大氣顆粒物急性暴露對(duì)C57BL/6小鼠肺臟病理改變和氣道上皮細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)的影響*

王 強(qiáng)， 董 年

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州325000）

伴隨著不斷推進(jìn)的工業(yè)化、城市化的進(jìn)程，日益嚴(yán)重的空氣污染是我國(guó)目前嚴(yán)重危害健康的公共衛(wèi)生問題［1］。大氣顆粒物（particulate matter，PM）是空氣污染物中的重要成分，根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)直徑又可劃分為粗顆粒物（PM10）、細(xì)顆粒物（PM2.5）和超細(xì)顆粒物（PM0.1）。PM 可以隨呼吸運(yùn)動(dòng)廣泛沉積在肺臟，與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。氣道上皮是PM 進(jìn)入肺臟后的第一道防線，目前認(rèn)識(shí)到氣道上皮不僅是肺臟結(jié)構(gòu)細(xì)胞，而且扮演了啟動(dòng)細(xì)胞和繼發(fā)受體的角色［4-5］。受限于難以直接獲取PM 急性暴露的人體肺臟標(biāo)本，目前PM 暴露氣道炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬采用PM 急性暴露的小鼠模型，觀察肺臟的病理改變和炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素6（interlukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素8（interlukin-8，IL-8）的分泌。已知IL-6 和 IL-8 是常見的趨化因子，具有趨化中性粒細(xì)胞、級(jí)聯(lián)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)、引發(fā)肺部疾病的作用［6-7］。不同于既往主要聚焦免疫細(xì)胞來(lái)源的IL-6 和IL-8，本研究擬在小鼠肺臟病理改變的基礎(chǔ)上，采取肺臟固有結(jié)構(gòu)細(xì)胞氣道上皮細(xì)胞來(lái)研究PM誘導(dǎo)IL-6和IL-8的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

6～8 周 SPF 級(jí)雄性 C57BL/6 小鼠（20～22 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，許可證號(hào)為SXCK（京）2016-0011。人正常氣道上皮細(xì)胞系BEAS-2B購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。PM 購(gòu)自NIST；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco；兔抗人p-Akt和Akt抗體購(gòu)自 CST；兔抗人 GAPDH 抗體購(gòu)自 Santa Cruz；PI3K抑制劑LY294002 購(gòu)自Sigma；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染蛋白Marker和ECL發(fā)光液購(gòu)自Thermo。

2 方法

2.1 動(dòng) 物 模 型 選 取 20 只 6～8 周 SPF 級(jí) 雄 性C57BL/6 小鼠（20～22 g），均腹腔注射 10 mL/kg 的水合氯醛麻醉，隨機(jī)分為 2 組（n=10）：（1）空白對(duì)照（vehicle）組：PBS 25 μL 氣道滴注，連續(xù)氣道滴注2 d；（2）PM 實(shí)驗(yàn)組：4 g/L PM 懸浮液25 μL 氣道滴注，連續(xù)氣道滴注2 d。空白對(duì)照組和PM 實(shí)驗(yàn)組在末次氣道滴注24 h 后處死小鼠獲取動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞模型 BEAS-2B 細(xì)胞使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用0.25%胰酶溶液進(jìn)行消化傳代，獲取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。具體實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）200 mg/L 的PM 刺激 BEAS-2B 細(xì)胞 3、6、12 和 24 h，檢測(cè) IL-6 和 IL-8 的mRNA 變化；（2）25、50、100、200 和 400 mg/L 的 PM刺激 BEAS-2B 細(xì)胞 24 h，檢測(cè) IL-6 和 IL-8 的蛋白變化；（3）200 mg/L 的 PM 刺激 BESA-2B 細(xì)胞 5、10 和15 min，檢測(cè)PI3K 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化；（4）預(yù)先給予 5 μmol/L PI3K 抑制劑 LY294002 干預(yù) 0.5 h，200 mg/L 的 PM 刺激 BESA-2B 細(xì)胞 15 min，檢測(cè) PI3K信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化。

2.3 ELISA 實(shí)驗(yàn) 獲取小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）或細(xì)胞培養(yǎng)上清，4℃、1 000 r/min 離心后獲取上清液，ELISA 板中添加標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣品，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h后移除ELISA 板每孔中的液體，添加100 μL 的生物素抗體在37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，再次洗滌去液體添加HRP-抗生物素蛋白，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，重復(fù)洗滌過(guò)程5次，然后顯色和終止，利用酶標(biāo)儀計(jì)算每孔吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每孔檢測(cè)樣品的濃度。

