太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

潘振東，李 璐，薛夢(mèng)瑩，張華峰，3，4*

（1 陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院 西安710119 2 中俄食品與健康科學(xué)國際聯(lián)合研究中心 西安710119 3 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室 西安710119 4 陜西省漢陰縣富有機(jī)硒食品科技創(chuàng)新試驗(yàn)示范站 西安710119）

百合科蔥屬植物是重要的香料、蔬菜、醫(yī)藥來源[1-3]。本實(shí)驗(yàn)室研究人員發(fā)現(xiàn)，韭菜（Allium tuberosum）、大蔥（Allium fistulosum）和小蔥（Allium ascalonicum）的水提物與乙醇提取物皆具有自由基清除活性，其中韭菜的抗氧化能力最強(qiáng)[1]。Meriga 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜（Allium sativum）水提物和甲醇提取物能夠抑制枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candida albicans）的生長。Khalid 等[3]研究證明，韭菜水提物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性略高于大蒜水提物。Behbahani 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，部分蔥屬植物精油對(duì)釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、白色念珠菌等具有一定的抑制作用。太白韭（Allium prattii） 是秦巴山區(qū)的特色藥食同源植物，既可入藥，也可作為野菜或香料食用[6]。然而，迄今未見有關(guān)太白韭抑菌活性的研究報(bào)道。本研究分析了太白韭乙醇提取物對(duì)食源性致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用，采用原子吸收光譜法、掃描電子顯微鏡技術(shù)等探討其抑菌機(jī)理，分析其化學(xué)組成，以期為太白韭資源的開發(fā)利用和金黃色葡萄球菌抑菌劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與植物材料

金黃色葡萄球菌CICC23656 菌株，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。太白韭樣品，于2017年采自陜西省渭南市秦嶺山區(qū)。將太白韭葉片分揀除雜，用自來水、蒸餾水依次漂洗，置通風(fēng)處陰干后，粉碎過篩（80 目），制得太白韭樣品粉末，備用。

1.2 主要試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（BR 級(jí)），北京奧博星有限責(zé)任公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（BR 級(jí)），青島海博生物技術(shù)有限公司；大蒜素（allicin，純度≧98%）、蒜氨酸（alliin，純度≧98%）、尿苷（uridine，純度≧98%）、β-胸苷（β-thymidine，純度≧98%）、腺苷（adenosine，純度≧98%）、2'-脫氧腺苷（2'-deoxyadenosine monohydrate，純度≧98%）、蘆?。╮utin，純度≧98%）、山柰酚（kaempferol，純度≧98%）、槲皮素（quercetin，純度≧98%）和異鼠李素（isorhamnetin，純度≧98%），美國Sigma 試劑公司；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒、紅四氮唑（純度≧99%）、氨芐青霉素鈉（USP 級(jí)），上海源葉公司；鉀（K+）、鈣（Ca2+）、鈉（Na+）、鎂（Mg2+）標(biāo)準(zhǔn)離子液，天津傲然精細(xì)化工研究所；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG，純度≧99%），上海阿拉丁有限公司；甲醇（色譜純級(jí)）等，德國Merck 公司。

1.3 儀器與設(shè)備

JPCQ0328 型全數(shù)字式超聲波清洗機(jī)，武漢嘉鵬公司；FDU-1200 型冷凍干燥機(jī)，日本東京理化器械有公司；TAS-990AFG 型原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MC1000 型離子濺射儀、S-3400N 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；SPD-16 型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 太白韭乙醇提取物制備 參考李璐等[1]的方法制備太白韭乙醇提取物。取太白韭樣品粉末，以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液為提取溶劑，先在50℃水浴中浸提2 h，之后超聲波輔助提取20 min，重復(fù)提取3 次，濾液合并后減壓蒸餾，凍干后得到太白韭乙醇提取物。

