海參低溫貯藏過(guò)程中品質(zhì)與理化性質(zhì)的變化

白 穎，馮丁丁，浦 源，申 平，時(shí)逸馨，奚 倩，董秀芳，啟 航*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 2 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連116034 3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新疆阿拉爾843300）

海參（Stichopus japonicus）是一種重要的海洋棘皮類(lèi)動(dòng)物，其體壁上含多種活性物質(zhì)，如海參多糖和膠原蛋白等成分，具有多種生理及藥理活性，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高、具有保健作用的食品[1-3]。2018年我國(guó)的海參產(chǎn)量達(dá)到17.4 萬(wàn)t[4]。海參自身的內(nèi)源酶使其具有較強(qiáng)的自溶現(xiàn)象，在貯藏過(guò)程中容易發(fā)生品質(zhì)劣變，使得質(zhì)構(gòu)改變，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。

近年來(lái)，內(nèi)源酶中的組織蛋白酶（Cathepsin）家族和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族成為研究重點(diǎn)。組織蛋白酶-L（Cathepsin-L）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）對(duì)于肉制品的品質(zhì)變化有重要影響。2010年，F(xiàn)ontanesi 等[5]研究發(fā)現(xiàn)意大利白豬肉的品質(zhì)與Cathepsin-L 和Cathepsin-S 相關(guān)聯(lián)，這兩種內(nèi)源酶會(huì)對(duì)肉的嫩度、彈性產(chǎn)生影響。2011年，Huang 等[6]以雞肌為原料提取肌原纖維蛋白，在25 ℃條件下，用EDTA 或EGTA 加Caspase-3 培養(yǎng)液培養(yǎng)16 h 后，檢測(cè)肌肉蛋白降解和肌原纖維的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激活的Caspase-3能降解雞肉肌原纖維蛋白，并破壞肌原纖維的結(jié)構(gòu)。海參因含有豐富的內(nèi)源酶而具有較強(qiáng)的自溶能力[7]，因此對(duì)海參中內(nèi)源酶的研究十分必要。

本研究以海參為原材料，考察其在4 ℃長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中理化性質(zhì)的變化。通過(guò)可溶性膠原蛋白含量、硬度、咀嚼度、蛋白質(zhì)降解、組織蛋白酶-L活性、Caspase-3 活性、結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量及自由基的生成等指標(biāo)變化，從自由基層面、分子蛋白層面揭示海參品質(zhì)的變化，為海參貯藏、保鮮提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料 鮮活的海參（Stichopus japonicus），質(zhì)量約（140±10）g，大連市劉家橋市場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 Ac-DEVD-PNA、3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、苯甲基磺酰氟（PMSF），美國(guó)Sigma 公司；四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚丙烯酰胺（Acry）、過(guò)硫酸銨（APS）、二硫蘇糖醇（DTT）、抑肽酶（Aprotinin）、亮抑肽酶（Leupeptin），上海生工生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA），生工生物工程（上海）股份有限公司；β-actin 抗體，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 主要儀器及設(shè)備

TA.XT.plus 物性測(cè)試儀，英國(guó)SMS 公司；AE-6500 垂直電泳槽、AE-8135 電泳儀電源，日本ATTO 公司；MF-ChemiBIS 2.0 凝膠成像儀，以色列DNR 公司；ZKBTES-55 型真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Virtis 公司；A200 型電子自旋共振波譜儀（ESR），德國(guó)BRUKER 公司；T25 數(shù)顯勻漿機(jī)，德國(guó)IKA 集團(tuán)；170-3940 半干轉(zhuǎn)印槽，美國(guó)Bio-RAD 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 將20 只新鮮的海參宰殺去臟、去筋，分割成塊，每3～5 塊分裝于玻璃皿中置于4 ℃冰箱，分別放置1，5，10，15，25，30，60 d，沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何處理的新鮮海參作為對(duì)照，-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。另外，將預(yù)處理好的整只海參于相同條件下拍照，記錄其形態(tài)變化。

