雌激素增強(qiáng)失血性休克大鼠腸系膜淋巴管的收縮功能*

張立民， 馮妞妞， 趙 晨， 張玉平， 牛春雨， 趙自剛△

（1河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北張家口075000；2河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北石家莊050017）

失血性休克常見于多發(fā)性外傷、消化道潰瘍、產(chǎn)科及手術(shù)意外等多種因素造成的急性大量出血；全球范圍內(nèi)，每年約有180 萬重癥患者死于失血性休克，其中有150 萬為多發(fā)性外傷導(dǎo)致的失血性休克［1］。組織水腫及其引起組織缺氧進(jìn)一步加重是重癥休克患者死亡的最主要原因之一［2］；淋巴循環(huán)是組織液回流入循環(huán)系統(tǒng)的重要途徑，淋巴管收縮性降低引起的淋巴管運(yùn)輸淋巴液的能力下降是重癥休克發(fā)生組織水腫、導(dǎo)致休克難治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雌激素具有多種生物學(xué)活性，對于失血性休克的心泵功能、免疫功能和血管反應(yīng)性具有明顯的改善作用，能顯著延長失血性休克動物的存活時間［3-5］。研究也表明，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）可通過雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）降低失血性休克大鼠血管通透性，進(jìn)而減少血漿滲漏、減輕組織水腫［6］。鑒于淋巴管收縮功能對于組織液回流的重要作用，雌激素是否可通過改善失血性休克后淋巴管的收縮功能、增加組織液回流進(jìn)而發(fā)揮良好的抗休克作用，還不清楚。同時，淋巴管收縮功能與淋巴管平滑肌細(xì)胞（lymphatic smooth muscle cells，LSMCs）收縮過程中細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度（［Ca2+］）變化（即鈣瞬變）密切相關(guān)［7］，但雌激素對失血性休克淋巴管功能的調(diào)控作用是否與LSMCs 的鈣瞬變有關(guān)，也不明了。因此，本研究通過觀察活體淋巴微循環(huán)、離體淋巴管收縮性及LSMCs 內(nèi)外［Ca2+］變化，評估E2 對失血性休克大鼠腸系膜淋巴管（mesenteric lymphatics，ML）收縮性的作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

成年雄性Wistar 大鼠，體重（300±20）g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心［北京，許可證號SCXK（軍）2012-0004］。大鼠在清潔動物飼養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一段時間后用于實驗研究。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（24±2）°C、濕度40%～60%、晝夜交替。

2 實驗方法

2.1 實驗分組與失血性休克模型的建立 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、休克（shock）組和shock+E2組（n=6）。實驗前，大鼠禁食12 h，自由飲水。實驗過程中，首先應(yīng)用V149407879 型小動物麻醉呼吸機(jī)（Midmark）吸入異氟烷誘導(dǎo)麻醉，肌肉注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg，Merck）全身麻醉，常規(guī)方法建立失血性休克模型，血壓（40±2）mmHg 維持90 min，然后進(jìn)行液體復(fù)蘇（放出的全血與等量林格液），詳細(xì)手術(shù)過程見文獻(xiàn)［8-9］。shock+E2組大鼠在液體復(fù)蘇的同時，一次性皮下注射E2（2 mg/kg）［6］。實驗過程依據(jù)實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，盡量減少人為因素引起的失血和創(chuàng)傷導(dǎo)致的痛苦。

2.2 活體腸系膜淋巴微循環(huán)的觀察 shock 與shock+E2組大鼠在液體復(fù)蘇結(jié)束后2.5 h、sham 組大鼠在相應(yīng)時點，應(yīng)用動態(tài)可視化微血管研究系統(tǒng)（Gene＆I型，北京吉安得爾有限公司組裝）觀察腸系膜淋巴微循環(huán)變化。詳細(xì)過程如下：腹部手術(shù)，暴露回盲部腸系膜；將大鼠置于倒置顯微鏡（Olympus）下，將距回盲部3～5 cm 的腸袢沿腹部手術(shù)切口輕拉置于恒溫槽中，內(nèi)含37℃的生理鹽溶液（physiological saline solution， PSS； mmol/L： NaCl 0.119，EDTA·Na20.000 03，NaHCO30.025，KCl 0.004 7，葡萄糖 0.005 5，CaCl20.002 5，KH2PO40.001 2，MgSO40.001 17）；隨后，用潔凈、蘸滿溫PSS 的棉簽將腸系膜輕輕鋪平展開，用電子微量泵（2 mL/min）向腸系膜持續(xù)滴加37℃的PSS（充氧），以保證腸系膜表面的濕潤狀態(tài)，在40倍水鏡下觀察、錄像。

