黃連解毒湯對變應性鼻炎大鼠TLR4/NF-κB信號通路及黏膜杯狀細胞的影響*

劉書芹， 李桂華， 趙 娜， 劉新明， 張潔瑛， 王金貴

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院推拿科，天津300193）

變應性鼻炎屬于過敏性鼻炎，是耳鼻喉科常見病和多發(fā)病，臨床上表現(xiàn)為打噴嚏、鼻塞和鼻癢，分泌大量清水樣鼻涕［1］。炎癥因子、免疫細胞、炎癥細胞等參與鼻部變態(tài)反應，而鼻部分泌的黏液可起潤滑作用，實現(xiàn)對鼻黏膜上皮細胞的保護作用，但過量黏液則可損壞鼻黏膜分泌功能，惡化鼻黏膜生理防御功能［2］。目前該病在臨床上以糖皮質(zhì)激素、過敏反應介質(zhì)阻斷劑、免疫調(diào)節(jié)劑等治療為主，這些藥物雖可在一定程度上緩解疾病，但患者多出現(xiàn)不良反應［3］。而傳統(tǒng)中藥可減少不良反應、且效果良好。黃連解毒湯（Huanglian-jiedu decoction，HLJD）是清熱解毒代表方，具有抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等作用，在腸道黏膜中可改善免疫功能從而緩解疾?。?］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）表達于免疫細胞表面，能特異性識別特定病原菌，且活化的TLR4 能激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 信號通路參與免疫和炎癥反應［5］。我們推測黃連解毒湯可能通過TLR4/NF-κB 通路影響變應性鼻炎。因此，本研究通過卵白蛋白制備變應性鼻炎大鼠模型，探究黃連解毒湯對變應性鼻炎的影響及可能的作用機制，以期為治療變應性鼻炎提供一定的參考。

材 料 和 方 法

1 動物

SD 大鼠購自北京維通利華有限公司［許可證號：SCXK（京）2019-0009］，SPF 清潔級，體重（200±20）g。所有大鼠在清潔、安靜、通風良好的環(huán)境中飼養(yǎng)，自然光照，溫度25℃，相對濕度50%，自由飲食、飲水，定期更換墊料、添加飼料及飲用水，定期清理、消毒鼠籠。本研究經(jīng)本院倫理協(xié)會審核并通過。

2 主要試劑及儀器

黃連解毒湯的方劑由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成。根據(jù)本實驗室已有提取黃連解毒湯制劑工藝，各成分分別取10 g，加10 倍水加熱煮沸1.5 h，過濾得濾液Ⅰ；藥渣部分加8倍水加熱煮沸1 h，過濾得濾液Ⅱ；合并濾液Ⅰ和Ⅱ，煮沸蒸干濃縮至300 mL，經(jīng)鑒定得率為26.73%。

丙酸氟替卡松鼻噴霧劑（葛蘭素史克制藥集團）；卵白蛋白（上海澤葉生物公司）；氫氧化鋁（國藥集團化學試劑有限公司）；高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）和蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶有限公司）；大鼠白細胞介素（interluekin，IL）-4 和IL-5 ELISA 試劑盒，兔抗 TLR4、NF-κB p65 和 β-actin 抗體（Abcam）。RT-qPCR儀（ABI）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

3 主要方法

3.1 動物造模及分組 參考文獻［6］制備變應性鼻炎大鼠模型，實驗前將0.3 mg 卵白蛋白和30 mg 氫氧化鋁佐劑溶于1 mL 生理鹽水中制成混懸液，腹腔注射大鼠致敏，隔天1 次，連續(xù)8 次，第16 天每只大鼠兩側(cè)鼻腔均給予5%卵白蛋白生理鹽水溶液滴鼻（每側(cè)50 μL），同時超聲霧化吸收1%卵白蛋白5 min，每天1次，連續(xù)7 d，造模結(jié)束后行為學觀察評分評價造模情況。將造模成功大鼠隨機分為：模型組，HLJD低、中、高劑量組，以及陽性對照組，每組10只。對照組10 只大鼠給予等體積生理鹽水相同操作。HLJD 低、中、高劑量組分別按生藥 5、10 和 20 g/kg 的量灌胃，陽性對照組給予丙酸氟替卡松鼻噴霧劑（每側(cè)鼻腔 50 μg）［7］，對照組和模型組灌胃和噴霧等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)10 d。

3.2 行為學觀察評分 末次造模結(jié)束后及治療結(jié)束后參考文獻［8］判定造模情況和治療情況。噴嚏數(shù)：1～3個為1分，4～10個為2分，≥11個為3分；鼻癢程度：輕度瘙癢1～2次為1分，劇烈瘙癢、抓耳撓鼻為2 分；流鼻涕情況：鼻涕流至鼻孔為1 分，鼻涕超出鼻孔為2分，涕流滿面為3分。每項疊加為行為學總評分，超過5分即為造模成功。

