乳清蛋白成膜條件及其應(yīng)用

王 瑩，劉晶晶，張飛飛，姜淑娟，牟光慶，錢 方

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034）

可食膜是以天然可食性物質(zhì)為原料，添加可食性增塑劑、還原劑和交聯(lián)劑，以包裹、涂布、微膠囊等膜的形式覆蓋于食品表面（或內(nèi)部），來(lái)阻隔水蒸氣、氧氣或各種溶質(zhì)的滲透[1]。與傳統(tǒng)塑料食品包裝材料相比，具有來(lái)源廣泛，賦予營(yíng)養(yǎng)，易于加工，物理機(jī)械性能好，可生物降解，安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。為解決塑料食品包裝導(dǎo)致環(huán)境污染的問(wèn)題，可食膜已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，正在被廣泛應(yīng)用于果蔬、肉及肉制品、水產(chǎn)品和糖果類食品等的包裝，具有良好的市場(chǎng)前景?？墒衬しN類除多糖類、脂類膜外，還包括以植物或動(dòng)物蛋白質(zhì)[4]為基質(zhì)的蛋白膜[4-5]。其中乳清蛋白富含多種生物活性成分，可形成良好性能的薄膜和生物降解涂料，備受研究者關(guān)注[6-7]。目前，關(guān)于蛋白膜的研究多集中于單一改性成膜，而對(duì)同一基質(zhì)不同成膜方法特性的差別研究較少。本研究以乳清濃縮蛋白（WPC80）為基質(zhì)，比較物理法、化學(xué)法、酶法3 種方法對(duì)乳清蛋白膜性質(zhì)的影響，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)比較不同方法制備的乳清蛋白膜對(duì)食品保藏的影響，為可食性膜包裝的深入應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清濃縮蛋白（WPC80，食品級(jí)），德國(guó)Milei公司；保鮮膜（食品級(jí)），上海克林萊塑料有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG 酶，食品級(jí)），鄭州市福潤(rùn)德生物工程有限公司；丙三醇（分析純級(jí)），天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)有限公司；阿魏酸（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XTplus 質(zhì)構(gòu)儀，北京超技儀器有限公司；DKZ-S22 電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL303 電子分析天平、Seven Compact 精密pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZXMP-A1150 恒溫恒濕箱，上海智成分析儀器；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器、SHZ-D 循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳清蛋白成膜工藝 乳清蛋白液（8%WPC）→溶解→（物理法、化學(xué)法、酶法，見(jiàn)表1）→脫氣→定容→倒膜→鋪膜→干燥→平衡48 h（25℃，RH 50%）。

1.3.2 乳清蛋白膜水果保藏試驗(yàn) 將無(wú)損傷且大小相近的圣女果，分別在不同方法制備的乳清蛋白膜液中浸涂1 min，自然晾干。室溫放置，以未涂膜作對(duì)照，測(cè)定感官和相關(guān)理化指標(biāo)。

表1 乳清蛋白膜不同成膜過(guò)程比較Table 1 Comparison of different film forming processes of whey protein

1.3.3 測(cè)定方法

1） 膜機(jī)械性能測(cè)定 質(zhì)構(gòu)儀法[8]。有效拉伸長(zhǎng)度30 mm，拉伸速率1.0 mm/s[9]，記錄膜的抗拉強(qiáng)度（TS）及斷裂伸長(zhǎng)率（E）。

2） 水蒸氣透過(guò)率（WVP）測(cè)定 擬杯子法[10]。

3） 氧氣透過(guò)率（OP）/過(guò)氧化值測(cè)定 滴定法[11]。

4） 失重率測(cè)定 重量法[12]。

5） 抗壞血酸含量測(cè)定 分光度法[13]。

6） 感官評(píng)定 綜合模糊評(píng)定法。參照任思捷等[14]的方法稍作修改。挑選經(jīng)培訓(xùn)的10 位評(píng)委（5男，5 女，不吸煙者）隨機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)因素集U=（色澤、氣味、硬度、腐爛程度），以很差（0～20 分）、較差（20～40 分）、一般（40～60 分）、較好（60～80 分）、很好（80～100 分）為評(píng)語(yǔ)集（V）。按“0～4”評(píng)判法確立權(quán)重向量，確定權(quán)重集。根據(jù)評(píng)定結(jié)果，建立4 個(gè)單因素評(píng)價(jià)矩陣，用M 評(píng)判模型進(jìn)行評(píng)判。

