幾種植物多糖降血糖活性的對比研究

劉丹奇，任發(fā)政，2，侯彩云，2*

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083 2 食品質量安全北京實驗室 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083）

糖尿病是一種常見的非傳染性內分泌代謝紊亂疾病。近年來，世界范圍內的糖尿病患病率呈上升趨勢，預測到2035年，病例數(shù)將增加到約5.92億人次，平均每12 人中就有1 位糖尿病患者[1]。目前市場上治療糖尿病的藥物毒副作用較強，為尋求安全性更好的輔助治療成分，許多研究者對功能性多糖進行了研究，已發(fā)現(xiàn)多種具有降血糖活性的植物來源多糖[2]。其中，被列入國家“藥食同源”目錄的茶、枸杞、桑葉為原料提取的多糖，均被證實具有一定的降血糖功效[3-5]。

茶多糖是茶葉中存在的一類功能成分，目前研究表明其大多是與蛋白質結合的酸性糖蛋白[6]。目前，對綠茶、紅茶、烏龍茶等原料中茶多糖降血糖功能的研究較集中，其中紅茶多糖表現(xiàn)出較優(yōu)的降血糖活性[3]。枸杞果實被用于傳統(tǒng)中醫(yī)已有1900 余年，枸杞多糖被認為是果實中的主要活性成分[7]。已有研究表明枸杞多糖具有治療糖尿病的生物功效，能夠緩解糖尿病兔的氧化應激，調節(jié)肥胖飲食小鼠的血糖和血脂代謝，改善糖尿病兔的腎病并發(fā)癥[4，8-10]等。我國歷代均有用桑葉治療糖尿病的記載，桑葉中的功能成分桑葉多糖被證實對糖尿病具有一定的治療作用[5]，并且已有多位學者研究了桑葉多糖的具體降血糖機制[11-15]。

為對比茶多糖與不同植物來源多糖降血糖效果的差異，本研究以白琳工夫為原料提取的紅茶茶多糖為研究對象，以同屬“藥食同源”名錄的枸杞、桑葉中提取的多糖作對比，通過對不同指標的測定，研究植物多糖的降血糖效果，分析所選多糖提取物的降血糖機制，為植物多糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實驗動物

紅茶多糖提取物、枸杞多糖提取物、桑葉多糖提取物，陜西楊凌慈緣生物技術有限公司。

鹽酸二甲雙胍藥物，中美上海施貴寶制藥有限公司；葡聚糖標準品、單糖標準品、鏈脲佐菌素粉末狀（Streptozotocin，STZ），美國Sigma 公司；Trizol 試劑、DEPC 水，碧云天生物科技有限公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇等（分析純級），北京化工廠有限責任公司；EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye 試劑盒、5X All-In-One RT MasterMix 試劑盒，美國abm 公司；小鼠引物材料，生工生物工程（上海）股份有限公司。

雄性4 周齡SPF 級ICR 小鼠（許可證號SCXK（京）2016-0002），北京斯貝福生物技術有限公司；高糖高脂飼料（45%脂肪供能），北京華阜康生物科技股份有限公司。小鼠實驗環(huán)境為屏障環(huán)境動物房：12 h 晝夜交替，壓差20～50 Pa，濕度（50±5）%，溫度（22±2）℃。

