• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    消腫止痛合劑對大鼠隨意皮瓣血管再生的影響*

    2021-02-05 01:02:44姚興璋何志軍李金鵬王海剛何元旭
    中國病理生理雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:阻斷劑消腫合劑

    劉 濤, 姚興璋, 何志軍△, 宋 淵 , 李 巖, 李金鵬,陳 文, 王海剛, 何元旭

    (1甘肅省中醫(yī)院,2甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅蘭州730050)

    皮瓣是重大創(chuàng)傷和整形外科重要的修復(fù)手段,然而皮瓣壞死屢見不鮮,因此盡快建立血液循環(huán)是皮瓣成活的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-Dll4/Notch 信號通路在血管再生中發(fā)揮著重要作用,近年被研究者重視。中醫(yī)藥在這方面的取得了一定的研究進(jìn)展。前期研究發(fā)現(xiàn),消腫止痛合劑能促進(jìn)鼠尾再植后的血管修復(fù),提高VEGF 表達(dá)水平[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)消腫止痛合劑可顯著降低軟組織中腫瘤壞死因子α 和白細(xì)胞介素6的水平,促進(jìn)皮瓣成活,降低轉(zhuǎn)化生長因子β1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 等炎癥因子水平,阻止外傷后炎癥介質(zhì)的釋放[2-3]。目前針對中醫(yī)藥通過VEGFDll4/Notch 信號通路調(diào)控皮瓣還鮮見報道。本研究采用大鼠隨意皮瓣模型,利用消腫止痛合劑及聯(lián)合VEGF-Dll4/Notch 信號通路阻斷劑干預(yù),觀察皮瓣邊緣血管數(shù)量,將進(jìn)一步揭示VEGF-Dll4/Notch 信號通路在皮瓣血管再生中的作用機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    240 只健康SD 大鼠購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號為SYXK(甘)2016-0012。VEGF 受體(VEGF receptor,VEGFR)抑制劑axitinib(AXI)和Notch 阻斷劑MK-0752 均購自Selleck;免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)I 抗試劑盒(BOSTER)。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動物分組 將240 只大鼠隨機(jī)分為6 組,空白(blank)組、假手術(shù)(sham)組、模型(model)組、消腫止痛合劑組(消腫組,detumescence 組)、消腫止痛合劑+AXI 組(detumescence+AXI 組)和消腫止痛合劑+MK-0752 組(detumescence+MK 組),每組 40 只。各組再按 4 個不同時點(diǎn)分為 5 d、10 d、15 d 和 20 d 亞組,每個亞組10只。

    2.2 動物模型的建立 除空白組外所有SD 大鼠禁食6~8 h。術(shù)前行水合三氯乙醛(3 mg/kg)腹腔麻醉,麻醉生效后,行俯臥位固定。于背部形成2 cm×8 cm蒂部位于雙側(cè)髂棘連線上的隨意皮瓣,皮瓣內(nèi)包括背部肉膜層,解剖應(yīng)在背部肌膜的淺面進(jìn)行。結(jié)扎創(chuàng)面較活躍出血點(diǎn),以確保所形成皮瓣為隨意型皮瓣。皮瓣形成后用1 號縫合線間斷原位縫合。待大鼠麻醉完全恢復(fù)后送回飼養(yǎng)籠、觀察,單籠飼養(yǎng)。術(shù)后每日早上肌注青霉素12×104U,連用3 d。

    2.3 藥物處理 消腫止痛合劑由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心制成,注冊文號為甘衛(wèi)普制準(zhǔn)字(1997)-202-04,批號為20051122,規(guī)格為每瓶250 mL。消腫組每日灌胃服用10 mL/kg 消腫止痛合劑(含生藥90 g/L);消腫+AXI 組每日灌胃服用 10 mL/kg 消腫止痛合劑和 0.03 g/kg 的 VEGFR 抑制劑 AXI;消腫+MK 組每日灌胃服用10 mL/kg消腫止痛合劑和0.03 g/kg的Notch 阻斷劑MK-0752;模型組、空白組和假手術(shù)組每日灌服相應(yīng)體積的蒸餾水。分別服藥5、10、15 和20 d 后分批麻醉并處死大鼠,剝離皮瓣組織多聚甲醛固定或-80℃保存,心臟取血離心分離血清。

