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    消腫止痛合劑對大鼠隨意皮瓣血管再生的影響*

    2021-02-05 01:02:44姚興璋何志軍李金鵬王海剛何元旭
    中國病理生理雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:阻斷劑消腫合劑

    劉 濤, 姚興璋, 何志軍△, 宋 淵 , 李 巖, 李金鵬,陳 文, 王海剛, 何元旭

    (1甘肅省中醫(yī)院,2甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅蘭州730050)

    皮瓣是重大創(chuàng)傷和整形外科重要的修復(fù)手段,然而皮瓣壞死屢見不鮮,因此盡快建立血液循環(huán)是皮瓣成活的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-Dll4/Notch 信號通路在血管再生中發(fā)揮著重要作用,近年被研究者重視。中醫(yī)藥在這方面的取得了一定的研究進(jìn)展。前期研究發(fā)現(xiàn),消腫止痛合劑能促進(jìn)鼠尾再植后的血管修復(fù),提高VEGF 表達(dá)水平[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)消腫止痛合劑可顯著降低軟組織中腫瘤壞死因子α 和白細(xì)胞介素6的水平,促進(jìn)皮瓣成活,降低轉(zhuǎn)化生長因子β1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 等炎癥因子水平,阻止外傷后炎癥介質(zhì)的釋放[2-3]。目前針對中醫(yī)藥通過VEGFDll4/Notch 信號通路調(diào)控皮瓣還鮮見報道。本研究采用大鼠隨意皮瓣模型,利用消腫止痛合劑及聯(lián)合VEGF-Dll4/Notch 信號通路阻斷劑干預(yù),觀察皮瓣邊緣血管數(shù)量,將進(jìn)一步揭示VEGF-Dll4/Notch 信號通路在皮瓣血管再生中的作用機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    240 只健康SD 大鼠購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號為SYXK(甘)2016-0012。VEGF 受體(VEGF receptor,VEGFR)抑制劑axitinib(AXI)和Notch 阻斷劑MK-0752 均購自Selleck;免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)I 抗試劑盒(BOSTER)。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動物分組 將240 只大鼠隨機(jī)分為6 組,空白(blank)組、假手術(shù)(sham)組、模型(model)組、消腫止痛合劑組(消腫組,detumescence 組)、消腫止痛合劑+AXI 組(detumescence+AXI 組)和消腫止痛合劑+MK-0752 組(detumescence+MK 組),每組 40 只。各組再按 4 個不同時點(diǎn)分為 5 d、10 d、15 d 和 20 d 亞組,每個亞組10只。

    2.2 動物模型的建立 除空白組外所有SD 大鼠禁食6~8 h。術(shù)前行水合三氯乙醛(3 mg/kg)腹腔麻醉,麻醉生效后,行俯臥位固定。于背部形成2 cm×8 cm蒂部位于雙側(cè)髂棘連線上的隨意皮瓣,皮瓣內(nèi)包括背部肉膜層,解剖應(yīng)在背部肌膜的淺面進(jìn)行。結(jié)扎創(chuàng)面較活躍出血點(diǎn),以確保所形成皮瓣為隨意型皮瓣。皮瓣形成后用1 號縫合線間斷原位縫合。待大鼠麻醉完全恢復(fù)后送回飼養(yǎng)籠、觀察,單籠飼養(yǎng)。術(shù)后每日早上肌注青霉素12×104U,連用3 d。

    2.3 藥物處理 消腫止痛合劑由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心制成,注冊文號為甘衛(wèi)普制準(zhǔn)字(1997)-202-04,批號為20051122,規(guī)格為每瓶250 mL。消腫組每日灌胃服用10 mL/kg 消腫止痛合劑(含生藥90 g/L);消腫+AXI 組每日灌胃服用 10 mL/kg 消腫止痛合劑和 0.03 g/kg 的 VEGFR 抑制劑 AXI;消腫+MK 組每日灌胃服用10 mL/kg消腫止痛合劑和0.03 g/kg的Notch 阻斷劑MK-0752;模型組、空白組和假手術(shù)組每日灌服相應(yīng)體積的蒸餾水。分別服藥5、10、15 和20 d 后分批麻醉并處死大鼠,剝離皮瓣組織多聚甲醛固定或-80℃保存,心臟取血離心分離血清。

    2.4 HE 染色 皮瓣組織經(jīng)多聚甲醛固定48 h 后,乙醇梯度脫水,二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋并切片。將脫水后的切片進(jìn)行脫蠟至水,蘇木素侵染5 min,流水沖洗5 min 后,鹽酸分化5 s,伊紅染液侵染5 min,流水沖洗5 min 后,樹脂封片并進(jìn)行拍照。利用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算皮瓣邊緣新生毛細(xì)血管的數(shù)量(每個高倍鏡視野下的陽性數(shù)目)、微血管密度(高倍鏡視野單位面積下微血管數(shù)目)、微血管管徑及血管成活面積。