1.2 儀器與設備

DIONEX ICS-3000 USA 離子色譜測定儀，瑞士萬通中國有限公司；Wyatt Technology DAWN EOS 多角度激光光散射儀，美國懷雅特技術公司；Epoch 酶標檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；Roche 活力型血糖儀，德國羅氏診斷有限公司；Nikon Eclipse Ci 光學顯微鏡，尼康儀器（上海）有限公司；Thermofisher Nanodrop 2000 核酸蛋白檢測儀，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；Roche lightcycler 96 熒光定量PCR 儀，德國Roche 公司；Biometra T-personal 梯度PCR 儀，北京世貿(mào)遠東科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物多糖提取物樣品分子質量的測定 多糖提取物樣品的絕對重均分子質量測定儀器為尺寸排除色譜和多角度激光光散射儀聯(lián)用裝置（SEC-MALLS）。色譜柱型號Shodex OHpak SB-806MHQ（8 mm×300 mm），檢測儀器種類為示差折光檢測器。檢測波長658.0 nm，柱溫保持25 ℃，選用0.1 mol/L 氯化鈉+疊氮化鈉的水溶液作為檢測流動相，樣品溶液質量濃度1 mg/mL，進樣量200 μL，洗脫流速0.5 mL/min，最后過濾選用0.2 μm濾膜。對照樣品為葡聚糖標準品（40 000 u）。

1.3.2 植物多糖提取物樣品的理化成分測定 參照已有研究方法，各理化成分測定方式分別為：多糖含量：苯酚-硫酸比色法[16]；蛋白質含量：考馬斯亮藍試劑盒；多酚含量：福林酚法[17]；總黃酮含量：三氯化鋁比色法[18]。

1.3.3 植物多糖提取物樣品的單糖組成測定 水解管中放入稱取的10 mg 多糖，加入4 mL 4 mol/L的三氟乙酸，之后充氮1 min 排盡管內空氣，旋緊管蓋，于120 ℃條件下水解2 h。冷卻后氮氣吹干水解液，去除過量的三氟乙酸，倒入超純水定容至10 mL。稀釋后，使用0.2 μm 濾膜過濾，靜置準備進樣。采用同樣方法處理單糖標準品。

離子色譜條件：分析柱型號Carbo PacTMPA20 3 mm×150 mm Analytical，250 mmol/L NaOH作為淋洗液，柱溫35 ℃，流速0.5 mL/min，進樣體積10 μL，采用脈沖安培檢測器和金電極。

木糖和甘露糖洗脫流程：A 為水，B 為250 mmol/L 的NaOH；0～20 min，99%A，1%B；20～20.1 min，20%A，80%B；20.1～30 min，20%A，80%B；30.1～40 min，99%A，1%B。

其它單糖和糖醛酸洗脫流程：A 為水，B 為250 mmol/L 的NaOH，C 為1 mol/L 的NaAC；0～20 min，94%A，6%B，0%C；20～20.1 min，89%A，6%B，5%C；20.1～35 min，74%A，6%B，20%C；35.1～45 min，20%A，80%B；45.1～55 min，94%A，6%B。

1.3.4 動物實驗

1.3.4.1 小鼠糖尿病造模方式和分組 小鼠適應性喂養(yǎng)7 d，任意抽取10 只為正常對照組（NC），飼料不變，其余小鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料（45%脂肪供能），持續(xù)4 周，12 h 隔夜禁食，使用pH 4.2～4.5檸檬酸鹽緩沖液溶解粉末狀STZ，采用腹腔注射110 mg/（kg·m）STZ 溶液對小鼠造模，1 周后測定各組小鼠空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG），造模成功標準為FBG ≥11.1 mmol/L[19]。根據(jù)FBG數(shù)值對達到標準的小鼠任意分組，分為陽性對照組（PC）、模型對照組（MC）、BPS 灌胃干預組、LPS灌胃干預組、MPS 灌胃干預組，每組小鼠數(shù)量定為10 只。

1.3.4.2 灌胃劑量確定 參考已有研究[4]確定小鼠的灌胃劑量，多糖灌胃干預組均保持300 mg/（kg·d）。陽性對照組為鹽酸二甲雙胍，參考成年人最大劑量（1～1.5 g/d），根據(jù)文獻[20]換算后確定小鼠灌胃劑量為250 mg/（kg·d）。

1.3.5 各項生化指標測定 在4 周小鼠灌胃干預實驗結束時，統(tǒng)一12 h 隔夜禁食，采全血。收集血樣置于4 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，分離血清，使用全自動生化分析儀測定血清谷草轉氨酶（Aspartate transaminase，AST） 和谷丙轉氨酶（Alanine transferase，ALT），按照試劑盒說明書方法測定血清中胰島素（Fasting insulin，F(xiàn)IS）及肝組織中肝糖原含量、葡萄糖激酶（Glucokinase，GK）活性、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）活性。