2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 獲取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B 細(xì)胞，不同實(shí)驗(yàn)干預(yù)之后獲取細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃、20 913×g離心10 min提取上清液，使用BCA 測(cè)定蛋白濃度。兩組細(xì)胞分別取 30 μg 蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，Ⅰ抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液洗膜10 min×3 次，Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育 1.5 h，再用 TBST 緩沖液洗膜 10 min×3 次，化學(xué)發(fā)光法顯影條帶。

2.5 real-time PCR 實(shí)驗(yàn) 獲取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B 細(xì)胞，不同實(shí)驗(yàn)干預(yù)之后獲取細(xì)胞，按照Trizol 說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測(cè)定提取的總RNA 濃度。取總RNA 2 μg 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA 為模板進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，總共 40 個(gè)循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)以 2-ΔΔCt計(jì)算。引物序列見表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

2.6 HE 染色、過(guò)碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色及病理分級(jí) 造模成功之后處死動(dòng)物，經(jīng)氣管插管灌注多聚甲醛填充肺臟，獲取完整的肺臟置于多聚甲醛中固定，隨后進(jìn)行石蠟包埋，獲得肺組織切片。（1）HE染色：切片依次使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ，乙醇行脫蠟、水化處理后，蘇木素染液中浸泡染色，分別浸泡在鹽酸酒精，PBS 中分化、反藍(lán)，使用用伊紅染色后脫水封片。（2）PAS 染色：切片脫蠟水化并用高碘酸酒精溶液浸泡，置雪夫染液中室溫染色用亞硫酸溶液，蒸餾水沖洗待干，用甲綠復(fù)染，鹽酸酒精分化后脫水封片。（3）病理分級(jí)：在光學(xué)顯微鏡下評(píng)分，以0～3 的主觀等級(jí)評(píng)估支氣管周圍和血管周圍的炎癥程度［0 分：未觀察到炎癥時(shí)；1 分：偶見炎癥細(xì)胞；2 分：氣道或血管周圍不均勻分布的炎癥細(xì)胞或炎癥細(xì)胞圍繞成薄的環(huán)狀（層厚1～5 個(gè)炎癥細(xì)胞）；3 分：氣道或血管周圍分布均勻的炎癥細(xì)胞或炎癥細(xì)胞圍繞成厚的環(huán)狀（層厚＞5個(gè)炎癥細(xì)胞）］［8］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氣道滴注PM 可誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠以氣道炎癥為主的肺組織病理改變和BALF 中IL-6 和IL-8 的分泌

針對(duì)C57BL/6 小鼠肺組織進(jìn)行病理分級(jí)評(píng)分，PM 實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮細(xì)胞變厚，伴隨PM 在氣道內(nèi)的沉積，PM 實(shí)驗(yàn)組PAS 染色陽(yáng)性，病理分級(jí)顯著升高（P＜0.01），見圖1A、B。ELISA 結(jié)果顯示，PM 實(shí)驗(yàn)組 C57BL/6 小鼠BALF 中炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8顯著升高（P＜0.01），見圖1C、D。

2 PM 刺激可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中IL-6 和IL-8 mRNA和蛋白水平的變化

使用 200 mg/L 的 PM 刺激 BEAS-2B 細(xì)胞 3、6、12和24 h，real-time PCR 顯示該細(xì)胞中IL-6 和IL-8 mRNA 水平升高，在3 h 達(dá)到高峰（P＜0.01），之后呈時(shí)間依賴性降低，見圖2A、B。使用25、50、100、200和 400 mg/L 的 PM 刺激 BEAS-2B 細(xì)胞 24 h，ELISA 結(jié)果顯示IL-6 和IL-8 分泌水平顯著升高，在200 mg/L PM 刺激下達(dá)到高峰（P＜0.01），在25～200 mg/L 之間呈濃度依賴性升高，見圖2C、D。

