超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法測定牛奶中19種喹諾酮類抗生素

馬俊美，范素芳，孫 磊，張明星，張冬生，李 強

（河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室 石家莊050000）

喹諾酮類抗生素（Quinolones，QNs）又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類抗生素，是一類具有抗菌譜廣，抗菌性強，價格低廉等特點的人工合成抗菌藥，廣泛用于人和動物疾病的預防和治療中[1-2]，然而攝入含有QNs 殘留的動物源性食品，除造成藥物致敏和其它對人體的毒副作用外，還容易產(chǎn)生細菌耐藥性[3]。聯(lián)合國糧農組織、歐盟、美國食品和藥物管理局等均制定了多種喹諾酮類藥物在動物組織中的最高殘留限量[4]。我國農業(yè)部也對動物源性食品中多種喹諾酮類藥物制定了最高殘留限量[5]。

目前，QNs 的檢測方法主要有：酶聯(lián)免疫分析法[6-7]、高效液相色譜法[8-14]、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[15-21]。酶聯(lián)免疫分析法容易出現(xiàn)假陽性結果，多用于篩查。高效液相色譜法僅靠保留時間進行定性，因此抗干擾能力弱。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法具有特異性強，靈敏度高等優(yōu)點[22-26]，已成為動物源性食品中藥物殘留分析的首選方法。當前現(xiàn)行檢測動物源性食品中喹諾酮類抗生素的國家標準方法為高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[27-28]，均采用外標法定量，GB/T 20366-2006[27]的前處理方法中需要大量提取液提取，經(jīng)正己烷除脂后再旋轉蒸發(fā)濃縮，耗時長；GB/T 21312-2007[28]需用緩沖鹽溶液提取，再經(jīng)傳統(tǒng)HLB 固相萃取小柱凈化，操作繁瑣。

本試驗采用PRiME HLB 新型固相萃取小柱，不需要活化、平衡、洗脫等步驟，直接將牛奶中的磷脂等非極性干擾物吸附在填料內，待測物過濾到收集瓶中，簡化了操作步驟，節(jié)省了前處理時間。本文將該技術與超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（Ultra high performance liquid chromatography quadrupole electrostatic field orbital ion trap mass spectra，UPLC/Q-Orbitrap）相結合，用于牛奶中QNs 定性篩查與定量檢測研究。通過一級質譜全掃描獲得待測物的一級精確質量數(shù)，進行定性與定量，通過二級質譜掃描模式獲得待測物的二級特征圖譜并確證，提高了分析效率，保證了檢測結果的準確性，適合大批量樣品中喹諾酮類藥物殘留的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甲醇、乙腈（色譜純級），美國Thermo Fisher公司；甲酸（色譜純級），美國Sigma 公司；超純水，廣州屈臣氏公司。

標準品：吡哌酸（Pipemidic acid，PIP，99.1%）、依諾沙星（Enoxacin，ENO，99.9%）、馬波沙星（Marbofloxacin，MAR，99.9%）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR，99.1%）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL，99.0%）、氟羅沙星（Fleroxcain，F(xiàn)LE，99.7%）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF，99.0%）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP，94.0%）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM，99.5%）、丹諾沙星（Danofloxacin，DAN，94.0%）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR，99.9%）、奧比沙星（Orbifloxacin，ORB，97.7%）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR，97.0%）、司帕沙星（Sparfloxacin，SPA，99.0%）、雙氟沙星（Difloxacin，DIF，96.1%）、噁喹酸（Oxolinic acid，OXO，99.8%）、西諾沙星（Cinoxacin，CIN，99.9%）、萘啶酸（Nalidixic acid，NAL，99.6%）、氟甲喹（Flumequine，F(xiàn)LU，99.0%）、諾氟沙星-D5（Norfloxacin-D5，NOR-D5，99.0%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀-四極桿/靜電場軌道阱（Q-Exactive）組合式高分辨質譜儀，美國Thermo Fisher 公司；氮吹儀，美國Organomation Associates.Jnc 公司；3K15 離心機，美國Sigma公司；超聲波清洗儀，德國Elma 公司；旋渦振蕩器，德國IKA 公司；Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（60 mg/3cc），美國Waters 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取2.0 g 牛奶樣品于50 mL 離心管中，加入20 ng 內標（諾氟沙星-D5），再加入1%甲酸乙腈7 mL，渦旋混勻1 min，定容至10 mL，9 500 r/min 離心3 min，取5 mL 上清液過PRiME HLB 固相萃取柱，收集全部流出液，40℃下氮氣吹干，加入1 mL 10%甲醇水溶液，渦旋混勻。復溶液過0.22 μm 濾膜，待測定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm；美國Waters 公司）。流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈。梯度洗脫程序：0～2.0 min，B 相保持10%；2～9 min，B 相從10%線性升至80%；9～12 min，B 相保持80%；12～13 min，B 相從80%線性降至10%；13～15 min，B相保持10%。

1.2.3 質譜條件 質量分析器：四極桿/靜電場軌道阱；電噴霧離子源（正離子）；掃描模式：Full MS/dd-MS2；鞘氣流量35 Arb；輔助氣流量10 Arb；噴霧電壓：3.8 kV；離子源溫度350 ℃；毛細管溫度320 ℃。Full MS 掃描范圍：m/z 100～1 500，分辨率：70 000，AGC target 為3×106。dd-MS2分辨率17 500，AGC target 為1×105，隔離窗口為4.0 m/z，F(xiàn)ixed first mass 為120.0 m/z，碰撞能為30 eV。19種QNs 質譜信息見表1。

