大鼠肝纖維化與microRNA-181a調(diào)控肝星狀細胞自噬的關(guān)系*

陳 靖， 鄭 琦， 陳 薇， 賴瑞敏， 朱月永

（福建醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝病中心，福建醫(yī)科大學肝病研究所，福建福州350005）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝臟受到各種致病因素（包括病毒、酒精、代謝及免疫等）持續(xù)刺激，引起細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）彌漫性過度沉積的一種“創(chuàng)傷愈合”修復過程。HF 是各種慢性肝病進展為肝硬化甚至肝癌的關(guān)鍵步驟，也是影響預后的重要環(huán)節(jié)。HF 的形成機制復雜，除了針對某些肝病的病因治療以外，迄今仍無有效或公認的抗HF 治療方法用于臨床。研究顯示，HF 及少部分肝硬化加以干預后從組織學上是可逆轉(zhuǎn)的［1］。

肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）是各種慢性肝損傷過程中產(chǎn)生ECM 的主要細胞，目前肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）仍是各種臨床和實驗性 HF 模型中 MFB 的主要來源［2］。HSCs 活化后轉(zhuǎn)化為具有纖維性和明顯收縮性的MFB，并分泌大量趨化因子和細胞因子，這一病理生理變化被認為是HF發(fā)生與發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［3］。細胞自噬是一種細胞自我吞噬的程序性死亡，在許多纖維化疾病及腫瘤的病理過程中起著關(guān)鍵作用。異常的自噬活動會導致HF 的發(fā)生，其主要途徑是促進HSCs 的活化和增殖［4］，但目前尚不清楚HSCs 自噬是如何被觸發(fā)的。微小RNA（microRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，具有調(diào)控靶基因表達的功能，參與生命過程中一系列重要進程（如細胞分化、增殖、死亡等）［5］。表達異常的microRNAs 可以通過RNA 干擾途徑影響自噬水平，使microRNAs成為近年來自噬研究的新動向［6］。

microRNAs 對HF 的發(fā)病過程也起著重要的調(diào)節(jié)作用，若干microRNAs 可調(diào)控參與HF 形成的細胞因子，或通過調(diào)控HSCs 的活化、增殖和凋亡等，促進或減緩HF進程［7-8］。我們前期研究顯示，慢性乙型肝炎患者血清與肝組織中microRNA-181a 表達水平隨HF程度加重而逐漸增高，高峰出現(xiàn)在III期HF（肝硬化前期）患者中［9］。因此，本研究通過四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）建立大鼠 HF 模型，并在體外誘導自噬以及在細胞水平進行干預實驗，探討microRNA-181a 是否通過調(diào)控自噬而活化HSCs，以期為早期評估HF 提供潛在的生物標志物，并為以microRNA-181a為靶點的抗纖維化治療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動物和細胞

SPF 級雄性 Wistar 大 鼠 40 只，8 周齡，體重（200±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（滬）2017-0005。大鼠肝星狀細胞系HSC-T6（ATCC細胞庫，貨號Y-01626）。

2 主要試劑

CCl4、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、MTT 和DTT（Sigma）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX Taq 試劑盒（TaKaRa）；兔抗鼠β-actin 單克隆抗體（Santa Cruz）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔II 抗和羊抗鼠 II 抗及TGF-β1 ELISA 試劑盒（北京中杉金橋公司）；PVDF 膜（Millipore）；Protein Molecular Weight Marker 和 Trizol 試劑盒（Thermo）；蛋白定量檢測試劑盒和 Protease Inhibitor Cocktail（Life）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000（Invitrogen）；LC3-I、LC3-II、beclin-1 和 α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（Abcam）；I型膠原（collagen type I，Col I）及Ⅲ型膠原（collagen type Ⅲ，Col Ⅲ）單克隆抗體（Santa Cruz）；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。microRNA-181a inhibitor（microRNA-181a-i）和 inhibitor negative control（NC-i）由中國上海吉凱公司提供；microRNA-181a 和U6 引物的設(shè)計與合成由中國上海博尚公司完成，見表1。

