錄組研究[33]，以更好地定義疾病狀態(tài)。雖然在樣品處理、工作流程建立、分析管道、法規(guī)要求和結(jié)果解釋等方面還存在缺陷，然而更有效的工作流程、更低的檢測成本、更短的實驗室周轉(zhuǎn)時間以及簡化的解釋標(biāo)準(zhǔn)促使mNGS將被臨床醫(yī)師、微生物診斷專家和患者廣泛接受。因此，隨著測序技術(shù)的進一步發(fā)展，以及更多的實踐經(jīng)驗和評估，在未來5～10年，盡管mNGS不太可能完全取代傳統(tǒng)的病原體鑒定和AST方法，但mNGS仍然有著巨大的潛力，并隨著時間的推移不斷改進，為感染性疾病提供更強的診斷能力。