主動自發(fā)氣調(diào)對枝孢菌的抑制效果

張玉笑，劉莎莎，王 亮，陳 勇，員麗蘋，張新華，郭衍銀

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院 山東淄博255049）

枝孢菌（Cladosporium link）是廣泛存在于自然界的一類真菌，可侵染植物葉片和根莖，造成果蔬及糧食作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降[1-2]。同時，枝孢菌也是蘋果、生菜、獼猴桃、草莓等果蔬采后腐爛的主要致病菌，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。此外，枝孢霉還對人體健康產(chǎn)生威脅[5]。

針對真菌病害控制，國內(nèi)外學(xué)者做了大量研究，如通過復(fù)配精油、臭氧、氣調(diào)、化學(xué)殺菌劑、拮抗菌、植物提取液、溫濕度調(diào)節(jié)等手段來抑制真菌的活性和繁殖能力，降低真菌病害的發(fā)生[6-8]。氣調(diào)是當(dāng)今果蔬保鮮中較為有效的方法之一，其通過改變貯藏環(huán)境內(nèi)氣體比例并結(jié)合溫、濕度，來降低果蔬營養(yǎng)物質(zhì)消耗并抑制病原菌，以延長果蔬保鮮期，具有無毒、高效、天然的特點[9]。

目前氣調(diào)保鮮多采用低O2、高CO2的氣體配比，雖然能在一定程度上抑制果蔬生理生化活動，減少能量消耗，但易出現(xiàn)異味，CO2傷害等現(xiàn)象[10]。本課題組前期研究表明，高O2配合高CO2保鮮有很好的協(xié)同作用，一方面通過高CO2降低果蔬的呼吸速率以延長果蔬貯藏期，另一方面通過高O2來緩解果蔬受到高CO2的傷害，提高果蔬的貯藏品質(zhì)[11]，目前已成功應(yīng)用于西蘭花和生姜的采后貯藏，取得了較好的保鮮效果[12-13]。然而，針對O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)的抑菌效果尚未深入研究。

為此，本試驗采用O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)處理枝孢菌，通過定期測定枝孢菌的生長情況、菌株細(xì)胞膜透性、活性氧防御酶及細(xì)胞壁降解酶活性等指標(biāo)，探討O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)的抑菌效果，為其在果蔬采后枝孢菌及其它微生物病害的防治方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌從貯藏期內(nèi)發(fā)病的獼猴桃上分離、純化，經(jīng)山東泓迅生物科技有限公司鑒定，Blast 比對分析，確定為枝孢菌菌株（Cladosporium link）。

瓊脂、磷酸氫二鈉、羧甲基纖維素鈉、磷酸二氫鈉、果膠，天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、乙二胺四乙酸（EDTA），天津市化學(xué)試劑研究所；乙酸、檸檬酸、無水乙醇、過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、乙酸鈉、檸檬酸鈉，煙臺市雙雙化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、濃鹽酸、亞硫酸鈉，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；苯酚、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉，萊陽市康德化工有限公司。所用試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

GXZ-260B 光照生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；UV-1750 紫外可見分光光度計，島津國際貿(mào)易有限公司；MR-07825-00 O2/CO2測定儀，美國FBI Dansensor 公司；XW-80A 渦旋混合器，上海青浦滬西儀器廠；DDS-307A 電導(dǎo)率儀，上海精科雷磁儀器；XS-212-20 光學(xué)顯微鏡，蘇州勝視電子設(shè)備有限公司；S-50HD 立式自動電熱壓力滅菌鍋，濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；GL-20G-2 臺式高速冷凍離心機(jī)，上海安亭儀器制造廠；RDL380P氣調(diào)包裝機(jī)，羅迪博爾機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

將經(jīng)3 次活化后的枝孢菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，制取濃度為106CFU/mL 的孢子懸浮液，以5 μL 的接種量接種于培養(yǎng)皿中心（直徑9 cm），晾干后裝入氣調(diào)袋。然后向氣調(diào)袋內(nèi)分別充入體積為5 L 的60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和自然空氣（ck），置于生化培養(yǎng)箱（28±0.5）℃培養(yǎng)，每隔2 d 測定相關(guān)指標(biāo)。每個處理設(shè)置10 個氣調(diào)袋，每個氣調(diào)袋內(nèi)放置4個培養(yǎng)皿。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 菌落形態(tài)觀察及直徑測定 在培養(yǎng)皿內(nèi)直接觀察菌落形態(tài)，并使用十字交叉法[14]測量菌落直徑，重復(fù)3 次。