1.3.2 可溶性膠原蛋白含量的測(cè)定 稱(chēng)取不同處理時(shí)間的海參各10 g，加入10 mL 蒸餾水，置于80 ℃水浴鍋中水浴2 h（每隔30 min 搖勻1 次），于1 500×g 離心30 min，所得上清液用濾紙過(guò)濾，取0.5 mL 濾液加入水解管中，再加3 mL 3.5 mol/L 硫酸，于105 ℃烘箱中水解16 h，取出冷卻至室溫，加水定容至5 mL，混勻，取1 mL 上述溶液過(guò)濾，然后加入1 mL 3 mol/L 的NaOH 溶液，混勻，取0.5 mL 置于1.5 mL EP 管內(nèi)，加入0.25 mL 氧化液（含50 mmol/L 氯胺T 水合物，156 mmol/L檸檬酸，375 mmol/L NaOH，661 mmol/L 乙酸鈉，29%（體積分?jǐn)?shù)）異丙醇，pH 6），混勻。室溫放置20 min 后，加入0.25 mL 顯色液〔含246 mmol/L對(duì)二甲氨基苯甲醛，35%（體積分?jǐn)?shù)） 高氯酸，65%（體積分?jǐn)?shù)）異丙醇〕，混勻后用錫紙包好置于60℃放置15 min，再用流水冷卻3 min，取200 μL用酶標(biāo)儀測(cè)定558 nm 波長(zhǎng)下的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0721x+0.0591，R2=0.999）求含量。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 不同處理時(shí)間的海參各取3～5 塊（約1.5 cm×1.5 cm）進(jìn)行TPA（Texture profile analysis）分析。樣品置于測(cè)試平臺(tái)上，于室溫下測(cè)定。TPA 測(cè)試探頭為P/50。測(cè)試條件：測(cè)前速率、測(cè)試速率與測(cè)后速率均為1 mm/s；壓縮程度70%；停留間隔5 s；觸發(fā)值5 g。

1.3.4 蛋白降解情況的測(cè)定 取不同處理時(shí)間的海參體壁組織適量，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%的比例加入裂解液（含20 mmol/L pH 7.4 的Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L DTT，1%Triton X-100，0.1%SDS），冰浴條件下研磨，提取全蛋白，然后4 ℃，12 000×g 條件下離心15 min。根據(jù)樣品的蛋白質(zhì)濃度用SDSPAGE 的5×上樣緩沖液（含0.25mol/L pH 7.5 的Tris-HCl，8 mol/L 尿素，5%SDS，5%β-巰基乙醇）按一定比例稀釋?zhuān)兴≈? min，冷卻后離心。使用5%濃縮膠和10%分離膠跑電泳。電泳結(jié)束后將凝膠取出，切膠，用考馬斯亮藍(lán)R-250 染液染色過(guò)夜。脫色液脫色約1 h，倒入一半脫色液和一半水，脫色1 h，最后用凝膠成像儀的可見(jiàn)光成像系統(tǒng)成像。

1.3.5 組織蛋白酶-L（CL）活力的測(cè)定 取不同處理時(shí)間的海參體壁組織適量，按照1∶3 的質(zhì)量比加入提取液（含50 mmol/L pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液，1 mmol/L EDTA，0.1%Triton X-100），冰浴條件下研磨，然后離心10 min（4 ℃，10 000×g），上清液即為待測(cè)樣液。取待測(cè)樣液50 μL，加入反應(yīng)緩沖液（340 mmol/L 乙酸鈉，60 mmol/L 乙酸，4 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，8 mmol/L DTT）25 μL和20 μmol/L 底物（Z-Phe-Arg-Mec）25 μL，混勻后37 ℃水浴15 min；設(shè)置空白對(duì)照組，取待測(cè)樣液50 μL，加入100 μL 終止液（含0.1 mol/L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液，0.1 mol/L 氯乙酸） 和25 μL 20 μmol/L 底物，同樣混勻后37 ℃水浴15 min；之后加100 μL 終止液于樣品組終止反應(yīng)，加25 μL 反應(yīng)緩沖液于空白對(duì)照組，用熒光分光光度計(jì)（激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm）測(cè)定酶活力。以每mg 蛋白熒光值的差值比較組間CL 活力的變化。