    2.4 HE 染色 皮瓣組織經(jīng)多聚甲醛固定48 h 后,乙醇梯度脫水,二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋并切片。將脫水后的切片進(jìn)行脫蠟至水,蘇木素侵染5 min,流水沖洗5 min 后,鹽酸分化5 s,伊紅染液侵染5 min,流水沖洗5 min 后,樹脂封片并進(jìn)行拍照。利用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算皮瓣邊緣新生毛細(xì)血管的數(shù)量(每個高倍鏡視野下的陽性數(shù)目)、微血管密度(高倍鏡視野單位面積下微血管數(shù)目)、微血管管徑及血管成活面積。

    2.5 ELISA 檢測血清中VEGF 的含量 根據(jù)說明書運(yùn)用酶標(biāo)儀得出相關(guān)吸光度(A),再根據(jù)公式計(jì)算VEGF含量。

    2.6 RT-qPCR 檢測方法 將-80℃保存的皮瓣組織加入液氮研磨,呈粉末狀后,加入1 mL Trizol 裂解液,將細(xì)胞置于冰板裂解5 min 后,將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中-80℃保存。待所有樣品收集完畢后,Trizol 提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡPCR 試劑盒操作說明進(jìn)行。加樣體積按照說明書進(jìn)行,PCR 條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火,40 個循環(huán),每個循環(huán)31 s,最后進(jìn)行溶解階段。所有結(jié)果經(jīng)GAPDH 內(nèi)參照校正后,ΔΔCt 法計(jì)算最終結(jié)果并采用 2-ΔΔCt表示,引物序列見表1。

    表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊者兩組間的差異比較用SNK-q檢驗(yàn),方差不齊者兩組間的差異比較用Dunnett 法。以P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 皮瓣毛細(xì)血管充盈時間

    第5 天,模型組、消腫組、消腫+MK 組和消腫+AXI 組較空白組和假手術(shù)組毛細(xì)血管充盈時間均顯著延長(P<0.05);第10 天,與模型組相比,消腫組毛細(xì)血管充盈時間顯著縮短(P<0.05),而與消腫組相比,消腫+AXI 組的毛細(xì)血管充盈時間顯著延長(P<0.05);第15 和20 天所有組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖1。

    Figure 1.The results of capillary filling time.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs blank or sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖1 毛細(xì)血管充盈時間結(jié)果

    2 HE染色的觀察結(jié)果

    假手術(shù)組大鼠皮瓣組織細(xì)胞呈單層,排列有序、細(xì)胞核清晰;模型組大鼠皮瓣組織細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核稀疏,可見明顯水腫,大量白細(xì)胞浸潤;消腫組和消腫+MK 組大鼠皮瓣水腫明顯減輕,組織間隙炎癥細(xì)胞浸潤減少,見圖2~5。

    3 藥物處理后微血管數(shù)量、大血管數(shù)量、微血管密度、微血管內(nèi)徑和微血管面積的變化

    第5、10、15 和20 天時,與假手術(shù)組比較,模型組微血管數(shù)量、密度和面積均顯著增加,其中第10 天增加最明顯(P<0.05);與模型組比較,消腫組微血管數(shù)量、密度和面積增加,其中第10 天增加最明顯(P<0.05);與消腫組相比,消腫+AXI 組的微血管數(shù)量、密度和面積顯著減少(P<0.05);與消腫組相比,第5天和10 天消腫+MK 組的微血管數(shù)量和密度顯著增加(P<0.05);第5、10、15 和20 天大血管數(shù)量和微血管內(nèi)徑在所有組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見圖6~10。

    Figure 2 HE staining results after 5 d of drug treatment(×100).圖2 藥物處理5 d的HE染色結(jié)果

    Figure 3.HE staining results after 10 d of drug treatment(×100).圖3 藥物處理10 d的HE染色結(jié)果