1.3.6 小鼠胰腺組織病理情況觀察 剖取小鼠胰腺組織，48 h 內固定于4%多聚甲醛，常規(guī)處理后制片（厚度4 μm），染色方法采取HE 染色法，最后使用光學顯微鏡觀察并拍照（200 倍視野）。

1.3.7 基因熒光定量PCR 檢測 小鼠肝臟RNA使用Trizol 試劑抽提，處理后反轉錄制得cDNA第1 鏈，之后采用10 μL 體系熒光定量，其中加入5 μL EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye 試劑和1 μL cDNA 模板，0.3 μL 上游引物（10 nmol/L），0.3 μL 下游引物（10 nmol/L），最后加入ddH2O到預定體積。檢測程序設置為：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，循環(huán)45 次。實驗內參基因選擇GAPDH，各基因表達情況分析采用2-ΔΔCT法[21]。

具體測定基因：硫氧還蛋白互作蛋白（Thioredoxin interacting protein，TXNIP）、叉頭轉錄因子（Forkhead box O1，F(xiàn)oxo1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（Glucose-6-phosphatase，G6Pc），引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計學分析使用SPSS 20.0 軟件，數(shù)值表示為均值±標準誤差（±s）；采用單因素方差分析不同組別數(shù)值，其中P＜0.05 代表存在顯著差異，P＜0.01代表存在極顯著差異。Origin 8.0 軟件繪制圖像。

2 結果與分析

2.1 分子質量測定結果

按照1.3.1 節(jié)方法測定葡聚糖標準品，精確度確定后檢測提取物樣品，結果如圖1所示。

從圖譜可見，3 種提取物均含有雜峰，同時峰形較寬，峰形未出現(xiàn)單一對稱情況，其中LPS 存在2 個明顯的吸收峰，MPS 存在3 個明顯的吸收峰，三者均為不均一的雜多糖。根據(jù)圖譜測定得出BPS、LPS 及MPS 的絕對重均分子質量依次為8 745，22 410，34 430 u。三者檢測結果的差異可能與原料種類差異有關。

2.2 植物多糖提取物的主要成分

由表2可見，MPS 的總黃酮和多酚含量顯著高于BPS 和LPS（P＜0.05），LPS 的蛋白質含量顯著低于BPS 和MPS（P＜0.05），多糖含量無顯著差異。

圖1 分子質量的測定結果Fig.1 The determination result of molecular mass

表2 植物多糖提取物的主要成分Table 2 The main components of plant polysaccharides

2.3 植物多糖提取物的單糖組成測定結果

根據(jù)色譜各峰保留時間對應各單糖標準品可知，BPS 及MPS 均由阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等單糖組成。LPS 未檢出巖藻糖，由其余8種單糖組成。三者在每種單糖的占比方面存在差異，按上述單糖分子質量由小到大的順序排列單糖的摩爾質量占各自多糖的百分數(shù)，如表3所示。已有研究發(fā)現(xiàn)，阿拉伯半乳聚糖可能是多糖中的主要功能性成分[22-23]，具有降血糖活性，其中阿拉伯糖為主要組成成分。由表3可知，在組成植物多糖的單糖中，阿拉伯糖和木糖的摩爾質量占比呈現(xiàn)出BPS＞MPS＞LPS 的規(guī)律。此外，BPS 中的甘露糖占比明顯高于MPS 和LPS。推測這些差異可能對多糖的降血糖活性產(chǎn)生影響。

表3 植物多糖提取物的單糖摩爾質量占比對比Table 3 Comparison of monosaccharide molar amount ratio of plant polysaccharides