3 PM 刺激對(duì)氣道上皮細(xì)胞PI3K 信號(hào)通路的活化和PI3K抑制劑在其中的阻斷作用

使用 200 mg/L 的 PM 刺激 BESA-2B 細(xì)胞 5、10 和15 min，Western blot 結(jié)果顯示，PM 可誘導(dǎo) Akt 蛋白磷酸化水平顯著升高，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，在15 min達(dá)到最高（P＜0.01），見圖3A。預(yù)先給予PI3K 抑制劑干預(yù)，Western blot 結(jié)果顯示，PM+LY294002 組p-Akt蛋白水平較PM組顯著降低（P＜0.05），見圖3B。

4 抑制PI3K 信號(hào)通路可部分逆轉(zhuǎn)PM 誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-6和IL-8分泌

預(yù)先給予PI3K 抑制劑LY294002 干預(yù)，然后使用 200 mg/L PM 刺激 BEAS-2B 細(xì)胞 24 h，ELISA 結(jié)果顯示，PI3K 抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)PM 誘導(dǎo)的IL-6 和IL-8 分泌，PM+LY294002 組 IL-6 和 IL-8 的分泌水平較PM組顯著降低（P＜0.01），見圖4。

討 論

空氣污染是我國(guó)目前嚴(yán)重危害健康的公共衛(wèi)生問題，作為空氣污染物中固態(tài)顆粒狀物質(zhì)和液態(tài)顆粒狀物質(zhì)的總稱，大氣PM 是近年來(lái)公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)［9］。呼吸系統(tǒng)是PM 進(jìn)入機(jī)體的主要途徑，由于粒徑小、重量輕和比表面積大，PM可以隨呼吸氣流廣泛沉積于氣道或肺泡［10］。流行病學(xué)調(diào)查揭示，PM 暴露與慢性氣道疾病、肺惡性腫瘤等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。既往研究過(guò)多聚焦PM 持續(xù)暴露下的氣道重構(gòu)或腫瘤惡性轉(zhuǎn)化［12］，針對(duì)PM 急性暴露下肺臟病理生理變化的研究相對(duì)缺乏?？紤]到PM 急性暴露下肺臟病理生理變化可能存在一定的可逆性，深入研究PM 急性暴露下肺臟的病理變化以尋找潛在的防治靶點(diǎn)具有重要意義。由于臨床上難以獲得PM 急性暴露的人體肺臟標(biāo)本，本研究采取PM 連續(xù)2 d氣道滴注的體內(nèi)模型以模擬臨床上PM 急性暴露，獲取小鼠肺臟組織進(jìn)行HE 染色和PAS 染色，結(jié)果顯示肺臟組織以氣道炎癥為主，具體病理改變包括氣道PM 沉積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和糖原染色陽(yáng)性，而并未觀察到氣道的結(jié)構(gòu)性改變，與Xu等［10］報(bào)道的相似。與此同時(shí)，針對(duì) C57BL/6 小鼠BALF 中炎癥介質(zhì)IL-6 和IL-8 的檢測(cè)，結(jié)果顯示BALF 中 IL-6 和 IL-8 分泌水平升高。已知 IL-6 和 IL-8是重要的炎癥介質(zhì)，可調(diào)控中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的募集和活化，在炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。既往研究認(rèn)為，在炎癥反應(yīng)中IL-6 和IL-8 主要來(lái)源于血液?jiǎn)魏?巨噬細(xì)胞系統(tǒng)［13］。目前逐漸認(rèn)識(shí)到氣道上皮細(xì)胞在氣道炎癥中扮演啟動(dòng)細(xì)胞和繼發(fā)受體的角色，而IL-6 和IL-8 同樣可以由氣道上皮細(xì)胞分泌并參與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。考慮到動(dòng)物模型中PM 急性暴露主要導(dǎo)致氣道炎癥為主，沒有明顯的肺泡損傷，本研究在細(xì)胞模型中采取了人氣道上皮細(xì)胞，以在體外實(shí)驗(yàn)中更深層次研究氣道上皮細(xì)胞的炎癥改變。結(jié)果顯示，PM刺激氣道上皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)IL-6 和IL-8 的分泌表達(dá)，我們推測(cè)來(lái)自氣道上皮的IL-6 和IL-8 以旁分泌的形式招募血液中的中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展?？紤]到PM 急性暴露下氣道炎癥尚未發(fā)生氣道重構(gòu)等變化，炎癥損傷具有一定的可逆性，深入研究其中的分子機(jī)制和尋找其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)可為PM 誘導(dǎo)氣道炎癥的防治提供參考資料。