7） 膜綜合性能評(píng)價(jià) 加權(quán)分析法[15]。滿分100 分，其中抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率及水蒸氣透過(guò)率和氧氣透過(guò)率各占25 分，按公式（1）計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

以上試驗(yàn)均重復(fù)3 次，并用IBM SPSS Statistics v20.0.0 軟件，在α=0.05 水平用ANOVA 分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，采用Origin 7.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

可食蛋白膜的機(jī)械性及阻隔性最為重要，本研究以膜的機(jī)械性能及阻隔性能為指標(biāo)，探究不同成膜方法制備乳清蛋白膜的最佳工藝條件，進(jìn)一步應(yīng)用于水果保鮮。

2.1 物理法對(duì)乳清蛋白成膜特性的影響

考慮到物理法制備乳清蛋白膜的熱處理溫度、pH 值和超聲功率等各因素間的交互作用[16]，本研究通過(guò)正交試驗(yàn)L9（34），對(duì)膜的綜合性能進(jìn)行加權(quán)分析。由表1可知，各因素主次關(guān)系為A（溫度）＞B（pH 值）＞C（超聲功率），乳清蛋白經(jīng)高溫?zé)崽幚砣?jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部的羥基和巰基暴露，導(dǎo)致蛋白成膜時(shí)形成新的分子間二硫鍵（SS）[15]。pH 8.0 時(shí)膜機(jī)械性能最好，pH 值改變了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[17]，堿性條件使蛋白質(zhì)分子得到一定程度伸展，分子間相互作用力增強(qiáng)，使膜抗拉強(qiáng)度增大[18]。Reddy 等[19]發(fā)現(xiàn)堿性條件蛋白具有更好的熱塑性；pH＞8.0 時(shí)堿性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)開(kāi)始變性，蛋白質(zhì)間靜電斥力增強(qiáng)，交聯(lián)程度降低，膜性能下降。超聲是通過(guò)加速蛋白質(zhì)分子間及蛋白質(zhì)與水分子間的摩擦，或通過(guò)空穴效應(yīng)、超混合效應(yīng)和機(jī)械作用，引起某些化學(xué)鍵的斷裂，加速分子間有序的相互作用，形成致密的膜基質(zhì)[20]，提高機(jī)械性能。本研究發(fā)現(xiàn)在90 ℃、超聲240 W 時(shí)水蒸氣透過(guò)率最低，氧氣透過(guò)率較低，阻隔性能較好。

由表3可見(jiàn)，熱處理溫度、pH 值、超聲功率3因素對(duì)膜性能均有極顯著影響（P＜0.01）。表2直觀分析和最優(yōu)組合綜合比較得知，物理法最佳成膜條件為A3B2C3，即90 ℃熱處理，pH 8.0，超聲240 W 時(shí)，乳清蛋白膜的綜合得分最高值達(dá)56.56分；比較試驗(yàn)1（綜合得分16.38 分），抗拉強(qiáng)度提高24.08%，斷裂伸長(zhǎng)率提高12.5%，水蒸氣透過(guò)率降低7.45%，氧氣透過(guò)率降低15.33%。

2.2 化學(xué)法對(duì)乳清蛋白成膜特性的影響

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[16]，考慮各因素間的交互作用，對(duì)化學(xué)法制備乳清蛋白膜進(jìn)行正交試驗(yàn)加權(quán)及方差分析，結(jié)果（表4，5）表明，對(duì)膜綜合性能影響的主次關(guān)系依次為B（還原劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞C（交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞A（增塑劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)），且B 和C 對(duì)成膜性有顯著影響。結(jié)果表明，還原劑L-半胱氨酸在蛋白成膜過(guò)程中可阻止巰基被還原，促使大量巰基和疏水基團(tuán)形成新的分子間二硫鍵（S-S），提高膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密性[21]。交聯(lián)劑阿魏酸通過(guò)與乳清蛋白中賴氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等的反應(yīng)交聯(lián)，提高蛋白膜機(jī)械性和阻隔性[22]。甘油具有較強(qiáng)親水性[23]，作為增塑劑使蛋白膜具有良好的感官性能[24]。由表4可知，化學(xué)法制備乳清蛋白膜最佳條件為A1B2C3，即增塑劑甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，還原劑L-半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%，交聯(lián)劑阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20%，綜合得分最高值達(dá)58.62 分，其中，比較（試驗(yàn)1 綜合得分29.86 分）而言，抗拉強(qiáng)度提高7.22%，斷裂伸長(zhǎng)率提高17.02%，水蒸氣透過(guò)率降低8.49%，氧氣透過(guò)率降低10.92%。