2.4 植物多糖提取物的降血糖效果指標分析

2.4.1 模型小鼠體重、血糖和胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR） 測定結果 糖尿病模型小鼠表現(xiàn)出多種典型癥狀，比如體重降低、多尿、多食、多飲。已有研究表明胰島素抵抗是造成糖尿病的一種基礎原因，原理為靶器官對胰島素的敏感程度減弱，導致機體過量分泌胰島素，進而演變成高胰島素血癥[24]。胰島素敏感性的改善可通過減輕胰島素抵抗程度來實現(xiàn)。胰島素抵抗指數(shù)是判斷的標準之一，已有研究確定其計算方法為[25]：HOMA-IR=FBG×FIS/22.5。各組小鼠不同時期體重、血糖和HOMA-IR 指標的檢測情況如圖2所示。

圖2 植物多糖提取物對小鼠體重、始末血糖及HOMA-IR 的影響Fig.2 Effects of plant polysaccharides on body weight，whole blood glucose and HOMA-IR

由圖2a 可知，正常對照組小鼠體重相對變化小，MC 組小鼠和PC 組小鼠體重變動相對較大，整體上呈降低趨勢。在第3、4 周BPS 組和MPS 組小鼠體重有所回升，LPS 組體重顯現(xiàn)出降低趨勢。為更易體現(xiàn)組間差別，統(tǒng)計小鼠的體重增長率，如圖2b 所示。MC 組指標為負值，推測由誘導造模糖尿病導致；LPS 組指標與MC 組未產(chǎn)生顯著差異（P＞0.05），表明其恢復小鼠體重的效果較差；BPS組和MPS 組的指標均超過MC 組，且達到顯著水平（P＜0.05），而PC 組指標超過MC 組，且達到極顯著水平（P＜0.01），這可以表明各組灌胃干預都能夠改善模型小鼠體重減輕的癥狀。

圖2c 表明，造模成功時各組小鼠FBG 無顯著差異（P＞0.05）。經(jīng)4 周灌胃干預后，MC 組指標升高，而并未表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05），PC，BPS，LPS，MPS 干預組小鼠的血糖下降率依次為53.2%，61.6%，52.8%和53.8%。可知降血糖效果由高到低分別為BPS，MPS，PC，LPS。

圖2d 表明，小鼠造模完成后IR 數(shù)值顯著上升，MC 組小鼠指標高于NC 組小鼠指標且達到極顯著差異（P＜0.01）。各灌胃干預組小鼠指標低于MC 組小鼠指標，且達到極顯著差異（P＜0.01），均有較好的緩解效果，其中BPS 效果最佳，之后為MPS 和LPS，3 組之間未表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05）。

2.4.2 植物多糖提取物對糖尿病小鼠糖代謝相關生化指標的影響 糖代謝途徑是機體調節(jié)血糖水平的重要途徑。葡萄糖激酶（GK）可通過催化葡萄糖分解從而調節(jié)人體葡萄糖水平，在肝臟細胞中受胰島素誘導合成；丙酮酸激酶（PK）通過參與糖酵解途徑下調血糖水平。為研究茶多糖對糖代謝途徑的影響，測定各組小鼠的肝臟肝糖原含量、GK 活性及PK 活性，結果如表4所示。

表4 小鼠糖代謝相關指標水平Table 4 Mice glucose metabolism related index level

MC 組的肝糖原含量、GK 活性和PK 活性均極顯著低于NC 組（P＜0.01），表明糖尿病造成小鼠機體糖代謝紊亂，抑制了糖酵解途徑和肝糖原的合成，造成血糖水平升高。藥物和多糖干預組肝糖原含量和GK 活性均極顯著高于MC 組（P＜0.01），表明干預組均能夠促進葡萄糖轉化為肝糖原，緩解糖尿病引起的肝糖原含量下降，并能夠提高GK活性，提高胰島素誘導合成能力。其中，MPS 增加肝糖原含量效果最優(yōu)，其次為BPS 和LPS；BPS 提高GK 活性效果最優(yōu)，其次為LPS 和MPS，3 組GK 活性與肝糖原含量均未能恢復至正常水平。PC 組和多糖干預組的PK 活性極顯著高于MC 組（P＜0.01），具有很好的促進糖酵解的效果。其中，BPS 略遜于MPS（P＞0.05），優(yōu)于LPS。

