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    章魚墨囊黑色素的提取及理化性質(zhì)研究

    2021-02-05 05:53:38王向紅李希羽智童心桑亞新
    中國食品學(xué)報 2021年1期
    關(guān)鍵詞:離心法章魚黑色素

    李 嬌,王向紅,周 暢,李希羽,智童心,桑亞新

    (河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071000)

    章魚(Octopodidae)又稱蛸類,望潮等[1],是一種重要的海洋水產(chǎn)品資源。然而,章魚加工過程產(chǎn)生了50%以上的副產(chǎn)物,往往未加利用就被丟棄,造成了極大的浪費和環(huán)境污染[2]。其中,章魚肝臟是副產(chǎn)物中體積分?jǐn)?shù)最大的,章魚墨囊內(nèi)嵌于肝臟,含有黑色素等生物活性物質(zhì),而目前對于章魚墨黑色素的研究鮮有報道。

    黑色素是目前分布最廣的一類天然色素,存在于微生物及動、植物體內(nèi)。天然黑色素的理化性質(zhì)幾乎是相同的,與分類和結(jié)構(gòu)無關(guān)[3],其中,最具特征的是溶解性、光吸收性、氧化還原性、金屬螯合特性等。黑色素一般呈黑色、棕黑色或棕色[4]且一般不溶于水,在堿性溶液中溶解,在酸性溶液中沉淀[5]。從烏骨雞[6]、黑芝麻[7]、黑木耳[8]及短梗霉[9]中提取的黑色素具有相似的溶解性。章魚墨黑色素屬于真黑色素,主要結(jié)構(gòu)為吲哚-5,6-醌(DHI),2-羧基-吲哚-5,6-醌(DHICA)[10]。天然真黑素具有高度的聚合性,其性質(zhì)隨溶液pH 值、金屬離子,糖及蛋白質(zhì)等發(fā)生改變[11]。黑色素具有重要的生物功能。雷敏等[12]用高速離心法提取制備魷魚墨黑色素,結(jié)果證明其對小鼠機體的免疫反應(yīng)產(chǎn)生重大影響。徐幸蓮等[13]研究發(fā)現(xiàn)烏骨雞黑色素具有類似SOD 的效果。郭欣等[14]利用超聲降解法制備的魷魚墨黑色素具有較強的抗氧化能力。Elobeid 等[15]發(fā)現(xiàn)黑色素可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子起到抗腫瘤作用。

    目前天然黑色素的分離純化方法主要有水洗法、堿溶酸沉法、酶解法和層析法。水洗法適合于雜質(zhì)較少的樣品制備。陳士國[11]采用水洗高速離心法提取得到魷魚墨黑色素,結(jié)構(gòu)保存良好。堿溶酸沉法則利用黑色素堿溶酸沉的性質(zhì),然而研究表明該處理使黑色素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[16]。吳晨霞等[17]采用堿提酸沉的方法提取木耳黑色素,結(jié)果表明在提取時間60 min,溫度30 ℃,氫氧化鈉濃度1.50 mol/L,料液比1∶50 的條件下黑色素提取率為7.19%。李維莉等[18]采用堿提酸沉的工藝分離純化黑葵花籽皮色素,其得率為12.5%。酶解法反應(yīng)溫和,結(jié)構(gòu)保存完整,而工藝復(fù)雜,且蛋白酶較為昂貴。王立等[19]在提取烏飯樹樹葉黑色素過程中添加果膠酶和纖維素酶,提高了黑色素的提取率。余清等[20]采用傳統(tǒng)工藝和復(fù)合酶相結(jié)合的方法,提高了黑色素的提取率。王霞等[21]采用硅膠層析柱對黑甜玉米黑色素進行純化及一系列工藝,所得紅色晶體即為純化的黑色素。

    本研究以章魚加工副產(chǎn)物墨囊作為原料,對比高速離心法和酶解法2 種章魚墨黑色素的提取方法,研究章魚墨黑色素的理化性質(zhì),以期為章魚墨囊黑色素的綜合利用提供數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    章魚肝臟,唐山豐瑞水產(chǎn)食品有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-2800H 型紫外可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司;HH-2 型恒溫水浴鍋,常州市易晨儀器有限公司;TGL-16M 臺式高速冷凍離心機,長沙易達儀器公司;FD5-2.5 真空冷凍干燥機,美國SIM International Group;恒溫磁力攪拌器,美國SIM 儀器有限公司;DZF-6030B 真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 章魚墨黑色素的提取