表2 物理法制備乳清蛋白膜正交試驗(yàn)L9（34）性能綜合評(píng)價(jià)Table 2 Orthogonal analysis L9（34）of properties of whey protein membrane prepared by physical method

表3 物理法制備乳清蛋白膜正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of the orthogonal test variance whey protein membrane prepared by physical method

表4 化學(xué)法制備乳清蛋白膜性能正交試驗(yàn)L9（34）分析及評(píng)價(jià)Table 4 Chemistry of WPC film performance analysis of orthogonal experiments

（續(xù)表4）

表5 化學(xué)法制備乳清蛋白膜正交試驗(yàn)方差分析Table 5 Analysis of the orthogonal test variance whey protein membrane prepared by chemical method

2.3 TG 酶法對(duì)乳清蛋白成膜特性的影響

在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上[16]，考慮交互作用做正交試驗(yàn)L9（34），通過(guò)加權(quán)分析對(duì)酶法制備乳清蛋白膜的綜合性能進(jìn)行評(píng)分（表6），主次關(guān)系依次為A（加酶量）＞C（時(shí)間）＞B（溫度）。TG 酶能催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成ε-（γ-谷氨?；┵嚢彼峁矁r(jià)鍵，蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)，有利于乳清蛋白膜形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)膜的機(jī)械性能和阻隔性能[25-27]。隨TG 酶量的增加，機(jī)械性能及阻隔性能均增強(qiáng)，大于15 U/g 蛋白的膜性能無(wú)顯著增加，說(shuō)明酶與蛋白活性中心最大程度結(jié)合。溫度過(guò)低或過(guò)高，均影響TG 酶活性和乳清蛋白展開(kāi)的狀態(tài)，導(dǎo)致蛋白膜間交聯(lián)程度不同。并且隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶交聯(lián)反應(yīng)越充分，蛋白分子交聯(lián)越多，形成的蛋白空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更緊密。

通過(guò)表7方差分析可知，TG 加酶量、酶解溫度和時(shí)間等3 因素對(duì)膜性能均有顯著影響。酶法成膜最佳條件為A3B2C2，綜合得分最高達(dá)89.16分，即加酶量20 U/g 蛋白，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間90 min。與試驗(yàn)1（綜合得分59.31 分）相比抗拉強(qiáng)度提高10.03%，斷裂伸長(zhǎng)率提高14.82%，水蒸氣透過(guò)率降低8.78%，氧氣透過(guò)率降低8.37%。

表6 酶法制備乳清蛋白膜性能正交試驗(yàn)L9（34）分析及評(píng)價(jià)Table 6 Enzymatic of WPC film performance analysis of orthogonal experiments

（續(xù)表6）

表7 酶法制備乳清蛋白膜正交試驗(yàn)方差分析Table 7 Analysis of the orthogonal test variance whey protein membrane prepared by enzymatic method

2.4 乳清蛋白膜對(duì)圣女果保藏品質(zhì)的影響

2.4.1 對(duì)失重率的影響 失重率是評(píng)價(jià)果蔬品質(zhì)的重要指標(biāo)。圖1表明，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，用物理、化學(xué)和酶法制備的3 種成膜液處理的圣女果失重率均呈上升趨勢(shì)。其中，未涂膜處理對(duì)照組失重率上升最快，果蔬表面失水嚴(yán)重。在涂膜保藏圣女果（8 d）中，物理法、化學(xué)法和酶法制備蛋白膜的失重率分別比對(duì)照組（未涂膜）降低了37.6%，46.6%和51.6%?？梢?jiàn)，涂膜可降低圣女果的失重率，其中酶法制備的乳清蛋白膜的效果最佳。

圖1 不同成膜法對(duì)圣女果失重率的影響Fig.1 Different treatment effect on weight loss rate of their cherry tomatoes

圖2 不同成膜法對(duì)圣女果抗壞血酸含量的影響Fig.2 The change of ascorbic acid content in cherry tomatoes by different treatment

2.4.2 對(duì)抗壞血酸含量的影響 作為果蔬中重要營(yíng)養(yǎng)成分之一的抗壞血酸，極易被氧化，在呼吸過(guò)程中被消耗。由圖2表明，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同成膜方法處理樣品中抗壞血酸含量總體呈下降趨勢(shì)，然而，初期抗壞血酸含量有增加的現(xiàn)象，可能由于水果尚未完全成熟，果蔬后熟會(huì)引起抗壞血酸含量的升高。其中，未經(jīng)涂膜處理的對(duì)照組抗壞血酸含量下降最快。在不同涂膜貯藏（8 d）的圣女果中，物理法、化學(xué)法和酶法的抗壞血酸含量分別比對(duì)照提高了27.3%，37.7%和43.2%?？梢?jiàn)乳清蛋白涂膜包裝可抑制圣女果的呼吸作用，從而減少抗壞血酸的損失，其中酶法制備乳清蛋白膜的效果最佳。