3 主要方法

3.1 動物分組及HF 模型制備 以單純CCl4法誘導大鼠 HF 模型［10］。40 只大鼠適應性喂養(yǎng) 1 周后，隨機分為空白對照（control）組和 CCl4誘導 HF 模型 2 周（W2）、4 周（W4）、6 周（W6）及 8 周（W8）組，每組 8只。control 組皮下注射3 mL/kg 的橄欖油；W2、W4、W6 及 W8 組皮下注射 3 mL/kg 的 40%CCl4（4∶6 混合橄欖油），每周2 次，分別連續(xù)作用2、4、6 及8 周；各組于飼養(yǎng)周期末處死存活大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，分離血清后-70℃冰箱保存；取肝左葉相同部位組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定送病理及免疫組化檢查，另取肝右葉相同部位組織，液氮冷凍后-70℃冰箱保存。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

3.2 肝組織Masson 染色及纖維化評估 大鼠肝組織石蠟包埋后常規(guī)脫蠟至水，加Masson 復合液5 min，流水洗2～5 min，加0.2%醋酸處理1 min×2，流水洗1 min，加1%磷鎢酸5～10 min，流水洗1 min，加亮綠染色液復染15 min，流水洗2～3 min，0.2%醋酸處理1 min×2，流水洗1～2 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，鏡下觀察：肝細胞胞漿呈紅色，膠原呈藍綠色。取Masson 染色切片，每個切片隨機取5 個視野（物鏡×10），以藍色膠原沉積為陽性信號，用Image-Pro Plus 5.0 圖像分析軟件計算膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）。

3.3 ELISA 檢測血清及肝組織中TGF-β1 水平 根據(jù)ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠血清及肝組織中TGF-β1含量。

3.4 RT-qPCR 檢測血清及肝組織中microRNA-181a的表達 參照Trizol 試劑盒說明書提取大鼠血清及肝組織總RNA，按照說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；參照SYBR Premix EX Taq 試劑盒操作說明進行qPCR，總反應體積為20 μL，擴增參數(shù)為：95℃ 5 min；95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。以 U6 為內(nèi)參照，以 2-ΔΔCt法計算microRNA-181a的相對表達水平。

3.5 Western blot 法檢測肝組織 LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 蛋白表達 取大鼠肝組織加組織裂解液進行勻漿，加等體積2× SDS，充分振搖15 s，沸水浴中加熱 10 min，4℃、12 000×g離心 10 min，取上清液，10% SDS-PAGE 分離 2～3 h，半干式轉(zhuǎn)膜 1 h，將 PVDF 膜置于含 3%BSA 的 TBST 中，室溫放置30 min；按說明書加抗LC3-II、LC3-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 抗體，4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜5 min×3 次，加相應的II 抗（1∶5 000），37℃孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×3 次，曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)分析。以β-actin為內(nèi)參照，以目的蛋白吸光度（A）值/β-actinA值表示目的蛋白水平。

3.6 不同濃度TGF-β1 誘導HSC-T6 細胞自噬 以TGF-β1誘導HSC-T6細胞自噬［11］。HSC-T6細胞接種于 6 孔培養(yǎng)板（2×104cells/well），第 2 天更換無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，予TGF-β1 梯度處理，終濃度依次為0、1、2、5 和10 μg/L，每個濃度設(shè)5 個復孔，繼續(xù)孵育24 h 后收集細胞，進行后續(xù)檢測。

3.7 細胞分組及培養(yǎng) HSC-T6 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板（2 ×104cells/well），至細胞達40%～60%匯合度時分為5 組：（1）control 組，采用正常細胞培養(yǎng)；（2）microRNA-181a-i組及NC-i組，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 操作說明書并參考文獻［12］，分別轉(zhuǎn)染濃度為 50 nmol/L 的 microRNA-181a-i 和 NC-i 4 h；（3）TGF-β1組，更換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液；（4）3-MA 組，參考文獻［13］加濃度為 10 mmol/L 的 3-MA 孵育45 min。除control組外，其余各組均加TGF-β1（根據(jù)3.6 篩選的最佳濃度）繼續(xù)孵育24 h。每組設(shè)5 個復孔，同步收集細胞進行后續(xù)檢測。

3.8 RT-qPCR 檢 測 HSC-T6 細 胞 microRNA-181a 表達 參照Trizol 試劑盒說明書提取HSC-T6 細胞總RNA，其他步驟參見血清及肝組織RT-qPCR檢測法。

3.9 Western blot 法檢測 HSC-T6 細胞 LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和 Col Ⅲ蛋白表達 HSC-T6 細胞干預完成后，棄細胞培養(yǎng)基，加TBS（2 mL/well）漂洗1 次，將6 孔培養(yǎng)板于濾紙上輕拍2～3 次后置于冰板上，加入熱裂解緩沖液1× SDS（300 μL/well），細胞刷刮動數(shù)次，將細胞裂解液移至1.5 mL 的EP 管，沸水浴中加熱10 min，12 000×g離心10 min，取上清液至新的EP 管，-70℃保存待測。其他步驟參見肝組織Western blot法檢測。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；兩變量間相關(guān)分析采用Spearman 相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 CCl4誘導建立大鼠HF模型