應(yīng)用Ipwin32 系統(tǒng)分析腸系膜淋巴微循環(huán)的視頻，記錄ML 的收縮頻率（contraction frequency，CF），測量同一ML 的最大收縮口徑（end-systolic diameter，ESD）、最大舒張口徑（end-diastolic diameter，EDD）及靜態(tài)口徑（static diameter，SD）。計算淋巴管收縮性指數(shù)（contractile index，Index I）、總收縮分?jǐn)?shù)（total contractile fraction，Index II）和淋巴管動力學(xué)指數(shù)（lymphatic dynamic index，LD-Index）。計算公式為：Index I=（EDD2- ESD2）/EDD2；Index II=（EDD2-ESD2）×CF/EDD2；LD-Index=（EDD -ESD）×100CF/SD2。根據(jù)CF和3個收縮性指數(shù)評估淋巴管收縮性。

3.3 離體ML收縮性與鈣瞬變的觀察 活體腸系膜淋巴微循環(huán)觀察結(jié)束后，頸椎脫臼執(zhí)行安樂死，剪取回盲部上部3～5 cm 的一段腸袢，按照我室分離胸導(dǎo)管、制備離體淋巴管環(huán)與孵育的方法［10］，用解剖剪及鑷子剔除周圍多余脂肪組織，制備離體ML 環(huán)，固定在細(xì)胞收縮/組織張力與離子濃度同步測量系統(tǒng)（Ion-Optix）浴槽中的玻璃管上，維持3 cm水柱的灌注壓。

待浴槽內(nèi)液體溫度由4℃自然上升至室溫后，加熱至37℃，避光加入Fura-2（日本株式會社同仁化學(xué)研究所，批號F015）熒光液（1 mg/100 μL 無水二甲基亞砜，5 mmol/L）和F127（日本株式會社同仁化學(xué)研究所，批號LU08）溶液（20 mg/100 μL 無水二甲基亞砜）各5 μL，37℃孵育20 min。隨后第1次換液，37℃孵育30 min。然后，應(yīng)用37℃的PSS 換液4 次，徹底洗去熒光物質(zhì)，保留5 mL 的PSS。再次穩(wěn)定孵育30 min，當(dāng)ML出現(xiàn)規(guī)律的自發(fā)性收縮后，打開熒光探測器，記錄ML 的CF、EDD、ESD、［Ca2+］基值和［Ca2+］峰值。觀察結(jié)束后，更換37℃無鈣PSS，20 min 后記錄ML 最大被動舒張管徑（passive diameters，PD）。計算緊張性指數(shù)（tonic index，TI）、收縮幅度（contraction amplitude，CA）和泵流分?jǐn)?shù)（fractional pump flow，F(xiàn)PF），結(jié)合CF，評價離體ML 的收縮性。根據(jù)記錄的［Ca2+］的基值與峰值，計算［Ca2+］差。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。方差齊性檢驗后，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni 校正的t檢驗。P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 雌激素處理對失血性休克大鼠活體腸系膜淋巴微循環(huán)的作用

3 組大鼠活體 ML 收縮過程中的 ESD、EDD 和 SD數(shù)值見表1，從SD 來看，3 組大鼠所選用的ML 沒有顯著差異。失血性休克后，大鼠活體ML 的CF、Index II 和LD-Index 顯著降低（P＜0.05），E2 處理顯著提高了失血性休克大鼠活體ML 的收縮功能（P＜0.05），接近sham組大鼠，見圖1。

表1 大鼠活體腸系膜淋巴管的口徑Table 1.The mesenteric lymphatic diameters in rats in vivo（μm.Mean±SEM. n=6）