2.4.3 對(duì)感官品質(zhì)的影響

1） 確定圣女果權(quán)重因子 10 位評(píng)委對(duì)圣女果的感官質(zhì)量4 個(gè)因素按“0～4”評(píng)判法打分，結(jié)果如表8所示?？梢?jiàn)，相應(yīng)因素的權(quán)重系數(shù)（各因素所得總分與全部因素總分之比）A=（0.223，0.136，0.282，0.359）。各因素的權(quán)重不同，對(duì)圣女果而言，多數(shù)人優(yōu)先考慮其腐爛程度，硬度其次，對(duì)色澤和氣味看得相對(duì)較輕。

表8 圣女果感官評(píng)定權(quán)重打分統(tǒng)計(jì)表Table 8 Evaluation of weight coefficient on the cherry tomatoes

2） 感官綜合評(píng)判 10 位評(píng)委根據(jù)評(píng)語(yǔ)集（V）對(duì)存放8 d 的圣女果感官品質(zhì)各自做出評(píng)判。由表9可知，對(duì)照組圣女果的評(píng)價(jià)結(jié)果可得到：

A色澤=[0.4，0.1，0.3，0.2，0.0]

A氣味=[0.3，0.2，0.1，0.3，0.1]

A硬度=[0.2，0.1，0.4，0.2，0.1]

A腐爛程度=[0.0，0.0，0.0，0.4，0.6]

表9 涂膜乳清蛋白膜圣女果的感官評(píng)定Table 9 Sensory evaluation of the cherry tomatoes

將色澤、氣味、硬度、腐爛程度4 個(gè)因素進(jìn)行行排列得到隸屬矩陣分別為：

模糊綜合評(píng)價(jià)矩陣B=AR=（b1，b2，…，bm）

即b1=（0.186，0.078，0.193，0.285，0.257）

b2=（0.000，0.094，0.212，0.351，0.344）

b3=（0.000，0.108，0.207，0.271，0.414）

b4=（0.000，0.094，0.162，0.270，0.474）

4 組圣女果樣品的總分分別為：T1=66.92，T2=78.96，T3=79.82，T4=82.48。研究表明，涂膜保鮮可有效提高圣女果的感官品質(zhì)，優(yōu)劣次序?yàn)椋篠4＞S3＞S2＞S1。其中，浸涂酶法乳清蛋白膜液的圣女果感官品質(zhì)最佳，其次是化學(xué)法，采用物理法浸涂圣女果的感官品質(zhì)也顯著高于不涂膜對(duì)照組。

綜合失重率、抗壞血酸含量和感官評(píng)定3 個(gè)指標(biāo)，圣女果涂膜保藏效果優(yōu)劣排序?yàn)椋好阜ǎ净瘜W(xué)法＞物理法＞對(duì)照（不涂膜）。

3 結(jié)論

本文通過(guò)正交試驗(yàn)的方法研究了乳清蛋白3種制膜方法的最佳工藝條件，其中，物理法：8.0%的乳清蛋白（pH 8.0），經(jīng)240 W 超聲處理20 min，再經(jīng)90 ℃熱處理10 min 后制膜；化學(xué)法：8.0%的乳清蛋白，添加增塑劑甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%、還原劑L-半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%、交聯(lián)劑阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%后，制膜；酶法：將20 U/g 蛋白的TG 酶加入8.0%乳清蛋白中，在50 ℃反應(yīng)90 min 后滅酶制膜。綜合評(píng)價(jià)圣女果失重率、抗壞血酸含量和感官評(píng)定等指標(biāo)，明確乳清蛋白膜對(duì)圣女果的保藏效果為：酶法＞化學(xué)法＞物理法，且均優(yōu)于不涂膜保藏的對(duì)照組。綜上，在乳清蛋白膜涂膜保藏圣女果的應(yīng)用中，酶法制備的乳清蛋白膜效果最佳，其次為化學(xué)法，2 種方法均優(yōu)于物理法。本研究為進(jìn)一步探索乳清蛋白膜成膜機(jī)制及其包裝應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。