Masson染色顯示，control組肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀規(guī)則排列，組織間隙中未見到藍綠色組織；W2 組肝小葉結(jié)構(gòu)較規(guī)則，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀較規(guī)則排列，組織間隙中可見少量藍綠色組織；W4 和W6 組肝小葉結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肝細胞于中央靜脈周圍不呈放射狀排列，組織間隙中可見中等量藍綠色組織；W8 組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，組織間隙中可見大量藍綠色組織，見圖1A。肝組織膠原分析結(jié)果顯示，CCl4可呈時間依賴性促進肝組織膠原沉積，與control 組相比，W2 組肝組織CVF 顯著增加（P＜0.05），W4、W6 和W 8 組肝組織CVF進一步增加（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1.Liver pathological changes induced by CCl4 for 2～8 weeks in rats.Masson staining method was used to show the collagen fibrils in liver tissue（scale bar=25 μm），and the volume fraction of collagen was analyzed.a：control group；b：W2 group；c：W4 group；d：W6 group；e：W8 group.Mean±SD. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 CCl4誘導的大鼠肝臟組織病理學改變

2 CCl4對大鼠血清及肝組織TGF-β1水平的影響

ELISA 結(jié)果顯示，CCl4呈時間依賴性地促進大鼠血清及肝組織中TGF-β1 含量增加。與control 組相比，W2 組大鼠血清及肝組織中TGF-β1 水平均顯著增加（P＜0.05）；W4、W6 和W8 組進一步增加（P＜0.01），見表2。

表2 CCl4對大鼠血清及肝組織中TGF-β1水平的影響Table 2.The effects of CCl4 on the protein levels of TGF-β1 in serum and liver tissue of rats（Mean±SD. n=8）

3 CCl4對大鼠肝組織中microRNA-181a 表達水平及 LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col Ⅲ蛋白水平的影響

RT-qPCR 與 Western blot 結(jié)果顯示，CCl4呈時間依賴性地上調(diào)大鼠肝組織microRNA-181a 表達水平以及LC3-II/-I 比值、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 蛋白水平。與control組相比，W2組肝臟組織中microRNA-181a 表達水平及LC3-II/-I 比值、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 水平均顯著增加（P＜0.05）；W8 組 microRNA-181a 表達水平較W6 組下降，但并無顯著差異；W8 組 LC3-II/-I 比值及 beclin-1 水平較 W6 組顯著下降（P＜0.01），見圖2。大鼠肝組織microRNA-181a表達水平與 LC3-II/-I 比值、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col Ⅲ水平呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），r值分別為0.748、0.539、0.724、0.829及0.836。

4 不同濃度TGF-β1 對HSC-T6 細胞自噬及microRNA-181a表達水平的影響

Western blot 與RT-qPCR 檢測結(jié)果分別顯示：TGF-β1 呈濃度依賴性地促進HSC-T6 細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II/-I 比值、beclin-1 水平以及microRNA-181a 表達水平上調(diào)；與 TGF-β1 0 μg/L 處理組相比，TGF-β1 1、2、5 和 10 μg/L 處理組LC3-II/-I 比值和beclin-1水平以及microRNA-181a表達水平均顯著增加（P＜0.05）；與 TGF-β1 5 μg/L 處理組相比，TGF-β1 10 μg/L 處理組 LC3-II/-I 比值和 beclin-1（P＜0.05）水平顯著下降，但microRNA-181a 表達水平并無顯著性差異，見圖3。因此，本研究以5 μg/L 為TGF-β1誘導HSC-T6細胞自噬的最佳濃度進行后續(xù)實驗。

Figure 2.The effects of CCl4 on the expression of microRNA-181a，LC3-II/-I，beclin-1，α-SMA，Col I and Col III in rat liver tissue.A：RT-qPCR was used to measure the microRNA-181a level；B：Western blot was used to measure the expression levels of LC3-II/-I，beclin-1，α-SMA，Col I and Col III.Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs control group；▲▲P＜0.01 vs W6 group.圖2 CCl4對大鼠肝臟組織中microRNA-181a表達水平及LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I和Col Ⅲ蛋白水平的影響

