果香風味導向的庫德畢赤酵母FJZ的分離鑒定及生物學特性研究

賈麗艷，張 麗，李惠源，張順志

（1 山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 山西太谷030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷030801）

白酒（Baijiu）是世界七大蒸餾酒之一，主產(chǎn)于中國[1]。因地理位置和生產(chǎn)工藝不同，故白酒風格有所不同。根據(jù)風味物質(zhì)的不同，可將白酒主要分為清香型、濃香型、醬香型和其它香型白酒[2-3]。白酒風格的不同主要是由白酒中微量風味物質(zhì)組成及含量不同所致。引起白酒風味物質(zhì)不同的因素較多，包括釀造白酒的原料、工藝、環(huán)境、微生物等。微生物是白酒釀造的核心。在一定的環(huán)境和工藝條件下，不同微生物發(fā)酵產(chǎn)生的風味可賦予白酒不同的風格。在白酒發(fā)酵過程中，強化不同的微生物，可在一定程度上調(diào)控白酒風味，使白酒生產(chǎn)按照人為設計，從自然發(fā)酵向必然發(fā)酵方向發(fā)展。鑒于此，從自然環(huán)境中篩選能夠產(chǎn)生不同風味物質(zhì)的釀酒用功能性微生物，并研究其生物學特性，對于白酒可調(diào)控化發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。

本研究通過嗅聞和HS-SPME-GC-MS 檢測技術，從某酒廠的酒醅中獲得產(chǎn)濃郁果香風味的酵母；通過菌體菌落形態(tài)學觀察、生理生化及分子生物學試驗鑒定產(chǎn)香菌株，研究其生物學特性，旨在為白酒可調(diào)控化和智能化生產(chǎn)儲備優(yōu)質(zhì)菌種資源奠定理論及應用基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

新鮮酒醅：取自某清香型白酒廠。

1.2 原料

大米、黍米、小米等谷物均為市場購買。

1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，孟加拉紅0.03 g，氯霉素0.1 g，最終pH 7.2 ± 0.2，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 L。

YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 L。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：酵母膏1 g、葡萄糖0.5 g、醋酸鉀10 g，加蒸餾水至1 L。配制固體培養(yǎng)基時，添加2%瓊脂。

無碳培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g、KH2PO41 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.1 g、酵母膏0.2 g，加蒸餾水至1 L，調(diào)pH 值至6.5。配制固體培養(yǎng)基時，添加2%瓊酯。

發(fā)酵用固態(tài)培養(yǎng)基：將谷物去除雜質(zhì)，淘洗干凈，置于清水中浸泡2 d，蒸煮20 min，分裝在250 mL 的三角瓶中，按料液比1∶1.5 加入去離子水，混勻后，121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min。

1.4 儀器與設備

Trance1300 氣相儀、Trace ISQ 質(zhì)譜儀，美國默飛公司；ST3100/B 型酸度計、CP114 型分析天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；85-2 型恒溫磁力攪拌器，上海司樂電器有限公司；5804R 型離心機，德國Eppendorf 公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.5 方法

1.5.1 菌株的分離 將10 g 新鮮酒醅放入含90 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，28 ℃，120 r/min 振蕩30 min，形成原液。將原液10 倍倍比稀釋。取200 μL 稀釋液均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h。挑取培養(yǎng)基上肉眼可見的疑似酵母菌單菌落。在YPD 固體培養(yǎng)基上平板劃線，反復純化，獲得純菌株。

1.5.2 生香菌株的篩選 將已分離菌株分別接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，做嗅香試驗，篩選產(chǎn)生令人愉悅香氣的菌株。