1.4.2 微觀結(jié)構(gòu)觀察 在菌落邊緣挑取菌絲固定在載玻片中央，然后直接在400×光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 孢子量的測定 在菌落邊緣用打孔器（直徑6 mm）隨機(jī)取3 個菌碟，置于已加入15 mL 蒸餾水的離心管中，渦旋混合器振蕩10 min，然后使用2 層紗布過濾并沖洗2 次，顯微鏡下計數(shù)，并計算整個菌落面積的孢子總數(shù)。

1.4.4 菌株細(xì)胞內(nèi)容物釋放量的測定 用打孔器在菌落邊緣隨機(jī)打3 個菌碟，置于0.05 mol/L，pH 7.2 的磷酸鈉緩沖液中，超聲波破壁15 min 后，4 000 r/min 離心10 min，上清液在波長260 nm 下測定吸光值[15]。

1.4.5 菌細(xì)胞電導(dǎo)率的測定 上清液的獲取同1.4.4 節(jié)的方法，使用電導(dǎo)率儀直接測定電導(dǎo)率。

1.4.6 處理后枝孢霉后續(xù)生長曲線的測定 取2 mL 氣調(diào)處理8 d 的枝孢菌孢子懸浮液（制取步驟同1.4.3 節(jié)的方法）與18 mL PDB 培養(yǎng)液混合，于28 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)，每隔4 h 或6 h 取樣，抽濾后在60 ℃下將菌絲體烘干并稱重[16]。

1.4.7 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定 孢子懸浮液的制取同1.4.3 節(jié)的方法（預(yù)冷的0.2 mol/L，pH 7.8 的磷酸鈉緩沖液代替蒸餾水），并將孢子濃度稀釋至106CFU/mL，然后吸取8 mL 菌液于10 mL 離心管，冰浴超聲波破壁15 min 后，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，取上清液作為粗酶液。通過鄰苯三酚自氧化法[17]測定SOD 活性，25 ℃下降低鄰苯三酚自氧化速率50%所需要的量為1 個酶活力單位（U）。

1.4.8 過氧化氫酶（CAT）活性的測定 粗酶液的制取同1.4.7 節(jié)的方法（緩沖液使用0.2 mol/L，pH 7.0 的磷酸鈉）。采用過氧化氫分解法[18]測定CAT活性，將吸光值每秒鐘改變0.001 定義為1 個酶活力單位（U）。

1.4.9 多聚半乳糖醛酸酶（PG）和多聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性的測定 取8 mL 濃度為106CFU/mL 的孢子懸浮液（制取步驟同1.4.3 節(jié)的方法），超聲波冰浴破壁15 min 后，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。PMG 和PG 活性的測定分別用果膠酸鈉和果膠作為底物，采用DNS 顯色法在波長540 nm 處測定吸光度[19]。將50 ℃下每分鐘內(nèi)每毫升酶液分解底物時釋放1 μg 還原糖所需要的酶量定義為1 個酶活力單位（U）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行LSD 顯著性分析及相關(guān)性分析（P＜0.05），并用Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 O2/CO2 主動自發(fā)氣調(diào)對枝孢菌菌落形態(tài)的影響

由圖1所示，氣調(diào)處理對枝孢菌的菌落形態(tài)有顯著影響。隨著CO2濃度的升高，枝孢菌的菌落直徑和孢子量逐漸減少，菌落顏色逐漸變淺，與ck 處理形成鮮明對比。ck 處理菌絲生長旺盛且分布均勻，色素呈黃色或淺綠色，菌落邊緣較為整齊；而處理組菌絲生長較慢，菌絲分布不均，且色素顏色較淺，菌落直徑逐漸變小且菌落邊緣不整齊。在6 d 時，60%O2+40%CO2處理剛開始長出白色菌絲，尚未出現(xiàn)孢子；在12 d 時，雖然已出現(xiàn)孢子，但仍未擴(kuò)展到整個菌落。