    4 血清中VEGF含量的檢測結(jié)果

    第5 天時,模型組VEGF 含量較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05);當(dāng)加入消腫止痛合劑后,與模型組相比VEGF 含量顯著增加(P<0.05);然而加入VEGFR 抑制劑后,消腫止痛合劑引起的VEGF 增加消失,與消腫組相比,消腫+AXI 組VEGF 含量顯著降低(P<0.05);加入Notch 阻斷劑后,消腫止痛合劑引起的VEGF增加趨勢進(jìn)一步增加,然而消腫組與消腫+MK組之間并無顯著差異。第10、15 和20 天的結(jié)果與第5天類似。見圖11。

    5 皮瓣中 VEGFA、Notch 和 Dll4 mRNA 表達(dá)水平的檢測結(jié)果

    第 10 天 時 ,模 型 組 VEGFA、Notch 和 Dll4 的mRNA 表達(dá)量顯著增加,與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)利用消腫止痛合劑處理后,VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)量進(jìn)一步增加,與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);然而,當(dāng)加入VEGFR 抑制劑后,消腫止痛合劑引起的VEGFA、Notch和Dll4的mRNA 表達(dá)量增加的趨勢被顯著抑制,與消腫組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)加入Notch 阻斷劑后,消腫止痛合劑引起的VEGFA mRNA 表達(dá)量增加的趨勢更加明顯,而Notch 和Dll4 mRNA 表達(dá)量增加的趨勢被有效抑制(P<0.05),見圖12。第 15 天時 VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)量與第10天類似,見圖13。

    Figure 4.HE staining results after 15 d of drug treatment(×100).圖4 藥物處理15 d 的HE染色結(jié)果

    Figure 5.HE staining results after 20 d of drug treatment(×100).圖5 藥物處理20 d的HE染色結(jié)果

    討 論

    皮瓣技術(shù)是顯微外科和矯形外科手術(shù)中重要的技術(shù)之一,用于覆蓋腫瘤切除后大的創(chuàng)口、覆蓋開放性傷口、治療骨髓炎及整形[4-6]。但困擾醫(yī)生的是發(fā)生術(shù)后皮瓣壞死,有研究報道皮瓣壞死發(fā)生率為10%~15%[7]。隨意皮瓣受長寬比例限制,一般不超過2∶1,這就極大地限制了其臨床應(yīng)用。臨床總結(jié)認(rèn)為,血運(yùn)障礙為皮瓣壞死最主要的原因。因此,尋找更好的藥物和方法,改善皮瓣血運(yùn)狀況[8],盡快促進(jìn)皮瓣血管再生是提高皮瓣成活率的重中之重。

    瘀血或血瘀證是皮瓣修復(fù)術(shù)后并發(fā)血管危象的主要病理基礎(chǔ),活血化瘀法應(yīng)用于皮瓣修復(fù)術(shù)后體現(xiàn)了中醫(yī)辨病辨證施治的原則[9]?!盎钛奔椿钇溲},改善和促進(jìn)循環(huán)生理功能;“化瘀”即祛其瘀滯,緩解血凝狀態(tài),解除已經(jīng)發(fā)生的病理狀態(tài)。消腫止痛合劑為甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑,由川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地、當(dāng)歸、三七、木香、青皮、澤蘭等組成,具有活血化瘀、消腫止痛之功。組方中的川芍、紅花、赤芍、三七等藥物均有單體實(shí)驗(yàn)研究證明對血管有保護(hù)作用并具有抗凝作用;有研究證明川芎提取物川芎嗪可擴(kuò)張血管,增加冠脈血流及腦血流,抑制血小板聚集,降低血小板活性,為一種鈣拮抗劑[10-11]。