    1.3.1 高速離心法 剝開新鮮章魚肝臟,取下墨囊,蒸餾水沖洗去除表面雜質(zhì),剪開囊膜,擠出墨汁,用0~4 ℃等體積水浸泡過夜。10 000 r/min 離心20 min,反復(fù)加水潤洗沉淀部分,重復(fù)4~6 次,直至上清液中無明顯雜質(zhì)。收集沉淀,凍干后即得高速離心法提取的章魚墨黑色素樣品。

    1.3.2 酶解法 前處理方法同1.3.1 節(jié)所述,將溶液于10 000 r/min 離心20 min,調(diào)節(jié)pH 值為8,添加地衣芽胞桿菌蛋白酶(200 U/mg),50 ℃下酶解6 h,90 ℃水浴加熱10 min,經(jīng)反復(fù)潤洗,離心至中性,收集沉淀,凍干即得酶解法提取的黑色素樣品。

    1.4 章魚墨黑色素的紫外光譜掃描

    分別將上述2 種方法制備的章魚墨黑色素2 mg,溶于25 mL 1%NaOH 溶液中,水浴加熱10 min,制得穩(wěn)定溶液,于200~800 nm 波長下掃描。

    1.5 章魚墨黑色素的SEM 圖譜及粒徑分析

    將2 種方法提取得到的章魚墨黑色素粘在導(dǎo)電膠帶上,表面噴金粉后使用掃描電鏡進行分析,所得SEM 圖譜采用Nano Measurer 1.2 分析軟件進行像素二值化,對其直徑進行分析,所得數(shù)據(jù)均導(dǎo)出到Origin 軟件,作粒徑分布圖。

    1.6 章魚墨黑色素理化性質(zhì)的測定

    1.6.1 溶解性 將2 mg 章魚墨黑色素與各種有機溶劑、常見無機溶劑、混合緩沖鹽等渦旋1 min左右混勻,室溫放置30 min 后,觀察其顏色及溶解度的變化。

    1.6.2 酸堿穩(wěn)定性 根據(jù)高速離心法提取的章魚墨黑色素在紫外區(qū)的特征吸收峰,計算其在pH 1~14 條件下的吸光度值,與處理前相比較,得出章魚墨黑色素的色殘率。計算方法見式(1)。

    1.6.3 光照穩(wěn)定性 分別稱取8 份25.0 g 的墨黑色素樣品溶于1%NaOH 溶液,渦旋后將其中一組樣品置于自然光下照射30,60,90,120 min,另一組樣品在紫外燈垂直照射30 cm 的位置,同樣分別照射30,60,90,120 min,以未經(jīng)過光線照射的樣品為對照,分別測定波長230 nm 下的吸光值,計算照射前、后色殘率的變化,計算方法見式(1)。

    1.6.4 熱穩(wěn)定性 將16 份25.0 g 的章魚墨黑色素樣品分別在65,85,100 ℃和120 ℃條件下保溫30,60,90,120 min,快速冷卻至25 ℃左右,用等體積的1%NaOH 溶液將其分別溶解,依次測定每個樣品溶液在波長230 nm 處的色殘率,計算方法見式(1)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 章魚墨黑色素的光譜分析