2.4.3 組間小鼠胰腺組織的病理狀態(tài)對比 各組小鼠胰腺組織的病理狀態(tài)如圖3所示，可看出，正常組小鼠胰島形態(tài)正常，同時可觀察到腺泡細胞形態(tài)正常，此外視野內細胞呈均勻分布。MC 組小鼠胰島存在變形，腺泡結構損壞且分布減少，同時存在組織增生現(xiàn)象，整體可看出糖尿病造模過程嚴重損傷了胰島組織，并出現(xiàn)了脂肪變性的先兆。藥物灌胃干預組胰島存在變形情況，出現(xiàn)很多胞質疏松或者顯現(xiàn)出空泡狀態(tài)的細胞，部分胰島附近觀察到淋巴細胞浸潤現(xiàn)象，整體可看出藥物組小鼠的病理狀況較嚴重，藥物鹽酸二甲雙胍的改善效果不太顯著。

圖3 小鼠胰腺組織對比Fig.3 Comparison of mice pancreas

各多糖灌胃干預組小鼠的胰島均存在變形情況，出現(xiàn)較少胞質疏松或者顯現(xiàn)出空泡狀態(tài)的細胞；BPS 組小鼠的部分組織周圍可觀察到較少炎性細胞浸潤情況；MPS 組小鼠胰腺組織可觀察到較多細胞胞核緊縮深染，未觀察到其它明顯異常情況?？赏茰y，實驗所選多糖灌胃干預后均能減輕小鼠因糖尿病造模導致的胰腺組織病變，然而總體上無法恢復正常，不同組別間也無明顯差異。在減輕小鼠因糖尿病導致的胰腺組織病變方面，實驗所選多糖提取物明顯優(yōu)于鹽酸二甲雙胍藥物。

2.4.4 植物多糖提取物灌胃干預影響小鼠部分基因表達的對比分析 為進一步探究實驗所選的植物多糖提取物可能涉及的降血糖機制途徑，定量測定各組小鼠肝臟組織中部分關鍵基因的相對表達量，結果如圖4所示。

Foxo1 基因能夠抑制胰島β 細胞增殖，是一種關鍵調控基因[26]，表現(xiàn)為減少胰島素分泌，控制血糖升高。圖4a 表明，MC 組小鼠該基因相對表達量高于NC 組，且達到極顯著水平（P＜0.01）。與MC組相比，多糖灌胃干預均使指標極顯著下降（P＜0.01），其中BPS 測定結果最佳，其次為MPS、PC和LPS，干預組間未達到顯著差異水平（P＞0.05）?？梢杂纱送茰y，實驗所選多糖提取物降低糖尿病小鼠高血糖的效果可能與下調Foxo1 基因的相對表達途徑有關。

圖4 植物多糖提取物影響小鼠部分基因表達的對比Fig.4 Comparison of the effects of plant polysaccharide extracts on the expression of some genes in mice

G6Pc 和PEPCK 基因都是糖異生途徑中的關鍵調控基因，兩者表達量增加后，能夠推動非糖物質向葡萄糖的轉化過程，并從肝臟組織轉運到血管中，最終使得血糖升高[2]。圖4b 和圖4c 表明，MC 組小鼠兩者的測定結果高于NC 組，并達到極顯著水平（P＜0.01）。與MC 組相比，藥物和多糖干預組測定結果均極顯著降低（P＜0.01），而組間未表現(xiàn)顯著差異（P＞0.05），4 組中BPS 測定結果最優(yōu)，之后依次為MPS、LPS 和PC?？梢酝茰y，抑制糖異生途徑關鍵基因表達也是實驗所選多糖提取物作用途徑。