1.5.3 香氣物質(zhì)的測定 將3%產(chǎn)香酵母接種于發(fā)酵用固態(tài)培養(yǎng)基中，28 ℃有氧發(fā)酵3 d，厭氧發(fā)酵5 d。以未接種的發(fā)酵用固態(tài)培養(yǎng)基為空白對照，通過鼻子聞香技術和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）檢測技術，確定待測菌株在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生風味物質(zhì)的能力。其中，鼻子嗅聞技術人員由5 位嗅覺靈敏且接受過感官評價培訓的試驗人員和國家級一級品酒師組成，男女比2∶3。HS-SPME-GC-MS 技術包括：1） 香氣成分的萃?。翰捎庙斂展滔辔⑤腿〖夹g，取8 mL 樣品于20 mL 進樣瓶中，加入2.5 g NaCl 混勻處理，60 ℃平衡20 min 后插入DVB/CAR/PDMS 萃取20 min，萃取完成后于250 ℃解吸附[4]；2）氣相色譜條件：色譜分析柱采用TG-5MS 非極性毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫：初溫40 ℃，恒溫3 min，以5 ℃/min 升溫至150 ℃；10 ℃/min 升溫至250 ℃，保持10 min；不分流進樣，進樣量1 μL；載氣高純He（99.999%），流速為1 mL/min；進樣口溫度250 ℃[4]；3）質(zhì)譜條件：接口溫度270 ℃；EI 電離源，離子源溫度250 ℃，電離電壓70 eV；質(zhì)量掃描范圍為45～650 u[5]。

1.5.4 揮發(fā)性香氣成分的分析 利用NIST MS Search Program v.2.0g（May 2011 release）譜庫檢索目標物質(zhì)；應用SIMCA 14.1 和SPSS 20 進行主成分分析，確定不同樣品之間香氣成分的相關性[5]。

1.6 產(chǎn)香菌株的鑒定

1） 形態(tài)學觀察 參照文獻[6-8]做菌落、菌體形態(tài)觀察；參照楊健等[9]的子囊孢子染色改進方法，染色觀察菌株子囊孢子；參照王正祥等[10]的方法，制備、觀察假菌絲。

2） 生理生化試驗 參照文獻[11]做碳源同化試驗：在無碳平板培養(yǎng)基中分別加入D-果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、淀粉、蔗糖，觀察菌株生長情況。

3） 26S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析 參考文獻[12]測定產(chǎn)香菌株26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列，做同源性序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 產(chǎn)香菌株生長曲線的測定

按3%的接種量將活化的產(chǎn)香菌株接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min 培養(yǎng)64 h，每隔4 h 測1 次OD600nm值，繪制生長曲線。

1.8 產(chǎn)香菌株的耐受性試驗

1） 滲透壓耐受性的測定 按3%的接種量將活化的產(chǎn)香菌株接種于葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為10%，20%，30%，40%，50%，60%的YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min 培養(yǎng)48 h，測定OD600nm值[13]。

2） 酒精耐受性的測定 按3%的接種量將活化的產(chǎn)香菌株接種于乙醇體積分數(shù)為0%，2%，4%，6%，8%，10%，12%，16%的YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min 培養(yǎng)48 h，測定OD600nm值[14]。

3） 酸堿耐受性的測定 按3%的接種量將活化的產(chǎn)香菌株接種于pH 值分別為1.5，2.0，2.5，3.0，10.5，11.5，12.5，13.5 的YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min 培養(yǎng)48 h，測定OD600nm值[15]。

4） 溫度耐受性的測定 按3%的接種量將活化的產(chǎn)香菌株接種于溫度分別為36，38，40，42，44，46 ℃的YPD 液體培養(yǎng)基中，120 r/min 培養(yǎng)48 h，測定OD600nm值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理由SPSS 20.0 軟件完成。利用Origin 8.0 軟件按平均值±標準差方式作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株的篩選

通過平板涂布、劃線分離和鼻子嗅聞技術，從新鮮的酒醅樣品中分離篩選出1 株產(chǎn)濃郁清香風味的酵母菌，初步命名為菌株FJZ。

2.2 菌株FJZ 產(chǎn)生的香氣及其成分確定

將菌株FJZ 接種于3 組不同發(fā)酵用固體培養(yǎng)基中，分別編號為試驗組A，C，E（簡稱A，C，E），并分別設空白對照組B，D，F(xiàn)（簡稱B，D，F(xiàn)）。聞香評價結(jié)果見表1。由表1可知，菌株FJZ 在大米、小米及黍米中發(fā)酵均可以產(chǎn)生清香風味，然而香氣令人愉悅程度不同，以小米為基質(zhì)產(chǎn)生的香氣最令人愉悅，清香濃郁，有輕盈的復合香氣；黍米次之，香氣復合，略有清香；大米產(chǎn)生的風味較差，雖清香濃郁，但有邪雜味。以上結(jié)果表明菌株FJZ產(chǎn)生的風味物質(zhì)不僅與菌種有關，而且與發(fā)酵基質(zhì)也有關系。