    血管再生是指原有的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走,形成新的血管網(wǎng),并在原來存在的血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學(xué)過程。VEGF 是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促血管再生的細(xì)胞因子,具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、促血管生成、延長血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命、提高血管通透性等生物學(xué)作用[12-13]。VEGF-Dll4/Notch 信號通路對血管再生調(diào)節(jié)的具體機(jī)制為:VEGFA 通過與VEGFR2 結(jié)合,刺激并誘導(dǎo)內(nèi)皮頂端細(xì)胞表達(dá)Dll4,Dll4 與鄰近柄細(xì)胞內(nèi)的Notch 信號結(jié)合,通過下調(diào)VEGFR2 和VEGFR1 的表達(dá)水平,抑制頂端細(xì)胞表型,促進(jìn)柄細(xì)胞特化,使二者之間保持在一個合適的比例,以確保血管出芽的精確性[14]。由此可見,VEGF 是 Dll4 的正向調(diào)節(jié)因素,而 Dll4 是 VEGF 信號的負(fù)向調(diào)節(jié)因素[15]。VEGF-Dll4/Notch 信號通路在腫瘤血管再生及抗腫瘤藥物治療方面的研究較多,但是在皮瓣血管再生方面卻未見報道。

    Figure 6.Changes in the number of microvessels.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖6 微血管數(shù)量的變化

    Figure 7.Changes in the number of large blood vessels.Mean±SD. n=6.圖7 大血管數(shù)量的變化

    Figure 8.Changes of microvascular density.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖8 微血管密度的變化

    Figure 9.Changes of microvascular diameter.Mean±SD. n=6.圖9 微血管的內(nèi)徑的變化

    Figure 10.Changes of microvascular area.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖10 微血管的面積的變化

    Figure 11.Determination of VEGF in rat serum.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖11 大鼠血清中VEGF含量的檢測結(jié)果

    Figure 12.The mRNA expression of VEGFA,Notch and Dll4 in flap tissues after 10 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖12 藥物處理10 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

    Figure 13.The mRNA expression of VEGFA,Notch and Dll4 in flap tissues after 15 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs detumescence group.圖13 藥物處理15 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

    本研究著重研究消腫止痛合劑對VEGF-Dll4/Notch 信號激活與血管新生的作用。皮瓣由于缺血缺氧的發(fā)生會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,造成不可逆的損傷,所以臨床治療中需要促進(jìn)血管的新生,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整。本研究發(fā)現(xiàn),消腫止痛合劑可顯著提高皮瓣成活率,HE染色顯示該藥可增加微血管數(shù)量、密度和面積,減輕炎癥反應(yīng),增強(qiáng)VEGF的表達(dá)。由于VEGF 是促進(jìn)血管形成的起始關(guān)鍵細(xì)胞因子,可激活Notch 和Dll4 信號,這樣的作用無疑是血管形成的關(guān)鍵。VEGFR 抑制劑可抑制VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)增加,Notch 信號阻斷劑引起對 Notch 和 Dll4 mRNA 的抑制,而 VEGFA 的mRNA 表達(dá)繼續(xù)增加。抑制Dll4/Notch 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過促進(jìn)新生血管和血管生成,提高皮瓣成活率。