圖1 枝孢菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Cladosporium link

2.2 O2/CO2 主動自發(fā)氣調(diào)對枝孢菌微觀形態(tài)的影響

不同O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)對枝孢菌微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響（圖2）。CK 處理菌絲粗細(xì)均勻，表面光滑；90%O2+10%CO2處理菌絲表面平整，而菌絲內(nèi)出現(xiàn)隔膜；80%O2+20%CO2處理菌絲內(nèi)部出現(xiàn)隔膜以及空腔；70%O2+30%CO2處理菌絲表面凹凸不平，且隔膜處菌絲膨脹，中空嚴(yán)重；60%O2+40%CO2處理菌絲表面粗糙，菌絲出現(xiàn)分支，內(nèi)部隔膜與空腔增多。

圖2 12 d 時枝孢菌在400×顯微鏡下的微觀形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of Cladosporium link under 400× microscope at 12 d

2.3 O2/CO2 主動自發(fā)氣調(diào)對菌落直徑和孢子量的影響

隨著處理時間的延長，各處理的菌落直徑與孢子量均呈上升趨勢，而10 d 后增長趨勢有所減緩（圖3）。孢子生成速率與菌落擴(kuò)展速率隨CO2濃度的升高而降低，70%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2處理分別在4 d 和6 d 時菌落才開始擴(kuò)展并出現(xiàn)孢子，10 d 后增長速率趨于平緩。12 d 時ck、90%O2+10%CO2、80%O2+20%CO270%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2處理的孢子量和菌落直徑分別為145.03×106，89.99×106，74.68×106，47.63×106，31.37×106個和4.68，3.29，2.63，2.05，1.58 cm，且差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.4 O2/CO2 主動自發(fā)氣調(diào)對孢子電導(dǎo)率和內(nèi)容物釋放量的影響

隨著處理時間的延長，各處理枝孢菌的電導(dǎo)率均呈上升趨勢（圖4a）。ck 處理初期增速較快，8 d 后趨于平穩(wěn)；70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2和90%O2+10%CO2處理在10 d 后達(dá)到平衡；而60%O2+40%CO2處理初期迅速增加，10 d 后仍未進(jìn)入穩(wěn)定期，表明高CO2對枝孢菌的細(xì)胞膜通透性造成了嚴(yán)重的破壞。就整體而言，各處理組電導(dǎo)率隨CO2濃度的升高而增大。

在整個處理期間，各處理枝孢菌的孢子內(nèi)容物釋放量都呈上升趨勢，且在不同的時間進(jìn)入平衡期（圖4b）。80%O2+20%CO2、90%O210%CO2和ck 處理前期迅速增加，8 d 時基本達(dá)到平衡；而60%O2+40%CO2和70%O2+30%CO2處理孢子產(chǎn)生時間較晚，而初始內(nèi)容物釋放量及增長速率顯著高于其余各組。12 d 時ck、90%O2+10%CO2、80%O2+20%CO2、70%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2處理的吸光值分別為0.192，0.201，0.213，0.235 和0.243。

圖3 不同處理對菌落直徑（a）、孢子量（b）的影響Fig.3 Effects of different treatments on colony diameter（a） and spore amount（b）

圖4 不同處理對電導(dǎo)率（a）、內(nèi)容物釋放（b）的影響Fig.4 Effects of different treatments on conductivity（a） and content release（b）

2.5 O2/CO2 主動自發(fā)氣調(diào)對枝孢菌后續(xù)生長曲線的影響

為研究O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)對枝孢菌生長能力的影響，對處理8 d 的枝孢菌生長曲線進(jìn)行了測定（圖5）。在整個培養(yǎng)過程中，所有處理的生長曲線基本呈S 型增加，初期緩慢增加，然后迅速增加，最后進(jìn)入穩(wěn)定期。ck 處理的菌絲干重顯著高于其余處理組（P＜0.05），且在22 h 時進(jìn)入對數(shù)期，而70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2和90%O2+10%CO2處理在26 h 進(jìn)入對數(shù)期，60%O2+40%CO2處理在32 h 進(jìn)入對數(shù)期，表明O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)處理延緩了枝孢菌的后續(xù)生長能力。68 h 時60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和ck 處理的菌絲干重分別為35.1，52.4，57.5，64.8，91.2 mg。