表1 19 種QNs 的質譜信息Table 1 Mass parameters for the 19 quinolones

（續(xù)表1）

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化

與傳統(tǒng)三重四極桿的MRM 采集方式不同，本研究采用高分辨質譜的Full MS/dd-MS2采集方式，可同時進行一級全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級質譜掃描，簡化了質譜參數(shù)的優(yōu)化過程，提高試驗效率，更利于樣品的快速篩查和定量分析。試驗采用Q-Extractive 對19 種QNs 混合標準溶液進行正離子掃描，圖1為19 種QNs 和諾氟沙星-D5 的提取離子色譜圖（50 ng/mL），可以根據(jù)保留時間及精確質量數(shù)對目標物進行初步定性。從表1可以看出，19 種QNs 的質量數(shù)相對偏差均小于3.0×10-6，符合歐盟2002/657/EC 增加的LC/MS 目標準則，因此可以根據(jù)理論精確質量數(shù)對目標物進行確證[29-30]。圖2為19 種QNs 的二級特征圖譜，通過碎片離子信息，可以進一步提高定性的準確性。

2.2 提取溶劑的選擇

本試驗考察了不同溶劑（乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈） 對19 種QNs 的提取效果，加標濃度為20 μg/kg 時，19 種QNs 的平均回收率見圖3。從圖3可看出，用乙腈作為提取溶劑，回收率普遍較低，隨著甲酸的加入，目標物的回收率增大，這是由于喹諾酮類抗生素的結構上有羧基和哌嗪基，具有酸堿兩性，易溶于酸性或堿性溶劑。采用1%甲酸乙腈對目標化合物的提取效果最好，19 種QNs 的回收率在86.6%～100%范圍內。用0.5%甲酸乙腈作為提取溶劑時，沙拉沙星的回收率為74.3%，用2%甲酸乙腈作為提取溶劑時，萘啶酸的回收率為77.3%，回收率較低。這可能是由于甲酸濃度較低時，蛋白沉淀不完全，使提取液不夠澄清，過固相萃取小柱時有損失，進而影響回收率；甲酸濃度較高時，可能會影響離子化效率，使樣品溶解性減弱。因此，本試驗選取1%甲酸乙腈進行提取并沉淀蛋白。

圖1 19 種QNs 和諾氟沙星-D5 的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 19 quinolones and norfloxacin-D5

圖2 19 種QNs 的二級質譜圖Fig.2 MS2 spectra of the 19 quinolones

2.3 凈化方式的優(yōu)化

牛奶中存在大量的磷脂，會干擾目標化合物的分析，影響色譜柱的使用壽命，增加儀器系統(tǒng)的維護成本和難度。圖4比較了僅通過酸化乙腈提取和經(jīng)酸化乙腈提取后PRiME HLB 小柱凈化的空白牛奶樣品的磷脂監(jiān)測信息。從圖中可以看出，凈化后的樣品本底干擾明顯降低，說明PRiME HLB 能有效去除樣品中的磷脂等非極性干擾物，同時提高了凈化效率，大大節(jié)省了前處理時間。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在牛奶空白提取液中添加標準溶液，配制一系列的標準工作液，以19 種QNs 與內標的一級質量數(shù)提取離子峰面積的比值為縱坐標（Y），各組分的濃度為橫坐標（X），做線性回歸方程，采用空白基質加標的方法確定方法的檢出限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantification，LOQ），信噪比RS/N≥3 和RS/N≥10 時，對應的質量濃度分別作為LOD 和定量LOQ。由表2結果可知，19 種QNs 在0.5～200 μg/L 質量濃度范圍內線性關系良好。檢出限為0.1～0.5 μg/kg，定量限為0.2～1.0 μg/kg，低于GB/T 20366-2006[27]和GB/T 21312-2007[28]。

圖3 不同提取溶劑對19 種喹諾酮類藥物回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of 19 quinolones

圖4 空白牛奶樣品的磷脂離子色譜圖Fig.4 Chromatograms of PC product ion in milk sample

表2 19 種QNs 的線性關系、檢出限、定量限Table 2 Linearity，LOD and LOQ of 19 quinolones

（續(xù)表2）

2.5 回收率和精密度

在空白牛奶樣品中添加19 種QNs 標準溶液進行加標回收率試驗，共添加3 個水平，每個水平重復6 次，加標回收率和精密度試驗結果見表3，添加水平0.2～10.0 μg/kg 時，方法的回收率范圍在62.1%～100.4%之間，相對標準偏差（Relative standard deviations，RSD）在0.13%～7.08%之間，回收率和精密度符合殘留分析方法的要求。

表3 19 種QNs 的回收率和RSDTable 3 Spiked recoveries and RSDs of the 19 quinolones

2.6 實際樣品檢測

采用本方法，對市售20 批次牛奶樣品進行檢測，采用一級精確質量數(shù)和保留時間對樣品中的QNs 定性篩查，并結合二級特征碎片離子確證，未檢出陽性樣品，與標準方法GB/T 20366-2006[27]和GB/T 21312-2007[28]的測定結果一致，然而本方法在檢測效率、檢測成本、靈敏度等方面優(yōu)于標準方法。

3 結論

本研究建立了UPLC/Q-Orbitrap 測定牛奶中19 種QNs 的方法，并進行了方法學驗證。牛奶樣品經(jīng)過酸化乙腈提取后，通過PRiME HLB 固相萃取柱凈化，該方法提高了檢測效率，降低了檢測成本，為牛奶中19 種QNs 的批量檢測提供技術支持，也可為其它基質中其它QNs 的快速檢測提供方法參考。