    2.5 ELISA 檢測血清中VEGF 的含量 根據(jù)說明書運(yùn)用酶標(biāo)儀得出相關(guān)吸光度(A),再根據(jù)公式計(jì)算VEGF含量。

    2.6 RT-qPCR 檢測方法 將-80℃保存的皮瓣組織加入液氮研磨,呈粉末狀后,加入1 mL Trizol 裂解液,將細(xì)胞置于冰板裂解5 min 后,將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中-80℃保存。待所有樣品收集完畢后,Trizol 提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡPCR 試劑盒操作說明進(jìn)行。加樣體積按照說明書進(jìn)行,PCR 條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火,40 個循環(huán),每個循環(huán)31 s,最后進(jìn)行溶解階段。所有結(jié)果經(jīng)GAPDH 內(nèi)參照校正后,ΔΔCt 法計(jì)算最終結(jié)果并采用 2-ΔΔCt表示,引物序列見表1。

    表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊者兩組間的差異比較用SNK-q檢驗(yàn),方差不齊者兩組間的差異比較用Dunnett 法。以P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 皮瓣毛細(xì)血管充盈時間

    第5 天,模型組、消腫組、消腫+MK 組和消腫+AXI 組較空白組和假手術(shù)組毛細(xì)血管充盈時間均顯著延長(P<0.05);第10 天,與模型組相比,消腫組毛細(xì)血管充盈時間顯著縮短(P<0.05),而與消腫組相比,消腫+AXI 組的毛細(xì)血管充盈時間顯著延長(P<0.05);第15 和20 天所有組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖1。

    Figure 1.The results of capillary filling time.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs blank or sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖1 毛細(xì)血管充盈時間結(jié)果

    2 HE染色的觀察結(jié)果

    假手術(shù)組大鼠皮瓣組織細(xì)胞呈單層,排列有序、細(xì)胞核清晰;模型組大鼠皮瓣組織細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核稀疏,可見明顯水腫,大量白細(xì)胞浸潤;消腫組和消腫+MK 組大鼠皮瓣水腫明顯減輕,組織間隙炎癥細(xì)胞浸潤減少,見圖2~5。

    3 藥物處理后微血管數(shù)量、大血管數(shù)量、微血管密度、微血管內(nèi)徑和微血管面積的變化

    第5、10、15 和20 天時,與假手術(shù)組比較,模型組微血管數(shù)量、密度和面積均顯著增加,其中第10 天增加最明顯(P<0.05);與模型組比較,消腫組微血管數(shù)量、密度和面積增加,其中第10 天增加最明顯(P<0.05);與消腫組相比,消腫+AXI 組的微血管數(shù)量、密度和面積顯著減少(P<0.05);與消腫組相比,第5天和10 天消腫+MK 組的微血管數(shù)量和密度顯著增加(P<0.05);第5、10、15 和20 天大血管數(shù)量和微血管內(nèi)徑在所有組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見圖6~10。

    Figure 2 HE staining results after 5 d of drug treatment(×100).圖2 藥物處理5 d的HE染色結(jié)果

    Figure 3.HE staining results after 10 d of drug treatment(×100).圖3 藥物處理10 d的HE染色結(jié)果

    4 血清中VEGF含量的檢測結(jié)果

    第5 天時,模型組VEGF 含量較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05);當(dāng)加入消腫止痛合劑后,與模型組相比VEGF 含量顯著增加(P<0.05);然而加入VEGFR 抑制劑后,消腫止痛合劑引起的VEGF 增加消失,與消腫組相比,消腫+AXI 組VEGF 含量顯著降低(P<0.05);加入Notch 阻斷劑后,消腫止痛合劑引起的VEGF增加趨勢進(jìn)一步增加,然而消腫組與消腫+MK組之間并無顯著差異。第10、15 和20 天的結(jié)果與第5天類似。見圖11。

    5 皮瓣中 VEGFA、Notch 和 Dll4 mRNA 表達(dá)水平的檢測結(jié)果

    第 10 天 時 ,模 型 組 VEGFA、Notch 和 Dll4 的mRNA 表達(dá)量顯著增加,與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)利用消腫止痛合劑處理后,VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)量進(jìn)一步增加,與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);然而,當(dāng)加入VEGFR 抑制劑后,消腫止痛合劑引起的VEGFA、Notch和Dll4的mRNA 表達(dá)量增加的趨勢被顯著抑制,與消腫組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)加入Notch 阻斷劑后,消腫止痛合劑引起的VEGFA mRNA 表達(dá)量增加的趨勢更加明顯,而Notch 和Dll4 mRNA 表達(dá)量增加的趨勢被有效抑制(P<0.05),見圖12。第 15 天時 VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)量與第10天類似,見圖13。

    Figure 4.HE staining results after 15 d of drug treatment(×100).圖4 藥物處理15 d 的HE染色結(jié)果

    Figure 5.HE staining results after 20 d of drug treatment(×100).圖5 藥物處理20 d的HE染色結(jié)果