圖5 不同處理對枝孢菌后續(xù)生長曲線的影響Fig.5 Effects of different treatments on subsequent growth curve of Cladosporium link

2.6 O2/CO2 主動自發(fā)氣調(diào)對SOD 和CAT 活性的影響

SOD 和CAT 是清除生物機(jī)體自由基的關(guān)鍵酶，就總體而言，隨著CO2濃度的增加，各處理SOD 和CAT 活性逐漸降低（圖6）。在12 d 時，60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和ck 處理SOD 平均活性分別為1 145，1 630，1 878，2 038，2 649 U，說明高CO2降低了枝孢菌的活性氧清除能力。

2.7 O2/CO2 主動自發(fā)氣調(diào)對PG 和PMG 活性的影響

在整個處理過程中，PG 和PMG 活性基本呈下降趨勢，且隨CO2濃度的增加而降低（圖7）。整個貯藏期間，ck、90%O2+10%CO2、80%O2+20%CO2、70%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2處理的PG 和PMG 的平均活性分別為2.25，1.64，1.13，1.01，0.88 U 和0.83，0.58，0.49，0.37，0.30 U，表明高CO2可以抑制PG 和PMG 的活性，降低枝孢菌的致病性。

圖6 不同處理對SOD（a）和CAT（b）活性的影響Fig.6 Effects of different treatments on SOD（a） and CAT（b） activities

圖7 不同處理對枝孢菌PG（a）和PMG（b）的影響Fig.7 Effects of different treatments on PG（a） and PMG（b） activities of Cladosporium

3 討論

研究指出，氣調(diào)處理能有效減輕果蔬采后病害的發(fā)生[20]，如10%O2+10%CO2氣調(diào)處理能顯著降低拮抗酵母對甜櫻桃青霉病和黑斑病的發(fā)生[21]；7.5%～30%CO2和1.5%O2能夠顯著降低芹菜的腐爛，1%或2%O2結(jié)合2%或4%CO2可明顯抑制芹菜黑徑病的危害[22]。本研究采用O2/CO2氣體處理方式，顯著降低了枝孢菌的活力和再生長能力，并降低其致病能力，表現(xiàn)出很好的抑菌效果。

Amanatidou 等[23]研究表明，高O2促進(jìn)好氧微生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生；Farber[24]指出，CO2可以直接抑制微生物內(nèi)酶的作用或降低酶的反應(yīng)速率，這與本研究O2/CO2氣調(diào)處理降低枝孢菌SOD 和CAT 活性的結(jié)果一致。本研究中氣調(diào)處理的枝孢菌孢子電導(dǎo)率及內(nèi)容物釋放量顯著超過對照組，可能與O2/CO2氣調(diào)處理損傷枝孢菌活性氧清除系統(tǒng)，導(dǎo)致生物膜中脂質(zhì)發(fā)生過氧化，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+等離子外流有關(guān)，菌絲內(nèi)部存在大量空腔也證實了這一點（圖2）。

Wszelaki 等[25]研究指出，高O2對離體灰葡萄孢菌生長的抑制無后續(xù)效應(yīng)，而本試驗處理8 d后，枝孢菌的生長曲線結(jié)果與此相反，表現(xiàn)出一定的后續(xù)效應(yīng)。因此，O2/CO2氣調(diào)可更好的控制果蔬貯藏過程中枝孢菌的危害。本課題組的前期研究表明，西蘭花在0，10，20 ℃時，適宜的O2/CO2氣調(diào)氣體比例分別為60%O2+40%CO2、50%O2+50%CO2和40%O2+60%CO2，耐受的CO2濃度很高，這與高O2能緩解CO2傷害有關(guān)[26-27]。本研究使用的CO2比例最高為40%，就能達(dá)到很好的抑菌效果，表明O2/CO2氣調(diào)在果蔬保鮮及抑菌方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

綜上所述，O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)可降低枝孢菌生長活力、活性氧清除能力和致病能力，并對處理后的生長產(chǎn)生后續(xù)效應(yīng)，且隨著CO2濃度的升高，抑菌效果逐漸增強(qiáng)。該研究為O2/CO2氣調(diào)過程中果蔬采后病害的控制提供了理論依據(jù)。