1.4.2 最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）測(cè)定 采用二倍稀釋法測(cè)定太白韭乙醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度[7]。用無菌液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，用苯甲酸鈉和氨芐青霉素鈉作為陽性對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.3 抑菌圈的測(cè)量 采用牛津杯法測(cè)量太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑[8]。用無菌生理鹽水作為陰性對(duì)照，用苯甲酸鈉和氨芐青霉素鈉作為陽性對(duì)照，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.4 生長曲線繪制 參考Huang 等[9]的方法，用無菌液體培養(yǎng)基將太白韭乙醇提取物配制成終質(zhì)量濃度為1/2MIC 和MIC 的溶液，加入2%的菌懸液，在37 ℃，110 r/min 條件下連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔1 h 取2 mL 培養(yǎng)液，測(cè)定1/2MIC 和MIC 太白韭乙醇提取物處理組培養(yǎng)液在600 nm 波長處的吸光值（試驗(yàn)組）。以不添加太白韭乙醇提取物的無菌液體培養(yǎng)基為對(duì)照組。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.5 電導(dǎo)率的測(cè)定 參考Li 等[10]的方法，定時(shí)測(cè)定上述試驗(yàn)組、對(duì)照組的電導(dǎo)率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制電導(dǎo)率變化曲線。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.6 鉀、鈣、鈉、鎂離子含量的測(cè)定 參考Wang等[11]的方法，使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鉀、鈣、鈉、鎂離子的含量。試驗(yàn)重復(fù)3 次。以離子濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，K+，Ca2+，Na+，Mg2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=0.4999x + 0.0204（相關(guān)系數(shù)R2=0.9981），y=0.0344x + 0.0154（R2=0.9947），y=0.9493x +0.1632（R2=0.9757），y=0.56x + 0.0608（R2=0.9581）。

1.4.7 核酸、蛋白質(zhì)與多糖含量的測(cè)定 參照李璐等[12]的方法測(cè)定胞外核酸含量。參考Gen 等[13]的方法，以牛血清蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定胞外蛋白含量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)（x）、蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=3.0327x+0.651（R2=0.9758）。參考Zhang 等[14]的方法，以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用苯酚硫酸法測(cè)定胞外多糖含量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)（x）、多糖含量為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=7.9949x+0.1071（R2=0.9980）。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.8 細(xì)胞壁完整性分析 每隔6 h 取上述試驗(yàn)組、對(duì)照組處理液2 mL，4 000 r/min 離心10 min留上清液，用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定酶活力。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、堿性磷酸酶活力為縱坐標(biāo)繪制酶活力變化曲線。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.9 內(nèi)膜透化作用分析 參考Tao 等[15]的方法繪制內(nèi)膜透化作用變化曲線。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.10 電子顯微鏡分析 參考Li 等[16]的方法，取上述試驗(yàn)組、對(duì)照組處理液，4 000 r/min 離心10 min 收集沉淀，用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀3 次，加入2.5%戊二醛溶液，于4 ℃固定12 h，離心收集菌體沉淀，用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀3 次，再用體積分?jǐn)?shù)30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇溶液依次洗滌菌體。待菌體自然風(fēng)干后，使用離子濺射儀噴金，而后使用掃描電子顯微鏡觀測(cè)細(xì)菌形態(tài)變化。

1.4.11 高效液相色譜分析 稱取10 mg 太白韭乙醇提取物，溶于10 mL 甲醇中，用0.45 μm 濾膜過濾后即得太白韭乙醇提取物樣品溶液。使用高效液相色譜儀分析太白韭樣品溶液的化學(xué)組成。參照張民等[17]的方法測(cè)定大蒜素和蒜氨酸的含量。參照潘興嬌等[18]的方法測(cè)定尿苷、β-胸苷、腺苷和2’-脫氧腺苷的含量。參考王洋[19]的方法測(cè)定蘆丁、山柰酚、槲皮素和異鼠李素的含量，色譜條件優(yōu)化如下：色譜柱為Luna-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相A 為甲醇，B 為水；梯度洗脫程序?yàn)?～3 min（50%～30%B），3～8 min（30%～26%B），8～10 min（26%～25%B），10～12 min（25%～22%B），12～15 min（22%～50%B）；紫外檢測(cè)波長360 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL/min。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 軟件畫圖，采用最小顯著差數(shù)t 檢驗(yàn)方法分析差異顯著性，P＜0.05（P ≥0.01） 和P＜0.01 分別表示平均數(shù)之間差異顯著、極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 太白韭的抑菌活性

由圖1可見，隨著太白韭乙醇提取物質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑不斷增大，說明太白韭的抑菌活性具有劑量依賴性。太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為15 mg/mL。

2.2 太白韭的抑菌機(jī)理

2.2.1 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌生長曲線的影響由圖2可以看出，未經(jīng)太白韭乙醇提取物處理的金黃色葡萄球菌（對(duì)照組）生長正常，具有典型的遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4 個(gè)微生物生長階段。經(jīng)1/2MIC 和MIC 太白韭乙醇提取物處理后，金黃色葡萄球菌沒有明顯的對(duì)數(shù)期，生長受到較大程度抑制。