2 雌激素處理對失血性休克大鼠離體ML 收縮性的作用

3 組大鼠離體 ML 收縮過程中的 ESD、EDD 和 PD數(shù)值見表2，從PD 來看，3組離體ML沒有顯著差異。來自shock 組大鼠的離體ML 的CF 和FPF 顯著低于來自sham 組大鼠的ML（P＜0.05），E2 處理顯著提高了shock 大鼠離體 ML 的 CF 和 FPF（P＜0.05）；3 組大鼠離體ML 的CA 和TI 之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖2。

3 雌激素處理對失血性休克大鼠離體ML 收縮過程中LSMCs內(nèi)外［Ca2+］差的影響

如圖3 所示，shock 組大鼠離體ML 收縮過程中LSMCs 內(nèi)外的［Ca2+］差值顯著低于 sham 組（P＜0.05），E2 處理顯著提高了 shock 組大鼠離體 ML 收縮過程中LSMCs內(nèi)外的［Ca2+］差（P＜0.05）。

討 論

重癥失血性休克難治的機(jī)制復(fù)雜，重癥失血性休克的防治依然任重道遠(yuǎn)［11］。我們基于良好的淋巴微循環(huán)功能有利于重癥失血性休克向好的方向轉(zhuǎn)歸的前期研究基礎(chǔ)，結(jié)合雌激素具有良好抗休克作用的前人研究工作，觀察了E2 治療對失血性休克淋巴管收縮功能的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，E2 治療有效改善了失血性休克大鼠活體和離體ML的收縮性，同時提高了離體ML收縮過程中LSMCs內(nèi)外的［Ca2+］差。本研究結(jié)果為深入研究雌激素改善淋巴管收縮功能的機(jī)制、擴(kuò)展重癥失血性休克的治療新策略提供了一定的實驗資料。

針對重癥失血性休克的救治策略，美國Alabama大學(xué)外科研究中心Chaudry教授指出“人們遭受創(chuàng)傷休克后，會出現(xiàn)水腫；因此如果我們能夠?qū)⒁鹚[的液體引流回血液循環(huán)中，那么，我們就能將病人或動物的身體維持在允許性低血壓狀態(tài)，足以維持他們的生命”?？梢?，尋找促進(jìn)組織液回流入血的治療措施，減輕組織水腫，是重癥休克防治研究領(lǐng)域的一個新方向。組織液回流入血除了通過微靜脈進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)外，最主要的途徑是經(jīng)初始淋巴管吸收、形成淋巴液，再經(jīng)淋巴管系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)入血。而且，初始淋巴管的不連續(xù)內(nèi)皮較多，內(nèi)皮細(xì)胞間的孔隙較大，可以回吸收大分子蛋白，有助于更多的組織液通過淋巴管系統(tǒng)回流入血。生理狀態(tài)下，成人每天生成淋巴液約2～4 L，經(jīng)淋巴管系統(tǒng)回流入血，可見淋巴管系統(tǒng)在體液調(diào)節(jié)、物質(zhì)吸收、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的作用［12］。

活體淋巴微循環(huán)與離體淋巴管收縮性觀察的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴管收縮性及其對血管活性物質(zhì)去甲腎上腺素［13］、P 物質(zhì)的反應(yīng)性下降［10，14］，淋巴流量逐漸減少，淋巴管運(yùn)輸淋巴液的能力下降，淋巴微循環(huán)障礙成為休克微循環(huán)學(xué)說的重要補(bǔ)充。因此，從調(diào)控淋巴管收縮性的角度，在一定的時間窗內(nèi)，通過促進(jìn)淋巴液回流、減輕組織水腫，對于防治重癥休克具有積極的意義。本研究在前期證實雌激素對失血性休克具有良好干預(yù)作用的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)雌激素治療可有效改善失血性休克大鼠活體、離體淋巴管的收縮功能，提高淋巴管轉(zhuǎn)運(yùn)淋巴液的能力，這對于通過“自身輸液”代償機(jī)制、進(jìn)而維持失血性休克后的體液平衡具有積極意義。應(yīng)當(dāng)指出，本研究克服了ML直徑?。?00 μm）、壁薄等困難［15］，采用ML 作為離體淋巴管的來源，相對于以前應(yīng)用的胸導(dǎo)管（400～600 μm）而言，與活體淋巴管收縮性觀察更具有一致性。