3.3 癥狀觀察 濾紙條剪成1 mm×25 mm 細條狀，治療結(jié)束及行為學觀察評分鑒定后將濾紙條插入大鼠一側(cè)鼻腔中，吸取鼻腔分泌物，濾紙條放置5 min后減重法稱量濾紙吸附鼻腔分泌物重量［9］。

3.4 PAS 染色觀察黏膜杯狀細胞情況 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，鼻背正中縫處裂開鼻腔，剖析出鼻黏膜組織，一側(cè)置于-80℃冰箱保存，另一側(cè)迅速置于4%多聚甲醛中固定8 h，石蠟切片，部分PAS染色后，400倍下觀察杯狀細胞情況。杯狀細胞相對比例（%）=計數(shù)杯狀細胞個數(shù)/上皮細胞個數(shù)×100%。

3.5 HE 染色觀察鼻黏膜組織形態(tài)學的變化 石蠟切片，經(jīng)HE染色試劑盒染色后，200倍顯微鏡下觀察嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞情況，觀察炎癥和小血管的情況。

3.6 ELISA 法檢測鼻黏膜組織中IL-4 和IL-5 的水平 -80℃冰箱中取部分組織，勻漿后取上清，采用大鼠IL-4和IL-5 ELISA試劑盒檢測鼻黏膜組織中IL-4和IL-5水平。

3.7 RT-qPCR 檢測黏膜組織中鼠鈣激活氯通道3（mouse calcium-activated chloride channel 3，mCLCA3）和黏蛋白 5AC（mucin 5AC，MUC5AC）的 mRNA 水平 -80℃冰箱中取部分組織，Trizol法提取總RNA，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進行擴增。mCLCA3 的 上 游 引 物 序 列 為 5′-GGAGGAGTCACTTCAGACAGA-3′，下游引物序列為5′-CACCTGCATTTCCCCTAGCC-3′；MUC5AC 的上游引物序列為 5′-GGGCAGCGCTACAGTTTCAG-3′，下游引物序列 為 5′-TCAGTGACAACACGAAAGGC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-ACCACAGTCCATGCCATAC-3′，下游引物序列為 5′-TCCACCACCCTGTTGCTG-3′。反應條件為：95℃ 5 min；94℃ 50 s、60℃ 65 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算mRNA相對水平。

3.8 Western blot 實驗檢測黏膜組織中TLR4 和NF-κB p65 的蛋白水平 剩余黏膜組織冰上勻漿裂解，4℃、10 000×g離心20 min 的上清液即為總蛋白。取等質(zhì)量總蛋白電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，分別加入兔源抗TLR4、NF-κB p65 和β-actin抗體，4℃孵育過夜；加入羊抗兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h，增強化學發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One 軟件分析各組蛋白灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。

4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 黃連解毒湯對大鼠行為學評分和鼻腔分泌物量的影響

治療結(jié)束后，與對照組相比，模型組的行為學評分及鼻腔分泌物量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽性對照組的行為學評分及鼻腔分泌物量均顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠行為學評分、鼻腔分泌物量和黏膜組織中杯狀細胞相對比例的比較Table 1.Comparison of the behavioral scores，nasal secretion and relative proportion of goblet cells in the mucosa of the rats in the 6 groups（Mean±SD. n=10）

2 黃連解毒湯對鼻黏膜組織杯狀細胞的影響

杯狀細胞底部狹窄，頂部膨大，PAS染色為紫紅色。與對照組相比，模型組黏膜組織中杯狀細胞相對比例顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃連解毒湯低、中和高劑量組及陽性對照組黏膜組織中杯狀 細胞相對比例顯著降低（P＜0.05），見圖1及表1。

Figure 1.PAS stainning of the nasal mucosa（×400）.圖1 鼻黏膜組織的PAS染色情況

3 黃連解毒湯對鼻黏膜組織形態(tài)學影響

對照組鼻黏膜組織排列均勻，形態(tài)正常；模型組鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤嚴重，炎癥浸潤明顯，出現(xiàn)明顯的小血管擴張和間質(zhì)水腫現(xiàn)象；隨著黃連解毒湯劑量的升高，淋巴浸潤現(xiàn)象明顯減少，但嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤仍然存在，炎癥浸潤緩解；陽性對照組出現(xiàn)少量嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，見圖2。

Figure 2.The morphological changes of the nasal mucosa observed by HE staining（×200）.圖2 鼻黏膜組織的HE染色情況

4 黃連解毒湯對鼻黏膜組織中IL-4 和IL-5 水平的影響

與對照組相比，模型組黏膜組織中的IL-4 和IL-5 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽性對照組黏膜組織中的IL-4和IL-5水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