TXNIP 基因作為細胞炎癥因子，是糖尿病發(fā)病原理中涉及的一種重要基因，有研究表明其在肝臟組織中的表達量上升會推動胰島β 細胞的凋亡過程[27]。圖4d 表明，MC 組小鼠的測定指標高于NC 組，并達到極顯著水平（P＜0.01）。藥物和多糖干預組與MC 組對比，指標極顯著下降（P＜0.01）。整體可看出，藥物效果明顯優(yōu)于多糖提取物，多糖干預組中BPS 指標測定結果最優(yōu)，表明所選紅茶多糖提取物在減少炎癥因子表達，保護胰島β 細胞這一途徑相對效果更好。

2.5 植物多糖提取物的安全性評價

血液中ALT 和AST 水平是衡量肝臟受損的重要指標。由表5可知，造模會對小鼠造成一定程度的肝損傷，然而未達到顯著差異水平（P＞0.05）。PC 組小鼠ALT 水平顯著高于NC 組（P＜0.05），AST 水平極顯著高于NC 組（P＜0.01），表明二甲雙胍藥物會對小鼠肝臟造成明顯損傷。多糖干預組ALT 和AST 水平均高于NC 組，而均未達到顯著水平（P＞0.05），表明所選植物多糖提取物未表現(xiàn)出顯著肝毒性，在安全性方面優(yōu)于藥物二甲雙胍。

表5 小鼠安全性相關指標水平Table 5 Mice safety related index level

3 結論

本試驗采用的3 種植物多糖提取物在各項指標測定中均表現(xiàn)出減輕糖尿病典型癥狀的效果，其中，直觀指標血糖下降率整體呈紅茶多糖＞桑葉多糖＞枸杞多糖的規(guī)律。其中紅茶多糖提取物在下調FBG，降低HOMA-IR 水平和提高GK 活性等方面效果更優(yōu)；桑葉多糖提取物在緩解糖尿病造成的小鼠體重減輕，增加肝糖原含量和提高PK活性等方面效果更優(yōu)。

此外，三者均能夠降低G6Pc 和PEPCK 兩種基因的表達，通過減少葡萄糖的生成達到血糖下降的效果；降低Foxo1 基因表達，保護胰島β 細胞，達到減輕糖尿病癥狀，降低血糖水平的效果，在該指標中紅茶多糖提取物最具優(yōu)勢；抑制TXNIP 基因表達，減輕炎癥因子導致的胰島β 細胞凋亡，其中紅茶多糖提取物最具優(yōu)勢。整體可推測，試驗所選多糖提取物產(chǎn)生降血糖效果的途徑可能包括調控糖代謝和保護胰島β 細胞。

植物多糖的基礎結構可能受到包括原料來源、提取方法等方面的影響，導致生物活性差異。分子質量、單糖組成、糖鏈結構等均可能是多糖生物活性的影響因素[2]。本試驗選取的植物多糖提取物分子質量差異較大，其中紅茶多糖的分子質量最小，推測這使其更易被機體吸收，從而提高降血糖活性。試驗所選植物多糖提取物在單糖組成方面存在差異，其中阿拉伯糖和木糖的摩爾質量占比與降血糖活性呈正相關，推測阿拉伯糖含量的增加會提高功能因子阿拉伯半乳聚糖的含量，木糖含量的增加能夠使機體腸道菌群得到更好的調節(jié)[28]，有助于提高多糖的吸收程度，進而提高多糖的降血糖活性。在本試驗所設劑量條件下，植物多糖提取物均未表現(xiàn)出明顯的肝臟毒性，安全性明顯優(yōu)于二甲雙胍。

本文所選植物多糖提取物中，紅茶多糖的降血糖效果最優(yōu)，表明其具有開發(fā)利用的潛力。然而，多糖發(fā)揮降血糖效果的影響因素較多，作用途徑繁雜，且不僅涉及一處靶點[27]，結構、劑量、吸收方式、純度、作用時間等因素的影響有待進一步研究。