Figure 1.17β-Estradiol（E2）treatment enhanced the mesenteric lymphatic contractility in vivo in rats after hemorrhagic shock.A：representative images of lymphatic diameter in rats in vivo using dynamic visualization microvascular observation system；B：the lymphatic contraction frequency（CF），contractile index（Index I），total contractile fraction（Index II），and lymphatic dynamics index（LD-Index）in vivo. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs shock group.圖1 雌激素提高了失血性休克大鼠活體腸系膜淋巴管的收縮性

表2 大鼠離體腸系膜淋巴管的口徑Table 2.The isolated rat mesenteric lymphatic diameters（μm.Mean±SEM. n=3）.

Ca2+是血管平滑肌細(xì)胞收縮的物質(zhì)基礎(chǔ)，［Ca2+］變化直接影響著血管的舒縮功能［16］；同樣，Ca2+也是LSMCs 收縮進(jìn)而維持淋巴管功能的必備條件，細(xì)胞內(nèi)外［Ca2+］差的變化直接影響著淋巴管的收縮性［7］。為此，本研究首次應(yīng)用細(xì)胞收縮/組織張力與離子濃度同步測量系統(tǒng)，觀察了淋巴管收縮過程中LSMCs內(nèi)外［Ca2+］差的變化，發(fā)現(xiàn)淋巴管收縮與LSMCs內(nèi)外［Ca2+］差具有相關(guān)性，雌激素治療也提高了LSMCs內(nèi)外［Ca2+］的差值，這對于提高淋巴管收縮功能是有益的。但是，雌激素提高［Ca2+］差的作用是通過提高LSMCs 鈣通道功能、還是通過改善能量代謝、亦或通過改善線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等與Ca2+釋放相關(guān)的細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)或功能而實現(xiàn)的，還不清楚。同時，最近實驗顯示，LSMCs 與血管平滑肌細(xì)胞表達(dá) ERs［17］相似，亦表達(dá)ERα（未發(fā)表數(shù)據(jù)），雌激素是否通過ERα 來發(fā)揮對淋巴管收縮功能的調(diào)節(jié)作用、增加LSMCs 內(nèi)外［Ca2+］差的作用還需要明確。這些均是今后需要深入研究的方向之一。

Figure 2.17β -Estradiol（E2）treatment enhanced the contractility of mesenteric lymphatics isolated from rats after hemorrhagic shock.A：representative images of isolated lymphatic diameter using vascular tension and ion concentration measurement system（IonOptix BioIon 1.33）at a transmural pressure of 3 cmH2O；B：the isolated lymphatic contraction frequency（CF），contraction amplitude（CA），tension index（TI），and fractional pump flow（FPF）.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs shock group.圖2 雌激素提高了失血性休克大鼠離體腸系膜淋巴管的收縮性

Figure 3.17β-Estradiol（E2）treatment enhanced the difference between intra- and extracellular［Ca2+］of lymphatic smooth muscle cells（LSMCs）during contraction of mesenteric lymphatics isolated from rats after hemorrhagic shock.A：representative images of isolated lymphatic diameter and difference between intra- and extracellular［Ca2+］of LSMCs using vascular tension and ion concentration measurement system（IonOptix BioIOn 1.33）at a transmural pressure of 3 cmH2O；B：the［Ca2+］changes of LSMCs during isolated lymphatic contraction.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs shock group.圖3 雌激素提高了失血性休克大鼠腸系膜淋巴管收縮過程中LSMCs內(nèi)外［Ca2+］差

綜上所述，雌激素明顯增強(qiáng)了失血性休克大鼠腸系膜淋巴管的收縮功能，該作用與提高LSMCs 內(nèi)外［Ca2+］的差值有關(guān)。應(yīng)當(dāng)指出，本文只是觀察了雌激素、失血性休克、腸系膜淋巴管收縮及其與LSMCs內(nèi)外［Ca2+］差的關(guān)系，但詳細(xì)機(jī)制還有待深入研究。