2.2.2 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率的影響由圖3可見，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)3 h 后，試驗(yàn)組菌體培養(yǎng)液的電導(dǎo)率明顯升高。1/2MIC 和MIC 太白韭乙醇提取物處理的培養(yǎng)液電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），MIC 處理組的電導(dǎo)率顯著高于1/2MIC 處理組（P＜0.05）。這可能是因?yàn)樘拙乱掖继崛∥镒饔糜诰w時(shí)，細(xì)胞膜遭到破壞，胞內(nèi)電解質(zhì)滲出，從而導(dǎo)致菌體培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加[20]。

圖1 太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑Fig.1 Inhibitory zone diameter of ethanol extract from Allium prattii against Staphylococcus aureus

圖2 金黃色葡萄球菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of Staphylococcus aureus

圖3 金黃色葡萄球菌的電導(dǎo)率Fig.3 Conductivity of Staphylococcus aureus

2.2.3 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌胞外離子含量的影響 由圖4可以看出，MIC 太白韭乙醇提取物處理組的金黃色葡萄球菌胞外鉀、鈣、鈉、鎂離子含量顯著高于1/2MIC 處理組（P＜0.05），并且1/2MIC 和MIC 處理組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），提示太白韭乙醇提取物可能使金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，從而引起菌體細(xì)胞內(nèi)的鉀、鈣、鈉、鎂離子外泄。胞外離子質(zhì)量濃度升高可能是菌體培養(yǎng)液電導(dǎo)率改變的重要原因[21]。

圖4 太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌鉀、鈣、鈉和鎂離子含量的影響Fig.4 Effects of ethanol extract from Allium prattii on contents of K+， Ca2+，Na+ and Mg2+ of Staphylococcus aureus

2.2.4 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌胞外核酸含量的影響 如圖5所示，MIC 太白韭乙醇提取物處理組金黃色葡萄球菌胞外核酸含量顯著高于1/2MIC 處理組，并且兩者均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明太白韭乙醇提取物可能破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致核酸等生物大分子大量泄漏[22]。由此推斷，太白韭乙醇提取物能夠影響金黃色葡萄球菌的核酸代謝，最終抑制菌體生長繁殖。

2.2.5 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌胞外蛋白含量的影響 由圖6可見，隨著金黃色葡萄球菌培養(yǎng)時(shí)間的延長，太白韭乙醇提取物試驗(yàn)組細(xì)菌胞外蛋白質(zhì)含量明顯升高，而對(duì)照組細(xì)菌胞外蛋白質(zhì)含量的變化較小。太白韭乙醇提取物處理12 h 后，MIC 處理組的胞外蛋白質(zhì)含量顯著高于1/2MIC處理組（P＜0.05）。這可能是由于太白韭乙醇提取物使得金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜受到嚴(yán)重破壞，從而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)外溢。

圖5 太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌核酸含量的影響Fig.5 Effect of ethanol extract from Allium prattii on contents of nucleic acids of Staphylococcus aureus

2.2.6 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌胞外多糖含量的影響 由圖7可以看出，隨著金黃色葡萄球菌培養(yǎng)時(shí)間的延長，試驗(yàn)組培養(yǎng)基中的胞外多糖含量明顯增加，而對(duì)照組胞外多糖含量變化很小。太白韭乙醇提取物作用8 h 后，MIC 處理組胞外多糖含量顯著高于1/2MIC 處理組（P＜0.05），并且兩者皆顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明太白韭乙醇提取物可能影響了金黃色葡萄球菌的多糖代謝過程。

圖6 太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)含量的影響Fig.6 Effect of ethanol extract from Allium prattii on contents of protein of Staphylococcus aureus

2.2.7 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁完整性的影響 堿性磷酸酶通常存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，在正常情況下，細(xì)胞外檢測(cè)不到，然而在細(xì)胞壁遭到破壞時(shí)，堿性磷酸酶可能外泄[23]。由圖7可以看出，經(jīng)太白韭乙醇提取物處理過后，試驗(yàn)組細(xì)菌胞外堿性磷酸酶活力較對(duì)照組明顯增大，且MIC 組顯著高于1/2MIC 組（P＜0.05），說明太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁有一定的破壞作用，從而導(dǎo)致胞外堿性磷酸酶活力增加。太白韭乙醇提取物的質(zhì)量濃度越高，對(duì)菌體細(xì)胞壁的破壞作用越強(qiáng)。