5 microRNA-181a-i 對 TGF-β1 誘導 HSC-T6 細胞自噬和microRNA-181a表達水平的影響

RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，TGF-β1 組和 NC-i 組 HSC-T6 細胞 microRNA-181a 表達水平均顯著升高（P＜0.01），microRNA-181a-i 組microRNA-181a 水平較 NC-i 組顯著下降（P＜0.01），NC-i 組和 3-MA 組較 TGF-β1 組并無顯著差異，見圖4A。Western blot 檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，TGF-β1組和NC-i組HSC-T6細胞LC3-II/-I比值和beclin-1水平均顯著升高（P＜0.01），NC-i組LC3-II/-I比值和beclin-1 水平較TGF-β1 組并無顯著差異，microRNA-181a-i 組 LC3-II/-I 比值和 beclin-1 水平均較NC-i 組顯著下降（P＜0.01），microRNA-181a-i 組LC3-II/-I 比值較 3-MA 組顯著下降（P＜0.05），但 beclin-1水平并無顯著差異，見圖4B。

6 microRNA-181a-i 對 TGF-β1 誘導 HSC-T6 細胞活化的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，TGF-β1 組和 NC-i 組 HSC-T6 細胞 α-SMA、Col I 及 ColⅢ水平均顯著升高（P＜0.01），但 TGF-β1 組與 NC-i組間均無顯著差異；與NC-i組相比，microRNA-181a-i組及 3-MA 組 HSC-T6 細胞 α-SMA、Col I 及 Col Ⅲ水平均顯著下降（P＜0.01），但microRNA-181a-i 組與3-MA組間并無顯著差異，見圖5。

Figure 3.The effects of different concentrations of TGF-β1 on the expression of LC3-II/-I，beclin-1 and microRNA-181a in HSC-T6 cells detected by Western blot and RT-qPCR.Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 μg/L group；#P＜0.05 vs 5 μg/L group.圖3 不同濃度 TGF-β1 對HSC-T6 細胞LC3-II/-I 和 beclin-1蛋白水平及microRNA-181a表達水平的影響

Figure 4.The effect of microRNA-181a-i on the expression of LC3-II/-I，beclin-1 and microRNA-181a in HSC-T6 cells treated with TGF-β1（5 μg/L）.A：RT-qPCR was used to measure microRNA-181a expression；B：Western blot was used to measure the protein levels of LC3-II/-I and beclin-1.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs NC-i group；☆P＜0.05 vs microRNA-181a-i group.圖4 microRNA-181a-i對TGF-β1誘導HSC-T6細胞自噬和microRNA-181a表達水平的影響

Figure 5.The effects of microRNA-181a-i on activation of HSC-T6 cells treated with TGF-β1（5 μg/L）.Western blot was used to measure the protein levels of α-SMA，Col I and Col Ⅲ.Mean±SD. n=5.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs NC-i group.圖5 microRNA-181a-i對TGF-β1誘導HSC-T6細胞活化的影響

討 論

HF 的形成是一個多因素影響、多細胞因子參與的極為復雜的病理生理過程，個體化差異也較大，臨床針對病因治療并不能完全抑制肝臟炎癥和治療HF。近年來研究表明，碧蘿芷通過下調(diào)ERK 磷酸化介導的細胞自噬，可抑制TGF-β1 誘導的HSCs 活化［14］。在CCl4和膽管結(jié)扎誘導小鼠HF 模型的研究中表明，槲皮素［15］與紅景天甙［16］可通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路，抑制HSCs 自噬及活化，減輕小鼠HF。然而，在以抑制HSCs 活化為中心的抗HF 治療方面，除了經(jīng)典的致HF 信號轉(zhuǎn)導途徑外，包括自噬和表觀遺傳在內(nèi)新的機制與通路的研究并不多。

本研究通過皮下注射CCl4構(gòu)建大鼠HF 模型，病理組織學檢查結(jié)果顯示模型組大鼠肝組織均出現(xiàn)不同程度HF，并與造模時間呈正相關(guān)，提示大鼠HF 模型成功復制。此外，模型組大鼠肝組織TGF-β1 和microRNA-181a 的表達水平、自噬標志性蛋白LC3-II/-I 的比值及beclin-1 的水平均隨HF 程度加重而呈上升趨勢，且microRNA-181a 表達水平與細胞自噬呈正相關(guān)，提示在HF啟動及進展過程中，TGF-β1和microRNA-181a 表達與肝細胞自噬之間可能存在某種病理、生理上相關(guān)聯(lián)的機制，值得進一步探討。