    2.1.1 章魚墨黑色素的紫外-可見吸收光譜分析

    2 種提取方法得到的章魚墨黑色素的紫外-可見吸收光譜如圖1、圖2所示。由圖1可知,高速離心法提取得到的章魚墨黑色素主要在紫外光區(qū)域(190~400 nm)的波長230 nm 處存在一個明顯吸收峰,在波長326 nm 處存在一個較明顯的吸收峰,而在可見光區(qū)域并沒有明顯的吸收峰。由圖2可知,酶法提取的黑色素在紫外光區(qū)域(190~400 nm)的波長210 nm 處存在一個明顯吸收峰,在波長270 nm 處存在一個弱吸收峰,可能由蛋白質(zhì)中的芳族氨基酸殘基引起。郭欣等[14]采用超聲降解法制備可溶性魷魚墨黑色素,發(fā)現(xiàn)其擁有不同的清除自由基活性。宋茹等[22]研究不同精制方法對魷魚墨黑色素的影響,發(fā)現(xiàn)在波長220 nm 處有較強紫外吸收峰,胃蛋白酶水解和酸水解法使黑色素的氨基基團被脫離,掃描電鏡結(jié)果顯示酸水解法會破壞黑色素結(jié)構(gòu)。

    圖1 高速離心法提取的章魚墨黑色素紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-VIS spectra of melanin from octopus extracted by high speed centrifugation

    2.1.2 章魚墨黑色素的SEM 圖譜分析 圖3為2種提取方法得到的掃描電鏡圖譜,其中a 和c 分別為酶解法提取得到的章魚墨黑色素在20k 和50k 倍下的SEM 圖譜,b 和d 分別為高速離心法提取得到的章魚墨黑色素在20k 和50k 倍下的SEM 圖譜。由圖3可知,章魚墨黑色素均由邊緣清晰的球狀顆粒組成,酶法提取的黑色素產(chǎn)生了凹溝和凹洞,而高速離心法提取的黑色素大小相對集中,顆粒緊和程度更加明顯,這可能是因為黑色素顆粒上有蛋白質(zhì),這種蛋白與黑色素緊密連接在一起,基本可以認(rèn)定為黑色素的存在形式,酶法可能破壞了黑色素的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其與蛋白質(zhì)分離,從而使黑色素不完整。

    圖2 酶法提取的章魚墨黑色素紫外-可見光譜圖Fig.2 UV-VIS spectra of melanin from octopus extracted by enzymic method

    圖3 不同提取方法得到的章魚墨黑色素SEM 圖Fig.3 SEM spectra of melanin from octopus by different extracting methods

    圖4 酶法提取的章魚墨黑色素顆粒的直徑分布Fig.4 Diameter distribution of melanin from octopus extracted by enzymic method

    圖5 高速離心法提取的章魚墨黑色素顆粒的直徑分布Fig.5 Diameter distribution of melanin from octopus extracted by high speed centrifugation

    如圖4和圖5所示,數(shù)據(jù)顯示約由250~300個黑色素顆粒小球堆積而成,酶解法制得章魚墨黑色素微球的平均粒徑為133 nm,大部分都在50~200 nm 之間,高速離心法制得黑色素平均粒徑為123 nm,不僅含有顆粒直徑在50~200 nm 之間的小球,還增加了許多直徑小于50 nm 的微球,而結(jié)構(gòu)保存完好。

    綜合SEM 圖譜及粒徑分布,結(jié)合生產(chǎn)成本及生產(chǎn)效率,本研究選擇采用高速離心法提取章魚墨黑色素。李和生等[23]使用堿性蛋白酶提取烏賊墨黑色素,其掃描電鏡圖譜發(fā)現(xiàn)烏賊黑色素由許多單體小球聚合而成,呈圓滑狀,平均粒徑約118 nm。

    2.2 章魚墨黑色素的理化性質(zhì)分析

    2.2.1 高速離心法制得的章魚墨黑色素溶解性分析 由表1可知,對于大部分有機試劑,章魚墨黑色素并不相溶,呈現(xiàn)出沉淀或者懸浮的狀態(tài),在偏堿性的緩沖液中,常溫下可部分溶解,50 ℃加熱條件下可全部溶解,溶液狀態(tài)不穩(wěn)定,溶液大體上呈棕黑色,或有絮狀沉淀;在NaOH 溶液中章魚墨黑色素全部溶解,溶液呈棕褐色。上述結(jié)果可知章魚墨黑色素具有堿溶酸沉的特性。