表1 聞香試驗結(jié)果Table 1 Results of smelling test

2.3 產(chǎn)香菌香氣成分分析

以空白組固體培養(yǎng)基為對照，采用HSSPME-GC-MS 聯(lián)用法測定不同試驗組的揮發(fā)性香氣物質(zhì)成分。通過峰面積歸一化法計算出各樣品中風味物質(zhì)的相對含量，并根據(jù)風味物質(zhì)類別分類，主要成分分析結(jié)果見表2。由表2可知，試驗組A 共檢測出27 種物質(zhì)，酯類4 種、醛類10種、酸類3 種、醇類3 種、酮類2 種、烷類1 種，相對含量較高的是乙酸乙酯（20.67%）、乙醛（10.68%）、乙醇（5.62%），推測乙酸乙酯是濃郁蘋果香風味物質(zhì)的來源；乙醛相對含量較高，其具有令人不愉悅的風味，這可能是嗅聞到邪雜氣味的原因之一；試驗組C 共檢測出25 種物質(zhì)，酯類5 種、醛類7 種、酸類1 種、醇類3 種、烷類2 種，相對含量較多的是乙酸乙酯（37.71%）、乙酸異丁酯（10.42%）、正己醛（8.49%）、乙醇（5.39%）；試驗組E 共檢測出29種物質(zhì)，其中，酯類3 種、醛類8 種、醇類8 種、酮類4 種、烷類1 種，相對含量較高的是正己醛（30.06%）、2-正戊基呋喃（17.12%）、乙酸乙酯（11.02%）、乙醇（3.94%），乙酸乙酯的相對含量試驗組A、C 較低。以上結(jié)果表明3 種谷物經(jīng)菌株FJZ 發(fā)酵后，均產(chǎn)生令人愉悅果香的清香風味物質(zhì)乙酸乙酯，且相對含量由大到小為：試驗組C＞試驗組A＞試驗組E。

2.4 香氣成分相關性分析結(jié)果

采用SPSS 軟件和SIMCA 對風味物質(zhì)的相關數(shù)據(jù)進行降維處理以及因子分析[16]。由圖1可知，試驗組A、C、E 的位置相對較近，空白組B、D、F的位置相對分散，表明3 種谷物本身的特征香氣具有一定差異，經(jīng)菌株FJZ 發(fā)酵后，香氣成分具有一定的相似性。

圖1 香氣成分的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of aromatic components

表2 揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 2 Volatile flavor compounds

2.5 菌株FJZ 的鑒定

2.5.1 菌株FJZ 的菌落、菌體形態(tài)及液體培養(yǎng)特性 生長初期，菌株FJZ 菌落形態(tài)為圓形、乳白色，無同心圓，無凸起，表面光滑不透明，邊緣規(guī)整；生長旺盛期，菌落形態(tài)為圓形、乳白色，有同心圓，有凸起，表面干燥不透明，表面及邊緣成菌絲狀，挑起成奶油狀，直徑5～7 mm（圖2a）。菌株FJZ在液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)時會在液體上層形成菌膜，菌液較混濁，培養(yǎng)1～3 d 時晃動有豐富的泡沫，菌液沉淀呈灰白色。菌株FJZ 剛接入YPD 液體培養(yǎng)基時，細胞形態(tài)大多是橢圓形單細胞（圖2b）；培養(yǎng)12 h 時，細胞多數(shù)呈桿狀（圖2c）；培養(yǎng)24 h 時，主要還是單細胞形態(tài)，然而有菌絲形成（圖2d）。菌株FJZ 在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，形成2 個分隔形子囊孢子，其子囊呈卵圓形（圖2e）。菌株FJZ 在YPD 培養(yǎng)基載片培養(yǎng)3 d，各細胞首尾相連，菌絲之間沒有橫隔，在分隔處縊縮，呈藕節(jié)狀（圖2f），表明該菌株產(chǎn)生假菌絲。