目前普遍認為，TGF-β 是強效的致纖維化細胞因子，在纖維化的啟動和進展中起關(guān)鍵作用［17］。人體內(nèi) TGF-β1 為 TGF-β 超家族主要成員，可在肝臟炎癥前期、炎癥及炎癥后階段通過“三步級聯(lián)反應”刺激HSCs活化并轉(zhuǎn)化成MFB［18］，后者能大量合成ECM并逐漸沉積，啟動HF 進程。在此進程中涉及多條信號通路并相互影響。以往研究顯示，TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導為 TGF-β1 刺激 HSCs 活化的主要通路［19］。近年來有研究顯示，HSCs 活化依賴于自噬活性，活化的HSCs 大量增殖并產(chǎn)生大量膠原纖維時，也需要通過自噬降解過程來提供能量［20］。另有報道，TGF-β通過不同途徑參與了肝癌細胞、乳腺癌細胞、腎小球基底膜細胞及成骨細胞等的自噬調(diào)控［21］。然而，TGF-β1 是否基于自噬促進HSCs 活化少有報道。本研究體外實驗顯示，TGF-β1 呈濃度依賴性地促進HSC-T6 自噬標志性蛋白LC3-II/-I 比值及beclin-1 水平增高，α-SMA、Col I和Col Ⅲ蛋白水平也顯著增高，提示TGF-β1 能體外誘導HSCs 自噬及活化，這一結(jié)果與王冰瑩等［22］報道結(jié)論較為一致。本研究顯示，TGF-β1 體外誘導 HSCs 自噬最佳濃度為 5 μg/L，當TGF-β1 濃度增加至 10 μg/L 時 HSCs 自噬相對下降，提示TGF-β1 僅在一定濃度范圍誘導HSCs 自噬，這與 Fu 等［11］報道的現(xiàn)象較為一致，但 TGF-β1 體外誘導HSCs 自噬的最佳濃度有差異，推測這可能與本研究以LC3-II/-I 比值而非LC3-II 抗體表達水平作為評估細胞自噬強弱有關(guān)。此外，本研究顯示，在CCl4誘導大鼠嚴重HF 時TGF-β1 表達進一步升高，但細胞自噬有所減少，而高峰出現(xiàn)在嚴重HF 前期，提示在肝臟炎癥前期與炎癥期針對細胞自噬的調(diào)控可能為防治HF進展的合適時間窗。

研究顯示，HSC-T6 細胞經(jīng) TGF-β1 處理后 microRNA-181a 表達顯著上調(diào)，進而誘導HSC-T6 細胞活化［12］。以往有報道顯示，microRNA-181a能減弱饑餓和雷帕霉素在乳腺癌MCF-7細胞、人類肝癌Huh-7細胞及慢性髓原白血病K562 細胞中誘導的自噬［23］；還能調(diào)控NR8383 大鼠肺泡巨噬細胞自噬紊亂與促炎因子生成［24］。然而，不同類型細胞的自噬在肝損傷及HF 過程中扮演不同角色，microRNA-181a 是否通過調(diào)控HSC自噬進而誘導其活化尚未見報道。本研究顯示，TGF-β1 體外誘導 HSC-T6 自噬及活化時伴有microRNA-181a 表達顯著上調(diào)；在轉(zhuǎn)染microRNA-181a-i 后 microRNA-181a 表達顯著下降，HSC-T6自噬及活化顯著受到抑制，這一現(xiàn)象與自噬抑制劑3-MA 作用結(jié)果相似。據(jù)此，我們推測microRNA-181a 為 TGF-β1 下游信號分子，介導了 HSCs 自噬及活化，這可能是TGF-β1 促進HSCs 活化在表觀遺傳的一種調(diào)控機制。

綜上所述，隨著CCl4誘導模型大鼠HF 的進展，大鼠肝組織中TGF-β1和microRNA-181a表達及自噬水平呈同步增高；下調(diào)HSC-T6 細胞microRNA-181a表達水平可抑制TGF-β1 誘導HSC-T6 細胞自噬與活化；大鼠 HF 與 microRNA-181a 調(diào)控 HSCs 自噬有關(guān)。本研究可能為基于microRNA-181a水平調(diào)控HSCs自噬和活化，以及抗HF靶點治療提供實驗基礎(chǔ)。