1.3.6 Caspase-3 活力的測(cè)定 不同處理時(shí)間的海參體壁組織適量，將其與Caspase-3 提取液（含25 mmol/L pH 7.4 的HEPES，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，5 mmol/L DTT，1 μmol/L 胃蛋白酶抑制劑，1 mmol/L PMSF） 按1∶3的質(zhì)量比添加，冰浴條件下研磨，離心15 min（4℃，10 000 r/min），獲得的上清液即所需酶液。在酶標(biāo)板中加入10 μL 待測(cè)酶液，80 μL 分析液（含20 mmol/L pH 7.4 的HEPES，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L DTT，1%CHAPS）和10 μL 底物（Ac-DEVD-PNA），對(duì)照組加入10 μL 待測(cè)酶液和90 μL 分析液，于37 ℃條件下，分別反應(yīng)0 min 和30 min，并測(cè)定405 nm 波長(zhǎng)處的吸光值。

1.3.7 Western 免疫印跡 取不同處理時(shí)間的海參體壁組織適量，按照1∶3 的質(zhì)量比加入裂解液（含20 mmol/L pH 7.4 的Tris-HCl，2 mmol/L EGTA，2 mmol/L EDTA-2Na，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，0.1%SDS，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NaVO3，10 mmol/L NaF，10 μg/mL 抑肽酶，10 μg/mL 亮肽酶，1 mmol/L PMSF），冰浴條件下研磨，離心15 min（4 ℃，12 000×g），取上清液做SDS-PAGE 測(cè)定，結(jié)束后，組裝轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（需排氣泡），于10 V 恒壓條件下轉(zhuǎn)印35 min，轉(zhuǎn)印后進(jìn)行肌動(dòng)蛋白（Actin）的一抗孵育，清洗，二抗孵育及顯色反應(yīng)。

1.3.8 自由基的測(cè)定 將低溫處理后的海參直接凍干，制備凍干粉，然后將其填入石英樣品管中，保證每個(gè)樣品的填充量一致。通過(guò)ESR 檢測(cè)自由基生成情況，檢測(cè)條件：微波功率6.10 mW，中心磁場(chǎng)3.460 G，轉(zhuǎn)換時(shí)間480 ms，掃描寬度200 G，調(diào)制幅度1 G，調(diào)制頻率100 kHz，時(shí)間常數(shù)5 242.88 ms。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以3 個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值表示，并且計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差；用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參形態(tài)的變化

海參在4 ℃處理?xiàng)l件下的形態(tài)變化如圖1所示，處理1 d 時(shí)，海參體型明顯增大；處理5 d 時(shí)，海參繼續(xù)向外延伸，而形態(tài)完整。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，海參體壁開(kāi)始鼓泡，出現(xiàn)化皮現(xiàn)象，癱軟變得明顯，海參體壁上的刺不斷分解。處理20 d 時(shí)，海參已經(jīng)鋪滿(mǎn)整個(gè)平皿，海參體壁內(nèi)皮組織向外翻，可明顯看到白色內(nèi)皮組織。20～25 d 處理期間，海參體壁組織變化不顯著，化皮現(xiàn)象有輕微加重。30 d 之后的海參嚴(yán)重?fù)p傷，已經(jīng)失去完整形態(tài)，刺完全消失，表皮變黏。

圖1 在4 ℃貯藏條件下海參形態(tài)的變化Fig.1 Morphological changes of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.2 可溶性膠原蛋白含量的變化