    綜上所述,消腫止痛合劑可以通過調(diào)控VEGFDll4/Notch 信號,促進(jìn)大鼠皮瓣微血管數(shù)量、密度和面積增加,減輕皮瓣水腫,減少炎癥細(xì)胞浸潤,進(jìn)而促進(jìn)皮瓣的成活。本研究為消腫止痛合劑在皮瓣缺血缺氧治療方面的應(yīng)用提供了初步的研究基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    阻斷劑消腫合劑
    我們?yōu)槭裁磿X得痛
    適配體在免疫性疾病靶向治療中的應(yīng)用
    自擬消腫方聯(lián)合冰硝散治療三踝骨折腫脹的療效觀察
    石硫合劑熬制與保存
    河北果樹(2020年2期)2020-05-25 06:58:58
    HPLC法同時測定退銀合劑中6種成分
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:54
    環(huán)境中的β-阻斷劑及其在污水處理中的工藝研究
    HPLC法同時測定婦康消腫丸中4種成分
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:54
    HPLC法同時測定二陳合劑中8種成分
    中成藥(2017年7期)2017-11-22 07:33:11
    宣痹祛風(fēng)合劑治療濕熱蘊(yùn)結(jié)型痛風(fēng)100例
    微絲解聚劑及微管阻斷劑對蘚羽藻細(xì)胞重建過程的影響
    狠狠狠狠99中文字幕| 欧美bdsm另类| 国产精品久久久久久久电影 | 天堂动漫精品| 欧美区成人在线视频| www国产在线视频色| 一个人观看的视频www高清免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产一区在线观看成人免费| 精品人妻1区二区| av中文乱码字幕在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 少妇的逼水好多| 日日夜夜操网爽| 人人妻人人看人人澡| 亚洲男人的天堂狠狠| e午夜精品久久久久久久| 精品电影一区二区在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国内精品久久久久精免费| 美女 人体艺术 gogo| av女优亚洲男人天堂| 日本a在线网址| 欧美bdsm另类| 久久精品人妻少妇| 又黄又爽又免费观看的视频| 男女那种视频在线观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲成av人片免费观看| 色播亚洲综合网| 男女视频在线观看网站免费| 极品教师在线免费播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 可以在线观看的亚洲视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美乱妇无乱码| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 精品电影一区二区在线| 日韩欧美 国产精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美黄色淫秽网站| 少妇的丰满在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产淫片久久久久久久久 | 成熟少妇高潮喷水视频| 天天添夜夜摸| 日韩欧美三级三区| 搡老岳熟女国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费av不卡在线播放| 免费av观看视频| 国产色婷婷99| 亚洲av不卡在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 人妻久久中文字幕网| 亚洲国产色片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 深夜精品福利| 亚洲国产精品999在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 91九色精品人成在线观看| 日韩欧美国产在线观看| av片东京热男人的天堂| 一本久久中文字幕| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 一区二区三区激情视频| 757午夜福利合集在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 色尼玛亚洲综合影院| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日本 欧美在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久久国产成人免费| 桃红色精品国产亚洲av| 精品国产美女av久久久久小说| 国产三级中文精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 18+在线观看网站| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲中文字幕日韩| 午夜福利在线在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产v大片淫在线免费观看| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 毛片女人毛片| 性欧美人与动物交配| 两个人看的免费小视频| 怎么达到女性高潮| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久久色成人| 在线观看午夜福利视频| 露出奶头的视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美成人a在线观看| 国产成人aa在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| xxx96com| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜福利在线在线| 宅男免费午夜| 丝袜美腿在线中文| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲av免费高清在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 此物有八面人人有两片| 成人三级黄色视频| 亚洲,欧美精品.| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产伦人伦偷精品视频| 精品人妻1区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成人av一区二区三区在线看| 91久久精品电影网| 一区二区三区高清视频在线| 身体一侧抽搐| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费无遮挡裸体视频| 一本综合久久免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久久精品大字幕| 丝袜美腿在线中文| 三级国产精品欧美在线观看| 九九在线视频观看精品| 一个人看的www免费观看视频| 91九色精品人成在线观看| 91在线观看av| 午夜日韩欧美国产| 免费av观看视频| 国产亚洲精品av在线| 在线观看舔阴道视频| 91在线观看av| 国产亚洲精品一区二区www| 9191精品国产免费久久| 色综合婷婷激情| 搡老熟女国产l中国老女人| 老司机深夜福利视频在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成人18禁在线播放| 精品久久久久久久久久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 女人被狂操c到高潮| 免费在线观看日本一区| 国产毛片a区久久久久| 大型黄色视频在线免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产一区二区在线观看日韩 | 十八禁网站免费在线| 成人午夜高清在线视频| 一进一出抽搐动态| av黄色大香蕉| svipshipincom国产片| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产成人欧美在线观看| x7x7x7水蜜桃| 观看免费一级毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 熟女电影av网| 国内揄拍国产精品人妻在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产男靠女视频免费网站| 