5 黃連解毒湯對黏膜組織中mCLCA3 和MUC5AC mRNA水平的影響

與對照組相比，模型組黏膜組織中mCLCA3 和MUC5AC 的mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽性對照組黏膜組織中mCLCA3 和MUC5AC 的mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

6 黃連解毒湯對鼻黏膜組織中TLR4和NF-κB p65蛋白水平的影響

與對照組相比，模型組黏膜組織中TLR4 和NF-κB p65蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃連解毒湯低劑量組黏膜組織中TLR4蛋白水平，黃連解毒湯中、高劑量組和陽性對照組黏膜組織中TLR4 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見圖3及表2。

討 論

TLR4 廣泛存在于黏膜巨噬細胞、樹狀突細胞、黏膜上皮細胞和杯狀細胞中，是第一個人類發(fā)現(xiàn)的TLR 相關(guān)蛋白［10］，作為細胞膜上受體，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用，過度激活TLR 會持續(xù)產(chǎn)生促炎因子和趨化因子，破壞免疫穩(wěn)態(tài)，從而導致疾病發(fā)生［11］。刺激 TLR4 可促進 NF-κB 的釋放 ，NF-κB 作為TLR 中樞樞紐，廣泛存在于免疫細胞中，參與炎癥、淋巴細胞成熟、獲得性免疫等多種過程［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組鼻黏膜組織中TLR4、NF-κB p65 蛋白水平升高，提示在變應性鼻炎中TLR4 處于激活狀態(tài)，激活TLR4 可促進NF-κB 的釋放從而參與機體炎癥、免疫過程。在變應性鼻炎中，炎癥現(xiàn)象明顯，免疫出現(xiàn)失衡，導致TLR4 過度激活導致炎癥因子IL-4 和IL-5 水平升高從而加重疾?。?4］，提示在變應性鼻炎中IL-4 和IL-5處于高水平狀態(tài)，炎癥反應嚴重。

表2 大鼠鼻黏膜組織中IL-4和IL-5水平、mCLCA3和MUC5AC mRNA水平及TLR4和NF-κB p65蛋白水平的比較Table 2.Comparison of the IL-4 and IL-5 levels，the mRNA levels of mCLCA3 and MUC5AC，and the protein levels of TLR4 and NF-κB p65 in the rat nasal mucosa of the 6 groups（Mean±SD. n=10）

Figure 3.The representative images of Western blot for determining the protein levels of TLR4 and NF-κB p65 in the rat nasal mucosal tissues of the 6 groups.圖3 Western blot檢測6組大鼠鼻黏膜組織中TLR4和NF-κB p65蛋白水平的變化

杯狀細胞增生是黏液高分泌的主要病理特征，是變應性鼻炎的特征［15］。黏蛋白是黏液的主要成分，決定黏液彈性和黏性，其中病理狀態(tài)下MUC5AC占優(yōu)勢，且由杯狀細胞分泌，被認為是杯狀細胞化生的標志［16］。近年來，離子通道與黏液高分泌備受關(guān)注，鈣激活氯通道是其中之一，mCLCA3 和hCLCA1是同源CLCA 通道，在電解質(zhì)轉(zhuǎn)運、黏液分泌方面發(fā)揮重要作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組鼻黏膜組織中杯狀細胞相對比例、mCLCA3 和MUC5AC mRNA 水平升高，提示變應性鼻炎時，黏膜杯狀細胞數(shù)量增加，從而促進杯狀細胞增生相關(guān)基因表達，誘發(fā)變應性鼻炎氣道黏液過度分泌，加重疾病進程。而黃連解毒湯在現(xiàn)代藥理研究中應用廣泛，不僅具有消炎抗菌作用，還具有降壓、止血、改善慢性腦缺血等多種作用［15］，但尚未發(fā)現(xiàn)其對變應性鼻炎的作用研究。研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇可能通過抑制NF-κB 進而抑制哮喘小鼠氣道杯狀細胞增生和MUC5AC 表達［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，黃連解毒湯低、中、高劑量組的行為學評分、鼻腔分泌量降低，黏膜組織中的 IL-4 和 IL-5 水平、mCLCA3 和MUC5AC 的 mRNA 水平及 TLR4 蛋白水平降低，提示黃連解毒湯可能是通過抑制TLR4/NF-κB 通路來抑制mCLCA3 和MUC5AC 表達，從而減少炎癥因子釋放、減少杯狀細胞相對比例及其分泌的黏液量，最終減少打噴嚏次數(shù)、緩解鼻癢、減少鼻涕分泌量，緩解黏液損壞鼻黏膜分泌功能從而緩解疾病。

綜上所述，本文驗證了黃連解毒湯可緩解變應性鼻炎，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路，減少杯狀細胞相對比例有關(guān)。