    討 論

    皮瓣技術(shù)是顯微外科和矯形外科手術(shù)中重要的技術(shù)之一,用于覆蓋腫瘤切除后大的創(chuàng)口、覆蓋開放性傷口、治療骨髓炎及整形[4-6]。但困擾醫(yī)生的是發(fā)生術(shù)后皮瓣壞死,有研究報道皮瓣壞死發(fā)生率為10%~15%[7]。隨意皮瓣受長寬比例限制,一般不超過2∶1,這就極大地限制了其臨床應(yīng)用。臨床總結(jié)認(rèn)為,血運(yùn)障礙為皮瓣壞死最主要的原因。因此,尋找更好的藥物和方法,改善皮瓣血運(yùn)狀況[8],盡快促進(jìn)皮瓣血管再生是提高皮瓣成活率的重中之重。

    瘀血或血瘀證是皮瓣修復(fù)術(shù)后并發(fā)血管危象的主要病理基礎(chǔ),活血化瘀法應(yīng)用于皮瓣修復(fù)術(shù)后體現(xiàn)了中醫(yī)辨病辨證施治的原則[9]?!盎钛奔椿钇溲},改善和促進(jìn)循環(huán)生理功能;“化瘀”即祛其瘀滯,緩解血凝狀態(tài),解除已經(jīng)發(fā)生的病理狀態(tài)。消腫止痛合劑為甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑,由川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地、當(dāng)歸、三七、木香、青皮、澤蘭等組成,具有活血化瘀、消腫止痛之功。組方中的川芍、紅花、赤芍、三七等藥物均有單體實(shí)驗(yàn)研究證明對血管有保護(hù)作用并具有抗凝作用;有研究證明川芎提取物川芎嗪可擴(kuò)張血管,增加冠脈血流及腦血流,抑制血小板聚集,降低血小板活性,為一種鈣拮抗劑[10-11]。

    血管再生是指原有的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走,形成新的血管網(wǎng),并在原來存在的血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學(xué)過程。VEGF 是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促血管再生的細(xì)胞因子,具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、促血管生成、延長血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命、提高血管通透性等生物學(xué)作用[12-13]。VEGF-Dll4/Notch 信號通路對血管再生調(diào)節(jié)的具體機(jī)制為:VEGFA 通過與VEGFR2 結(jié)合,刺激并誘導(dǎo)內(nèi)皮頂端細(xì)胞表達(dá)Dll4,Dll4 與鄰近柄細(xì)胞內(nèi)的Notch 信號結(jié)合,通過下調(diào)VEGFR2 和VEGFR1 的表達(dá)水平,抑制頂端細(xì)胞表型,促進(jìn)柄細(xì)胞特化,使二者之間保持在一個合適的比例,以確保血管出芽的精確性[14]。由此可見,VEGF 是 Dll4 的正向調(diào)節(jié)因素,而 Dll4 是 VEGF 信號的負(fù)向調(diào)節(jié)因素[15]。VEGF-Dll4/Notch 信號通路在腫瘤血管再生及抗腫瘤藥物治療方面的研究較多,但是在皮瓣血管再生方面卻未見報道。

    Figure 6.Changes in the number of microvessels.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖6 微血管數(shù)量的變化

    Figure 7.Changes in the number of large blood vessels.Mean±SD. n=6.圖7 大血管數(shù)量的變化

    Figure 8.Changes of microvascular density.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖8 微血管密度的變化

    Figure 9.Changes of microvascular diameter.Mean±SD. n=6.圖9 微血管的內(nèi)徑的變化

    Figure 10.Changes of microvascular area.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖10 微血管的面積的變化

    Figure 11.Determination of VEGF in rat serum.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖11 大鼠血清中VEGF含量的檢測結(jié)果

    Figure 12.The mRNA expression of VEGFA,Notch and Dll4 in flap tissues after 10 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖12 藥物處理10 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

    Figure 13.The mRNA expression of VEGFA,Notch and Dll4 in flap tissues after 15 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖13 藥物處理15 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

    本研究著重研究消腫止痛合劑對VEGF-Dll4/Notch 信號激活與血管新生的作用。皮瓣由于缺血缺氧的發(fā)生會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,造成不可逆的損傷,所以臨床治療中需要促進(jìn)血管的新生,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整。本研究發(fā)現(xiàn),消腫止痛合劑可顯著提高皮瓣成活率,HE染色顯示該藥可增加微血管數(shù)量、密度和面積,減輕炎癥反應(yīng),增強(qiáng)VEGF的表達(dá)。由于VEGF 是促進(jìn)血管形成的起始關(guān)鍵細(xì)胞因子,可激活Notch 和Dll4 信號,這樣的作用無疑是血管形成的關(guān)鍵。VEGFR 抑制劑可抑制VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)增加,Notch 信號阻斷劑引起對 Notch 和 Dll4 mRNA 的抑制,而 VEGFA 的mRNA 表達(dá)繼續(xù)增加。抑制Dll4/Notch 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過促進(jìn)新生血管和血管生成,提高皮瓣成活率。

    綜上所述,消腫止痛合劑可以通過調(diào)控VEGFDll4/Notch 信號,促進(jìn)大鼠皮瓣微血管數(shù)量、密度和面積增加,減輕皮瓣水腫,減少炎癥細(xì)胞浸潤,進(jìn)而促進(jìn)皮瓣的成活。本研究為消腫止痛合劑在皮瓣缺血缺氧治療方面的應(yīng)用提供了初步的研究基礎(chǔ)。

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