免费电影在线观看免费观看| www.999成人在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人欧美在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 看免费av毛片| 一级黄色大片毛片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久人人精品亚洲av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品久久久久久久末码| 欧美中文日本在线观看视频| 日本一本二区三区精品| 在线国产一区二区在线| 国产综合懂色| 99热精品在线国产| 免费av不卡在线播放| 美女免费视频网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久性视频一级片| 国产精品 国内视频| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产色片| 国产精品久久久久久久久免 | 免费观看人在逋| 一本久久中文字幕| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 制服人妻中文乱码| 亚洲av五月六月丁香网| 美女大奶头视频| 少妇丰满av| 亚洲,欧美精品.| 成人特级av手机在线观看| 免费大片18禁| 亚洲精华国产精华精| 久久久久国内视频| 麻豆国产av国片精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一本精品99久久精品77| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 麻豆成人av在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 我要搜黄色片| 日本黄色片子视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 麻豆成人av在线观看| 此物有八面人人有两片| 色噜噜av男人的天堂激情| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 十八禁网站免费在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产亚洲欧美98| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久亚洲精品不卡| 久久精品国产清高在天天线| 欧美一区二区亚洲| 1024手机看黄色片| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美区成人在线视频| 丰满的人妻完整版| 午夜福利在线观看吧| 国产精品 欧美亚洲| h日本视频在线播放| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本与韩国留学比较| 久久久国产精品麻豆| 久久久久国内视频| 一级作爱视频免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 99久久99久久久精品蜜桃| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品影院6| 十八禁人妻一区二区| 日本黄色片子视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 看免费av毛片| 日本成人三级电影网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| а√天堂www在线а√下载| 国产v大片淫在线免费观看| 免费av观看视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久人人精品亚洲av| 午夜影院日韩av| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 麻豆国产av国片精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品亚洲美女久久久| 久久久久久九九精品二区国产| 久久99热这里只有精品18| 男女之事视频高清在线观看| 国产成人av教育| 午夜久久久久精精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一边摸一边抽搐一进一小说| 好男人在线观看高清免费视频| 性欧美人与动物交配| 成人一区二区视频在线观看| 少妇高潮的动态图| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲av美国av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成人午夜高清在线视频| 操出白浆在线播放| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲美女黄片视频| а√天堂www在线а√下载| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美中文综合在线视频| 韩国av一区二区三区四区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 一区二区三区免费毛片| 免费人成在线观看视频色| 此物有八面人人有两片| 我要搜黄色片| 黄色片一级片一级黄色片| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99在线人妻在线中文字幕| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一个人看视频在线观看www免费 | www.www免费av| 欧美一级毛片孕妇| 欧美一级毛片孕妇| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 久久香蕉国产精品| 女人被狂操c到高潮| 亚洲色图av天堂| 高清日韩中文字幕在线| 99在线视频只有这里精品首页| 国产高清videossex| 免费人成在线观看视频色| 黄色日韩在线| 一级a爱片免费观看的视频| 国产高清有码在线观看视频| 色视频www国产| 99久久99久久久精品蜜桃| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本 欧美在线| 99热这里只有是精品50| 久久精品人妻少妇| 十八禁网站免费在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91麻豆av在线| 国产极品精品免费视频能看的| 露出奶头的视频| 国产真实乱freesex| 国产综合懂色| 精品不卡国产一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一级毛片女人18水好多| 嫩草影视91久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 男女床上黄色一级片免费看| 日本 欧美在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线观看av片永久免费下载| 波多野结衣高清作品| 麻豆国产av国片精品| 国产色婷婷99| 国产高潮美女av| 成人特级av手机在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜视频国产福利| av中文乱码字幕在线| 超碰av人人做人人爽久久 | 男人和女人高潮做爰伦理| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲av电影在线进入| 一本久久中文字幕| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美不卡视频在线免费观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美中文综合在线视频| 激情在线观看视频在线高清| av欧美777| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩综合久久久久久 | 偷拍熟女少妇极品色| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品亚洲美女久久久| 美女大奶头视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产v大片淫在线免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 少妇丰满av| 久久精品91无色码中文字幕| 一本精品99久久精品77| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲18禁久久av| 