    2.2.2 章魚墨黑色素對酸堿穩(wěn)定性的分析 表2和圖6分別為章魚墨黑色素在不同pH 值下的色殘率及紫外-可見光譜圖。以未經(jīng)過光線照射的樣品為對照。一般來說,黑色素不溶于酸性溶液,且酸法對黑色素顆粒損傷較大,章魚墨黑色素在不同pH 值條件下呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性:色殘率隨溶液堿性增強而增大,即穩(wěn)定性逐漸升高。由表2可知,在弱酸性條件下,章魚墨黑色素的吸光度及色殘率隨pH 值的降低而降低;當(dāng)pH 值為中性時,色殘率僅為對照的一半左右,表明過低的pH值不利于章魚墨黑色素的穩(wěn)定,在pH 值大于9.0的堿性溶液中,吸光度及色殘率隨堿性增強而增大,溶液較穩(wěn)定。由圖6所示,在pH 1~14 時,隨著溶液酸性逐漸增強,其吸光度逐漸降低,并且在230,326 nm 波長處有明顯的吸收峰。結(jié)果表明,章魚墨黑色素在酸性溶液中不穩(wěn)定,在堿性溶液中隨著pH 值的增加,吸光值逐漸增加,即穩(wěn)定性逐漸增強。

    表1 章魚墨黑色素在不同溶劑中的溶解性Table 1 Solubility of melanin from octopus in different solvents

    2.2.3 章魚墨黑色素對光照穩(wěn)定性的分析 章魚墨黑色素對光照的穩(wěn)定性如圖7所示,高速離心法制備的章魚墨黑色素經(jīng)過自然光照射30 min時,色殘率為對照組的95.6%,而經(jīng)過紫外光線照射30 min 后,其色殘率為對照組的66.7%。此后隨著光照時間的延長,在相同的光照時間內(nèi),章魚墨黑色素經(jīng)過自然光照射后的色殘率顯著高于紫外光照射的結(jié)果,表明高速離心法制備的章魚墨黑色素耐受自然光照射,而其在紫外光照射下的穩(wěn)定性較差。

    表2 章魚墨黑色素在不同pH 值下的色殘率Table 2 Color residual rate of melanin from octopus in different pH values

    2.2.4 章魚墨黑色素對熱穩(wěn)定性的分析 如圖8所示,在保溫30 min 的條件下,章魚墨黑色素在65,85,100,120 ℃條件下的色殘率都在80%以上。在65 ℃時,色殘率最高能夠達到95.4%,且在此溫度下,隨著加熱時間的延長,色殘率下降趨勢非常緩慢,直到120 min 時,黑色素的色殘率仍高達91.3%。當(dāng)溫度達到85 ℃時,在0~60 min 內(nèi),色殘率下降緩慢,加熱60 min 后,色殘率下降呈線性趨勢。當(dāng)加熱溫度達到100 ℃和120 ℃時,隨著黑色素加熱時間的延長,其色殘率快速降低,加熱120 min 時,該黑色素的色殘率分別下降至39.5%,32.1%。由此可知,高速離心法制備的章魚墨黑色素對高溫長時間加熱處理不耐受。

    圖6 章魚墨黑色素在不同pH 值下的色殘率Fig.6 UV-VIS spectra of melanin from octopus in different pH values

    3 結(jié)論

    圖7 章魚墨黑色素的光照穩(wěn)定性Fig.7 Optical stability of melanin from octopus

    圖8 章魚墨黑色素的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of melanin from octopus

    本試驗以章魚加工副產(chǎn)物為原料,比較了高速離心法和酶解法2 種章魚墨黑色素的提取方法,同時研究了其理化性質(zhì)。研究結(jié)果表明,酶法可能破壞了黑色素的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致與蛋白質(zhì)的分離,從而使黑色素不完整,而高速離心法提取的章魚墨黑色素在紫外光區(qū)域的230 nm 和326 nm 波長處分別存在一個明顯和較明顯的光譜吸收峰,其結(jié)構(gòu)保存較完整。章魚墨黑色素的理化性質(zhì)分析表明其不溶于大部分有機、無機試劑,具有堿溶酸沉特性;該黑色素對自然光照條件耐受性較好,對紫外光不耐受。在長時間高溫加熱條件下的穩(wěn)定性較差,并且隨著溶液堿性的增強其穩(wěn)定性升高。本研究對章魚副產(chǎn)物的深加工提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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