圖2 菌株FJZ 的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)Fig.2 Colony morphology and cell morphology of strain FJZ

2.5.2 碳源同化試驗 由表3可知，菌株FJZ 可利用D-果糖、葡萄糖；不能利用乳糖、蔗糖和淀粉。

2.5.3 分子生物學鑒定 菌株FJZ 26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列與庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii）具有很高的序列相似性，達到100%。以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為外群構建進化樹，結(jié)果顯示菌株FJZ 與庫德畢赤酵母各菌株的遺傳距離最近（圖3）。

表3 菌株FJZ 的碳源同化試驗Table 3 Carbon assimilation experiment of strain FJZ

圖3 菌株FJZ 26S rDNA 系統(tǒng)進化樹Fig.3 Evolution tree of 26S rDNA system on the strain FJZ

綜合菌落菌體特征、生理生化試驗及分子生物學鑒定，確定菌株FJZ 為庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii），命名為庫德畢赤酵母FJZ。

2.6 菌株FJZ 的生物學特性

2.6.1 菌株FJZ 生長曲線的構建 由圖4可知，培養(yǎng)0～14 h 期間，OD600nm值增長較緩慢，表明菌株FJZ 生長處于延滯期；培養(yǎng)14～24 h 期間，OD600nm值呈指數(shù)級增長，表明菌株處于對數(shù)生長期；培養(yǎng)24～56 h 期間，OD600nm值趨于不變，表明菌株生長處于穩(wěn)定期；培養(yǎng)56 h 后，OD600nm值逐漸降低，表明菌株FJZ 開始進入衰亡期。

2.6.2 菌株FJZ 的環(huán)境耐受性 圖5～8 為菌株FJZ 的環(huán)境耐受性。由圖5可知，菌株FJZ 具有良好的糖耐受性，葡萄糖質(zhì)量分數(shù)在10%～50%之間，OD600nm值先增后減；葡萄糖質(zhì)量分數(shù)在20%時，OD600nm值達到最大，表明該菌株最適葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為20%；菌株FJZ 在葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為50%的培養(yǎng)液中仍可以生長，表明菌株FJZ 具有高耐糖特性，可應用于含糖濃度較高的發(fā)酵生產(chǎn)中。由圖6可知，乙醇體積分數(shù)為0%～16%之間，OD600nm值先增后減；當乙醇體積分數(shù)為6%時，OD600nm達到最大值；當乙醇體積分數(shù)為16%時，OD600nm值趨于0，表明菌株趨近不生長狀態(tài)。由圖7可知，在pH 1.5～13.0 之間，菌株FJZ 的OD600nm值先增后減；在pH 2.5～10.5 之間，菌株FJZ 的生長趨勢較好，表明菌株FJZ 的耐酸能力較強。由圖8可知，當培養(yǎng)溫度為36～46 ℃時，菌株FJZ 的OD600nm值不斷減小；當溫度為46 ℃時，OD600nm值達到最小值，表明菌株FJZ 趨近不生長狀態(tài)。

圖4 菌株FJZ 的生長曲線Fig.4 The growth curve of strain FJZ

圖5 菌株FJZ 的糖耐受性Fig.5 Tolerance on sugar of strain FJZ

圖6 菌株FJZ 的乙醇耐受性Fig.6 Tolerance on alcohol of strain FJZ

圖7 菌株FJZ 的酸耐受性Fig.7 Tolerance on acid of strain FJZ

圖8 菌株FJZ 的溫度耐受性Fig.8 Tolerance on temperature of strain FJZ

3 結(jié)論

通過聞香試驗和HS-SPME-GC-MS 技術，篩選獲得1 株能夠產(chǎn)生濃郁蘋果香風味的菌株；該菌株可在小米中產(chǎn)生濃郁的蘋果清香風味，主要風味物質(zhì)為乙酸乙酯。通過菌落和菌體形態(tài)觀察、生理生化及分子生物學試驗確定菌株FJZ 為庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii），命名為庫德畢赤酵母FJZ。同時該菌有較強的耐滲透壓、酸和乙醇的能力，最適生長葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為20%，乙醇體積分數(shù)為6%。以上研究為該菌株在風味導向的白酒及其它釀造類食品中的應用，奠定了理論和應用基礎。