Wnt1和LGR5在顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜中的表達(dá)變化*

周小嬪， 王衍廷， 劉 斌△

（1武警特色醫(yī)學(xué)中心感染科，天津300162；2解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)960醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濟(jì)南250000）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）可由于其神經(jīng)系統(tǒng)功能改變引起應(yīng)激性潰瘍（stress ulcer），臨床稱為庫欣潰瘍（Cushing ulcer）［1］，其發(fā)生與TBI 的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，即病情越重，其發(fā)生率越高。對于應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生機(jī)制目前存在多種解釋，其中主要有神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胃黏膜保護(hù)功能損傷及胃黏膜損傷因子作用增強(qiáng)［2］，對應(yīng)激性潰瘍分子機(jī)制的闡釋也有研究［3］。Wnt 信號通路的上游啟動子Wnt1 及中心因子富含亮氨酸重復(fù)序列的G 蛋白偶聯(lián)受體5（leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5，LGR5）與人體多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，包括胃癌、肝癌、基底細(xì)胞癌、卵巢癌和食管癌等［4-7］。近年來發(fā)現(xiàn)這一信號通路也參與介導(dǎo)胃粘膜炎癥性改變，導(dǎo)致攻擊因子和/或防御因子失衡，進(jìn)而誘發(fā)應(yīng)激性潰瘍［8］。本實(shí)驗(yàn)研究觀察了Wnt1 和LGR5 在顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍大鼠胃粘膜中表達(dá)變化，進(jìn)而探討其與顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍的相關(guān)性，為臨床闡釋應(yīng)激性潰瘍發(fā)生機(jī)制及應(yīng)激性潰瘍的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

免疫組化試劑盒（北京中衫金橋）；抗β-actin 抗體（Absmart）；抗LGR5抗體（Epitomics）；Ⅱ抗（KPL）；Trizol 試劑（Invitrogen）。電子皮質(zhì)損傷撞擊儀（electronic cortical contusion impactor，eCCI）和多普勒激光流量計（PF-5000，瑞典帕瑞醫(yī)學(xué)公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF 級雄性7 周齡SD 大鼠30 只由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號為SCXK（軍）2007-004，體重（300±15）g。將大鼠編號、稱重，隨機(jī)分為3 組，即假手術(shù)（sham）組、輕度TBI（mild TBI，mTBI）組和重度TBI（severe TBI，sTBI）組，每組10只。

2.2 模型復(fù)制 （1）將sham 組大鼠用5%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔麻醉后固定于立體定向儀，頭部備皮消毒，手術(shù)刀片沿正中切開頭皮，剝脫分離骨膜，以牙科鉆在冠狀縫后5 mm、矢狀縫右側(cè)5 mm 交匯處，擴(kuò)大骨窗至5 mm×5 mm，保持硬膜完整。（2）mTBI組大鼠重復(fù)上述操作，待夾尾反射出現(xiàn)后，將其固定于eCCI：設(shè)置打擊深度2 mm，持續(xù)時間120 ms，打擊速率3 m/s，打擊 1 次。（3）sTBI 組大鼠待夾尾反射出現(xiàn)后，將其固定于eCCI儀：設(shè)置打擊深度4 mm，持續(xù)時間120 ms，打擊速率4 m/s，打擊1次。

2.3 神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity score，NSS） eCCI 打擊后待動物完全蘇醒，由不了解實(shí)驗(yàn)分組情況、經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的研究人員分別在24和48 h兩個時點(diǎn)參照 Wang 等［9］的 NSS 表，應(yīng)用盲法對大鼠進(jìn)行評分。大鼠出現(xiàn)平衡障礙、向輕癱側(cè)傾倒、抱緊平衡木肢體從平衡木垂落可認(rèn)為是mTBI；sTBI在以上癥狀體征出現(xiàn)同時伴有耳廓反射、角膜反射和驚恐反射消失，甚至可以出現(xiàn)肌陣攣和肌張力障礙。

2.4 胃黏膜大體結(jié)構(gòu)觀察及HE 染色 造模后48 h，將大鼠處死，應(yīng)用多聚甲醛灌流固定后，正中線開腹，游離胃組織，取胃組織沿胃大彎處剖開，生理鹽水沖洗胃組織內(nèi)壁殘留物，直接肉眼觀察胃黏膜皺襞情況。另取胃組織石蠟包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常規(guī)脫蠟，流水沖洗10 min 后，蘇木素染色2 min。隨后用流水沖洗10 min，伊紅復(fù)染2 min，流水沖洗10 min，乙醇脫水，二甲苯兩次透明，中性樹膠封固。每張切片在100 倍顯微鏡視野下對胃黏膜進(jìn)行觀察。

2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) eCCI 打擊后 48 h 取材，選取大鼠胃黏膜3 個部位（胃大彎處、賁門部和幽門部），按100 g 組織樣本加入100 μL 2× SDS 緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，1%SDS，50%glycerol，pH 6.8）的比例裂解樣本，研磨后于冰上裂解10 min，12 000 r/min（離心半徑8 cm）離心20 min，取上清液-80℃?zhèn)溆?。BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，取 50 μg 蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉2 h，分別加入抗Wnt1 和LGR5 的Ⅰ抗，4℃過夜，洗膜后加Ⅱ抗，37℃孵育2 h。使用ECL 液顯色，最后進(jìn)行顯影、定影，用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描吸光度值，用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。定量結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計作圖軟件繪制。