在线观看免费午夜福利视频| 看黄色毛片网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 午夜福利视频1000在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 少妇的逼好多水| 俺也久久电影网| 精品久久久久久成人av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 美女黄网站色视频| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 两个人的视频大全免费| 91麻豆精品激情在线观看国产| 免费看十八禁软件| 中文字幕久久专区| eeuss影院久久| 久9热在线精品视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品,欧美在线| 国产69精品久久久久777片| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲美女视频黄频| 无人区码免费观看不卡| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产 一区 欧美 日韩| 午夜福利高清视频| 国产精品 国内视频| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久成人免费电影| 两人在一起打扑克的视频| 熟女电影av网| 18禁美女被吸乳视频| 可以在线观看毛片的网站| 久久久成人免费电影| 黄色片一级片一级黄色片| 成人永久免费在线观看视频| 日本五十路高清| 天天躁日日操中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲五月天丁香| 国产探花在线观看一区二区| 美女大奶头视频| 成人av在线播放网站| 国产综合懂色| xxxwww97欧美| 麻豆成人av在线观看| 有码 亚洲区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国内精品美女久久久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 级片在线观看| 亚洲 国产 在线| 成人无遮挡网站| 波多野结衣巨乳人妻| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美中文日本在线观看视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 最后的刺客免费高清国语| 韩国av一区二区三区四区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 在线观看日韩欧美| 日本熟妇午夜| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产日本99.免费观看| 老司机在亚洲福利影院| www.999成人在线观看| 色在线成人网| 一本久久中文字幕| 久久精品国产综合久久久| 黄色女人牲交| 一级黄片播放器| av福利片在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 国产久久久一区二区三区| 久久久久久九九精品二区国产| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美+日韩+精品| 国产高清视频在线观看网站| www国产在线视频色| 身体一侧抽搐| 夜夜爽天天搞| 免费人成在线观看视频色| 一级a爱片免费观看的视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲电影在线观看av| 俺也久久电影网| 日本成人三级电影网站| 久久久久久久精品吃奶| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 青草久久国产| 一个人看视频在线观看www免费 | 成人18禁在线播放| 亚洲国产精品999在线| 国内精品久久久久久久电影| 好男人电影高清在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩av在线大香蕉| www日本在线高清视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产亚洲精品av在线| 97超视频在线观看视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 免费观看的影片在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 69av精品久久久久久| 日本熟妇午夜| 香蕉丝袜av| 欧美日本视频| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久亚洲精品不卡| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色在线成人网| 一进一出抽搐动态| 日韩欧美 国产精品| 亚洲黑人精品在线| 免费一级毛片在线播放高清视频| eeuss影院久久| 99久久精品国产亚洲精品| 悠悠久久av| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲色图av天堂| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日日夜夜操网爽| 一二三四社区在线视频社区8| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 老鸭窝网址在线观看| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产成人系列免费观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产一级毛片七仙女欲春2| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 国模一区二区三区四区视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲不卡免费看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产97色在线日韩免费| 此物有八面人人有两片| 少妇人妻精品综合一区二区 | 日韩av在线大香蕉| 白带黄色成豆腐渣| 日本 欧美在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 色播亚洲综合网| 小说图片视频综合网站| 精品久久久久久久末码| 婷婷精品国产亚洲av| 成人午夜高清在线视频| 久久精品国产综合久久久| 波多野结衣高清作品| 怎么达到女性高潮| 日本精品一区二区三区蜜桃| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美最黄视频在线播放免费| 天堂√8在线中文| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品一及| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费av毛片视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品人妻1区二区| 美女高潮的动态| 精品久久久久久,| 国产成人欧美在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 18+在线观看网站| or卡值多少钱| 中文资源天堂在线| 极品教师在线免费播放| 亚洲一区二区三区不卡视频| 两个人视频免费观看高清| 亚洲av二区三区四区| 免费看十八禁软件| 亚洲电影在线观看av| 毛片女人毛片| 不卡一级毛片| 在线观看日韩欧美| 国产乱人视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 97碰自拍视频| 亚洲欧美激情综合另类| 伊人久久大香线蕉亚洲五| bbb黄色大片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产视频内射| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲精品456在线播放app | 99在线视频只有这里精品首页| 1000部很黄的大片| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲专区中文字幕在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 99国产综合亚洲精品| 成人永久免费在线观看视频| 搡老妇女老女人老熟妇|