Figure 1.Effect of PM exposure on the lungs of C57BL/6 mice.The C57BL/6 mice model was established by intratracheal instillation of PM for 2 consecutive days.A：representative images of lung sections with PAS staining；B：the inflammation scores for images of lung sections；C，D：the levels of IL-6 and IL-8 in the BALF measured by ELISA.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group.圖1 氣道滴注PM可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠以氣道炎癥為主的肺組織病理改變和BALF中IL-6和IL-8的分泌

Figure 2.PM exposure up-regulated the expression of IL-6 and IL-8.A，B：the relative mRNA levels of IL-6 and IL-8 in the BEAS-2B cells treated with 200 mg/L PM for 3，6，12 and 24 h；C，D：the concentrations of IL-6 and IL-8 in the culture supernatants of the BEAS-2B cells treated with 25，50，100，200 and 400 mg/L PM for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h or 0 mg/L group.圖2 PM刺激可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA和蛋白水平的變化

Figure 3.PM exposure induced phosphorylation of PI3K/Akt signaling pathway.A：the protein levels of p-Akt and Akt in the BEAS-2B cells exposed to PM（200 mg/L）for indicated time were measured by Western blot；B：the protein levels of p-Akt and Akt in the BEAS-2B cells exposed to PM with or without PI3K inhibitor LY294002 were measured by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 min or vehicle（no treatment）group；#P＜0.05 vs PM group.圖3 PM刺激對(duì)氣道上皮細(xì)胞PI3K信號(hào)通路的活化和PI3K抑制劑在其中的阻斷作用

Figure 4.PI3K inhibitor partially reversed the secretion of IL-6（A）and IL-8（B）in the BEAS-2B cells induced by PM.The BEAS-2B cells were pretreated with LY294002，and were subsequently exposed to PM for 24 h.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs vehicle（no treatment）group；##P＜0.01 vs PM group.圖4 PI3K抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)PM誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-6和IL-8分泌

已知PI3K 信號(hào)通路與細(xì)胞增殖凋亡、炎癥反應(yīng)、腫瘤惡性轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)，同時(shí)PI3K 信號(hào)通路的活化在肺部疾病的炎癥細(xì)胞聚集、炎癥介質(zhì)釋放和氣血屏障破壞中具有重要作用［14-15］。本研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PI3K 抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)PM 誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-6 和IL-8 分泌；與此同時(shí)，PM 可以誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞PI3K 信號(hào)通路的活化。以上結(jié)果表明，PI3K 信號(hào)通路在誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的分泌上發(fā)揮調(diào)控作用，與報(bào)道的PI3K 信號(hào)通路參與調(diào)控PM 誘導(dǎo)的 COX-2/PGE2表達(dá)相似［16］。相較于 PI3K 信號(hào)通路，文獻(xiàn)報(bào)道ERK 和P38等同樣介導(dǎo)了PM 誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)的分泌過(guò)程［17］，圍繞PI3K、ERK、P38等信號(hào)通路之間的聯(lián)系是后續(xù)的重點(diǎn)研究方向。

本研究尚存較多的不足之處：首先，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用PM 氣道滴注的方法雖然目前被廣泛使用，然而PM 氣道滴注不能完全反映PM 吸入的病理生理過(guò)程，后續(xù)的研究中我們正在嘗試進(jìn)行PM 霧化吸入的方法；其次，體外實(shí)驗(yàn)中僅僅選取了一個(gè)永生化的氣道上皮細(xì)胞株BEAS-2B，如能分離原代氣道上皮細(xì)胞則更能反映體內(nèi)的真實(shí)情況；最后，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，我們僅僅是證明了PI3K 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在其中的調(diào)控作用，針對(duì)PM 如何調(diào)控PI3K 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化并未深入涉及，以及沒有深入驗(yàn)證PI3K 抑制劑在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的效果。

綜上所述，本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示了PM 急性暴露下肺臟以氣道炎癥為主的病理改變，而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示了PI3K 信號(hào)通路介導(dǎo)PM 誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞IL-6 和IL-8 的分泌。本研究從動(dòng)物和細(xì)胞兩個(gè)層次模擬人群在PM 急性暴露下肺臟的病理生理改變，為闡明PM 誘導(dǎo)氣道炎癥的分子機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。