2.6 免疫組織化學(xué)染色 造模48 h 后，應(yīng)用兔超敏二步法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）進(jìn)行免疫組化染色：大鼠胃組織切片用3%的H2O2封閉10 min 后，pH 6.0 的枸櫞酸溶液加熱孵育15 min 以修復(fù)抗原；冷卻至室溫后用5%的山羊血清室溫封閉20 min；滴加抗LGR5 的Ⅰ抗（1∶150），4℃過夜；PBS 清洗后依次滴加試劑1 和2，室溫孵育20min；DAB 顯色劑顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，用乙醇脫水，再用二甲苯透明，最后中性樹脂封片。在Nikon偏振光倒置顯微鏡下觀察免疫陽性反應(yīng)物的分布與定位。隨機(jī)選取5 個不重復(fù)的視野，鏡下計數(shù)形態(tài)完整的LGR5陽性細(xì)胞，計算各組陽性細(xì)胞平均數(shù)。

2.7 大鼠胃組織血流量的多普勒監(jiān)測 致傷48 h后，各組取5 只大鼠，水合氯醛溶液腹腔麻醉后，行多普勒超聲監(jiān)測胃粘膜表面血流量，正中線剖腹，游離胃組織，插入激光血流儀探頭，分別置于胃底部、胃大彎、賁門部和幽門部4 處測定胃黏膜表面血流量。各部位記錄時間均為30 min，取平均值，單位為mL/（min×100 g）。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計作圖軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較行單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能缺損評分的結(jié)果

如圖1所示，sham組未傷及正常腦組織，神經(jīng)功能未缺損，評分正常；mTBI 組及sTBI 組神經(jīng)功能出現(xiàn)明顯受損，主要表現(xiàn)為無法沿直線行走，平衡功能明顯障礙，外周感知能力下降，NSS 均顯著升高（P＜0.01），且sTBI 組較mTBI 組進(jìn)一步升高（P＜0.01），提示sTBI 組大鼠神經(jīng)功能損傷更重，即腦損傷程度更重。

Figure 1.NSS scores of the rats.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs mTBI group.圖1 大鼠NSS評分

2 胃黏膜大體觀察及胃黏膜HE染色結(jié)果

如圖2所示，sham組可見胃黏膜呈淡紅色，表面光滑，黏膜皺襞平整，黏膜上皮完整度好；mTBI組及sTBI 組均有不同程度胃黏膜組織損傷，表現(xiàn)為黏膜表面有血痂，部分胃黏膜表面可見散在不規(guī)則點(diǎn)狀出血灶，sTBI 組還可見黏膜水腫及片狀出血灶，部分黏膜可見皺襞變淺甚至消失。在光鏡下可見sham組大鼠胃組織結(jié)構(gòu)正常，黏膜表面完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤滲出；mTBI組及sTBI組大鼠可見部分黏膜上皮萎縮，正常腺體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮，部分可見紅細(xì)胞滲出，黏膜下層有炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。

3 Wnt1和LGR5蛋白水平的變化

Western blot 結(jié)果顯示，mTBI 組及 sTBI 組大鼠胃大彎、賁門和幽門處胃黏膜中Wnt1 和LGR5 蛋白表達(dá)水平較sham 組均顯著升高（P＜0.05），且sTBI組Wnt1 和LGR5 蛋白表達(dá)水平較mTBI 組升高更明顯（P＜0.01），見圖3。

4 LGR5免疫組化染色結(jié)果

如圖4 所示，LGR5 免疫陽性產(chǎn)物主要定位于胞漿中，sham 組免疫陽性產(chǎn)物也有表達(dá)但表達(dá)量較低（76±5），mTBI 組及sTBI 組的免疫陽性產(chǎn)物表達(dá)量均顯著增多（P＜0.05），且sTBI 組（236±11）較mTBI組（178±11）顯著增多（P＜0.05）。

Figure 2.The structure of gastric tissue and pathological changes of gastric body in each group（HE staining，×100）.Images g，h and I were the local enlarged views of d，c and f，respectively.圖2 各組大鼠胃組織大體結(jié)構(gòu)及胃組織胃體部病理變化

Figure 3.The protein expression of LGR5 and Wnt1 in gastric mucosa（great curvature，cardia and pylorus）of the rats detected by Western blot.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs mTBI group.圖3 大鼠胃黏膜三個部位（胃大彎、賁門和幽門）胃組織LGR5和Wnt1

Figure 4.Immunohistochemical staining of LGR5 in the rat gastric mucosa tissues（×200）.Images a，b and c were the local enlarged views of A，B and C，respectively.LGR5 immunopositive products were mainly localized in cytoplasm.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs mTBI group.圖4 大鼠胃黏膜組織LGR5免疫組織化學(xué)染色