2.2.8 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌內(nèi)膜通透性的影響 β-半乳糖苷酶是一種細(xì)菌內(nèi)源性酶，在正常情況下其活性變化很小，然而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膜遭到破壞時(shí)其可能逸出細(xì)胞。β-半乳糖苷酶可將ONPG水解成鄰硝基苯酚（ONP），檢測(cè)ONP 的吸光度可以了解該酶的活力，進(jìn)而判斷細(xì)胞內(nèi)膜通透性的變化[24]。從圖9可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，試驗(yàn)組培養(yǎng)液的吸光度明顯增加，而對(duì)照組變化很小。培養(yǎng)4 h 后，MIC 太白韭乙醇提取物處理組的吸光度顯著高于1/2MIC 處理組（P＜0.05），并且兩者均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。據(jù)此推斷，太白韭乙醇提取物可能嚴(yán)重破壞了細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜的通透性，從而導(dǎo)致大量β-半乳糖苷酶從細(xì)胞在釋放出來。胞外核酸、蛋白質(zhì)、多糖等定量分析試驗(yàn)也提示太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜具有較強(qiáng)的破壞效應(yīng)。

圖7 太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌多糖含量的影響Fig.7 Effect of ethanol extract from Allium prattii on contents of polysaccharides of Staphylococcus aureus

圖8 太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌堿性磷酸酶活力的影響Fig.8 Effects of ethanol extracts from Allium prattii on the activity of alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

圖9 金黃色葡萄球菌β-半乳糖苷酶活性Fig.9 Activity of β-galactosidase of Staphylococcus aureus

2.2.9 太白韭對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響由圖10可見，正常的金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞完整，呈近圓球形，表面平整、光滑，細(xì)胞之間有明確的分界線（圖10a）。與正常對(duì)照組相比，試驗(yàn)組細(xì)菌菌體發(fā)生了明顯變化。其中，1/2MIC 太白韭乙醇提取物處理后，少量細(xì)菌細(xì)胞變形，細(xì)胞之間出現(xiàn)嚴(yán)重的粘連現(xiàn)象（圖10b）；MIC 太白韭乙醇提取物處理后，絕大多數(shù)細(xì)胞嚴(yán)重變形，呈橢球形，細(xì)胞表面出現(xiàn)皺縮或裂口，部分菌體之間通過膠狀物質(zhì)相互粘連、聚合（圖10c）?？梢钥闯?，太白韭乙醇提取物能夠明顯破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞形態(tài)，并且提取物質(zhì)量濃度越高，對(duì)菌體的破壞程度越嚴(yán)重。

圖10 金黃色葡萄球菌形態(tài)觀察Fig.10 Morphology of Staphylococcus aureus

2.3 太白韭乙醇提取物的化學(xué)組成

采用高效液相色譜法檢測(cè)了太白韭乙醇提取物中的化學(xué)成分（圖11和表1）。太白韭乙醇提取物中含有大蒜素和蒜氨酸2 種含硫類化合物，尿苷、β-胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷4 種含氮類化合物，以及蘆丁、山柰酚、槲皮素和異鼠李素4 種黃酮類化合物（圖11）。其中黃酮類化合物和含硫類化合物含量較高，含氮類化合物含量較低（表1）。大蒜素是重要的含硫化合物，能有效抑制大腸桿菌、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌、黑曲霉（Aspergillus niger）等的生長[25]；蘆丁可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae）、綠膿桿菌、釀膿鏈球菌等的生長[26]；山柰酚能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長[27]；槲皮素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿性葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、綠膿桿菌等具有一定的抑菌活性[28]。太白韭乙醇提取物中蘆丁（22.277 mg/g）、槲皮素（21.258 mg/g）、大蒜素（16.619 mg/g）、山柰酚（6.177 mg/g）含量較高，這可能是其對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖11 太白韭乙醇提取物高效液相色譜分析Fig.11 High-performance liquid chromatograms of ethanol extract of Allium prattii

表1 太白韭乙醇提取物中化學(xué)成分的含量Table 1 Contents of phytochemicals in ethanol extract of Allium prattii

3 結(jié)論

太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，其最小抑菌質(zhì)量濃度為15 mg/mL。太白韭乙醇提取物能夠破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞形態(tài)，對(duì)細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生明顯影響，引起胞外金屬離子（K+，Ca2+，Na+，Mg2+）、生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、多糖）含量以及菌體培養(yǎng)液電導(dǎo)率升高，導(dǎo)致菌體之間相互粘連、聚合。太白韭乙醇提取物中共檢測(cè)出10 種化學(xué)成分，包括大蒜素和蒜氨酸2 種含硫類化合物，尿苷、β-胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷4 種含氮類化合物，以及蘆丁、山柰酚、槲皮素和異鼠李素4 種黃酮類化合物。太白韭乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性可能與其中所含的蘆丁、槲皮素、大蒜素、山柰酚等化合物有關(guān)。本研究為太白韭資源的利用以及金黃色葡萄球菌抑菌劑的開發(fā)提供了依據(jù)。