海參在4 ℃處理下的可溶性膠原蛋白含量變化如圖2所示。可溶性膠原蛋白含量在前5 d 變化不顯著，與圖1海參形態(tài)的結(jié)果相符，海參在前期體壁保留完好，膠原蛋白未發(fā)生明顯水解。隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，海參的可溶性膠原蛋白含量增加顯著（P＜0.05），之后呈不斷上升趨勢(shì)，表明海參膠原蛋白在不斷水解。處理60 d 時(shí)，可溶性膠原蛋白含量已經(jīng)達(dá)到（19.42 ± 0.82）mg/g，是對(duì)照組含量的5.53 倍。這與Zhu 等[8]研究鮑魚(yú)肌肉的可溶性膠原蛋白含量變化趨勢(shì)具有一定的相似性?？扇苄阅z原蛋白是膠原蛋白的一部分，是肌肉組織經(jīng)加熱或酶解后分解并溶于水的膠原[9]。

圖2 海參在4 ℃貯藏條件下可溶性膠原蛋白含量的變化Fig.2 Soluble collagen content change of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.3 質(zhì)構(gòu)的變化

海參自身的酶解和微生物作用使其變得更加柔軟，彈性下降。海參的硬度、彈性、凝聚性、咀嚼性等與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。海參在4 ℃處理下的硬度及其咀嚼性變化如圖3所示。前5 d，海參的硬度變化不顯著；15～25 d 時(shí)，硬度下降顯著（P＜0.05）；25 d 時(shí)，硬度已經(jīng)降到（3 301.7±253.1）g，比對(duì)照組的硬度下降約9 倍多，比較海參在4 ℃處理?xiàng)l件下的形態(tài)變化（圖1）發(fā)現(xiàn)處理25 d 時(shí)的海參損傷較為嚴(yán)重，表明低溫處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)海參造成了負(fù)面影響。2015年，Lu 等[10]發(fā)現(xiàn)在4 ℃低溫條件下處理后的魚(yú)片硬度呈先增大后下降的趨勢(shì)，與本試驗(yàn)結(jié)果呈相似的趨勢(shì)。海參在4 ℃條件下的咀嚼性變化與硬度變化趨勢(shì)略有不同，在處理15 d 之前，咀嚼性的變化均不顯著，之后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，咀嚼性在15～25 d 時(shí)，與處理初期相比，明顯下降（P＜0.05），25 d 時(shí)，咀嚼性下降至（516.7±160.8）g，為未處理海參咀嚼性的4.6%，硬度和咀嚼性均在處理1 d 時(shí)出現(xiàn)最高值，而與未處理海參比均不顯著，總體呈先增大后減小的變化趨勢(shì)。此結(jié)果表明硬度和咀嚼性不是隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，存在變硬過(guò)程，而后逐漸下降。

2.4 蛋白質(zhì)的降解情況

海參在4 ℃處理?xiàng)l件下的蛋白變化如圖4所示。前10 d 蛋白質(zhì)變化不明顯，處理15 d 時(shí)，200 ku 蛋白條帶下面顏色加深，表明大分子蛋白開(kāi)始出現(xiàn)降解，30 d 和60 d 時(shí)肌動(dòng)蛋白條帶完全消失，其它蛋白條帶與對(duì)照組相比減少很多，表明在低溫處理30 d 后，海參體壁組織結(jié)構(gòu)幾乎完全喪失，蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯降解。這與Christensen等[11]發(fā)現(xiàn)鯡魚(yú)和Thavaroj 等[12]研究發(fā)現(xiàn)的鯰魚(yú)和羅非魚(yú)經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間低溫處理后，其肌動(dòng)蛋白會(huì)發(fā)生降解的結(jié)果相符。因此，海參長(zhǎng)時(shí)間低溫處理會(huì)引起蛋白質(zhì)降解。