5 胃黏膜多普勒超聲血流量檢測結(jié)果

如圖5所示，sham組與2個TBI組胃大彎處血流量基本保持同一水平，而2個TBI組賁門部近胃小彎處黏膜血流量較sham組顯著下降（P＜0.05），sTBI組血流量均值較mTBI 組下降更為明顯（P＜0.05）。這一結(jié)果提示TBI 確實(shí)改變了胃黏膜組織的血流，降低了局部胃黏膜的血流量。

Figure 5.The measurement results of gastric mucosal blood flow by Doppler ultrasound.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs mTBI group.圖5 多普勒超聲檢測胃黏膜血流量的結(jié)果

討 論

近年來的研究表明，有關(guān)TBI 的實(shí)驗(yàn)多采用電子皮質(zhì)損傷撞擊儀造模，均報道了TBI 模型未見死亡［9］，造模成功后，大鼠胃組織大體觀察及胃黏膜上皮HE染色可見，傷后大鼠胃組織宏觀與鏡下觀察的確出現(xiàn)了胃黏膜的點(diǎn)狀、片狀出血灶，局部胃黏膜炎癥細(xì)胞浸潤［10］，紅細(xì)胞滲出，腺細(xì)胞萎縮甚至消失，上皮細(xì)胞連續(xù)性中斷，損傷深達(dá)黏膜下層組織，這印證了創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍發(fā)生的客觀性，這種病變的機(jī)制可能是通過上調(diào)了Wnt1 及LGR5 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，在TBI干預(yù)后，蛋白水平Western blot 證實(shí)大鼠胃黏膜中Wnt1及LGR5蛋白的表達(dá)上升，LGR5的免疫組化實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平證實(shí)TBI 后LGR5 的異常高表達(dá)，且隨著 TBI 嚴(yán)重程度增加，Wnt1 及 LGR5 的表達(dá)均出現(xiàn)上升趨勢，證實(shí)了Wnt 信號通路相關(guān)蛋白高表達(dá)確實(shí)與TBI 的干預(yù)相關(guān)。本研究中mTBI 組及sTBI 組的胃黏膜血流量較Sham 組明顯降低，這可能與TBI 干預(yù)后的血液再分布有關(guān)。近年來研究認(rèn)為，胃黏膜血流量下降在應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生中起主導(dǎo)作用［11］。局部胃黏膜的血流量充足是其保護(hù)性重要機(jī)制，TBI后使得黏膜血流量下降反過來又會導(dǎo)致黏液屏障完整性下降，從而加重潰瘍病的出現(xiàn)，從實(shí)驗(yàn)中還可發(fā)現(xiàn)，這種局部血流量保護(hù)屏障作用損傷會隨著TBI 程度加重而加重，既是創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍發(fā)生的原因又是結(jié)果。

以往大量的研究證實(shí)，Wnt 信號通路在腫瘤的形成和發(fā)展中起到重要調(diào)節(jié)作用［12］，例如各種消化道腫瘤，基底細(xì)胞癌，卵巢癌發(fā)生機(jī)制過程中都有Wnt 信號通路的作用。Wnt基因其實(shí)是一大基因家族，其中的Wnt1 在整個Wnt 信號通路中扮演啟動子角色［13］。經(jīng)典的Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要以Wnt/β-cantenin 途徑為主，其過程主要通過β-cantenin 向細(xì)胞核移位，激活TCF 轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)水平，這一重要靶基因即本研究中LGR5。LGR5 是具有18個富含亮氨酸的重復(fù)單位和7個跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白，LGR5在人體多個組織結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)［14］，其作為Wnt 信號通路關(guān)鍵中心蛋白，在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注，其異常表達(dá)或激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［15-16］。Sen 等［14］和 Polzer 等［17］的研究證實(shí)Wnt 信號通路介導(dǎo)了消化道黏膜損害過程以及參與一些慢性炎癥疾病，如風(fēng)濕樣關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化。激活的Wnt 聯(lián)合下游靶基因LGR5介導(dǎo)了正常消化道黏膜組織修復(fù)、愈合和再生，很大程度上這一信號通路高表達(dá)會加重炎癥反應(yīng)，可能在消化道黏膜炎癥進(jìn)一步向消化道潰瘍轉(zhuǎn)化方面扮演重要角色［18］。這為創(chuàng)傷后消化性潰瘍的發(fā)生機(jī)制提供了新的解釋。

綜上所述，本研究成功應(yīng)用eCCI 建立了大鼠TBI后應(yīng)激性潰瘍模型，與國內(nèi)外類似研究比較具有一定創(chuàng)新和先進(jìn)之處。通過對Wnt信號通路中Wnt1及LGR5 在TBI 后出現(xiàn)高表達(dá)的研究，為顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)，也為研究治療TBI 后應(yīng)激性潰瘍的新型藥物靶點(diǎn)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，本實(shí)驗(yàn)只研究了Wnt1 及LGR5 兩個重要蛋白表達(dá)變化情況，對于Wnt1 及LGR5 所在Wnt通路的上下游因子相互作用的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究探討。