2.5 組織蛋白酶-L 活力的變化

海參在4 ℃貯藏條件下的酶活力變化如圖5所示。整個(gè)處理期間，酶活力變化呈先升高到最大值后逐漸下降的趨勢(shì)；處理15 d 時(shí)，組織蛋白酶-L 的酶活力雖有升高，但基本保持在較穩(wěn)定的水平；處理20 d 時(shí)，組織蛋白酶-L 活力達(dá)到最大值（3 170.5±244.3） U/mg 蛋白（P＜0.05）；隨后組織蛋白酶-L 活力開(kāi)始下降，貯藏30 d 時(shí)降低至原來(lái)水平。2014年，Ge 等[13]報(bào)道組織蛋白酶-L 會(huì)間接影響蛋白降解。而本研究中組織蛋白酶-L沒(méi)被激活前，從圖4中未觀察到蛋白降解，這也驗(yàn)證了組織蛋白酶-L 與蛋白降解有關(guān)。

圖3 海參在4 ℃貯藏條件下質(zhì)構(gòu)的變化Fig.3 Changes in texture of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.6 Caspase-3 活力的變化

海參在4 ℃處理下的Caspase-3 活力變化如圖6所示。前期Caspase-3 未被激活，處理5 d仍保持較低活力；隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力開(kāi)始升高，到25 d 時(shí)Caspase-3 的相對(duì)活力達(dá)到初始酶活力的2.53 倍（P＜0.05），之后酶活力顯著下降，而Caspase-3 的酶活力變化與內(nèi)源酶中的組織蛋白酶-L 有一定的關(guān)聯(lián)性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。

圖4 海參在4 ℃貯藏條件下的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE pattern of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

圖5 海參在4 ℃貯藏條件下組織蛋白酶-L 活力變化Fig.5 Changes in the activity of cathepsin-L of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

圖6 海參在4 ℃貯藏條件下caspase-3 活力變化Fig.6 Changes in the activity of caspase-3 of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.7 β-actin 表達(dá)量的變化

海參在4 ℃處理下的β-actin 蛋白表達(dá)量的情況如圖7所示。β-actin 蛋白信號(hào)隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸降低的趨勢(shì)，且在30～60 d 消失，與圖4的電泳結(jié)果相符，同樣表明蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯降解。

2.8 ROS 生成量的變化

海參在4 ℃處理下的自由基生成情況如圖8所示。ROS 信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)，呈先上升后下降的趨勢(shì)，于20 d 時(shí)達(dá)到最大值（1.08×105），約是對(duì)照組自由基生成量的2.3 倍（P＜0.05）。ROS 可修飾蛋白質(zhì)骨架肽鏈和氨基酸側(cè)鏈，以改變蛋白的交聯(lián)或降解，決定產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、顏色及蛋白質(zhì)的組成，使正常蛋白質(zhì)活性增強(qiáng)或減弱[14]。從上述結(jié)果可以看出，低溫處理過(guò)程中，氧自由基顯著提高，發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，而當(dāng)ROS 的生成量增加到一定程度時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大影響，使產(chǎn)品品質(zhì)發(fā)生改變。

圖7 海參在4 ℃貯藏條件下蛋白表達(dá)量的情況Fig.7 Protein expression in sea cucumber at 4 ℃storage conditions

3 結(jié)論

隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，海參質(zhì)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生改變，其中包括形態(tài)變化，質(zhì)構(gòu)變化（咀嚼度和硬度），內(nèi)源酶活化，膠原溶出，蛋白降解。海參經(jīng)低溫處理后，將會(huì)產(chǎn)生ROS 并大量積累，使內(nèi)源酶被激活，如Cathepsin-L 及Caspase-3，內(nèi)源酶活力的升高使得后期蛋白質(zhì)發(fā)生降解以及膠原溶出，最終使海參質(zhì)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生改變。

圖8 海參在4 ℃貯藏下自由基生成情況Fig.8 Free radical production in sea cucumber at 4 ℃storage conditions