Vinculin促小鼠肝星型細(xì)胞活化作用

鄒韻涵 崔慧情 丘穎琛 李筱迪 龍子昕 曹智銘 馬寧芳 劉珊珊

病毒、寄生蟲(chóng)、酒精等均可對(duì)肝臟造成損傷并引起肝纖維化，其表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量沉積，匯管區(qū)纖維異常增生，繼而假小葉和再生結(jié)節(jié)形成，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑[1-2]。肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]。HSC圍繞在肝竇周圍，正常狀態(tài)下，HSC在肝內(nèi)處于靜息狀態(tài)；在肝損傷因子刺激后，HSC活化為肌成纖維樣或成纖維樣細(xì)胞，活化的HSC增生并向損傷區(qū)域遷移，表達(dá)各種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白，并產(chǎn)生大量以膠原纖維為主的ECM，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化形成[4]。及時(shí)采取有效措施干預(yù)其活化過(guò)程對(duì)阻斷肝纖維化進(jìn)展至關(guān)重要。

細(xì)胞骨架蛋白紐蛋白(Vinculin)是一種黏著連接相關(guān)蛋白，存在于細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的黏著部位，其作用是將纖維狀肌動(dòng)蛋白錨定于連接點(diǎn)胞膜上，通過(guò)與多種細(xì)胞骨架蛋白、黏著斑蛋白的相互作用，在細(xì)胞黏附、遷移、增殖等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)在肺纖維化區(qū)域的肺泡上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中Vinculin表達(dá)增強(qiáng)[7]，提示Vinculin蛋白可能參與了纖維化過(guò)程，但具體機(jī)制不清。本研究探討Vinculin與HSC活化是否有關(guān)，深入解讀肝纖維化分子機(jī)制，為優(yōu)化臨床治療策略提供新思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

Vinculin-siRNA(廣州市銳博生物科技公司)，一抗稀釋液(上海市碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗Vinculin單克隆抗體(英國(guó)abcom公司)，兔抗α抗com多克隆抗體(中國(guó)BOSTER公司)，鼠抗Desmin單克隆抗體(中國(guó)BOSTER公司)，兔抗GAPDH 單克隆抗體(美國(guó)CST公司)，羊抗兔二抗(美國(guó)Pierce公司)，羊抗鼠二抗(美國(guó)Pierce公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 人源性肝星形細(xì)胞株LX-2在10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、條件下培養(yǎng)。Vinculin siRNA序列如下，siRNA1：GCACAGCGGTGGATTGATA，siRNA2：CTCGTA-TCTTACTTAGGAA，Scramble：Vinculin無(wú)關(guān)序列。

(二)RT-qPCR檢測(cè) 根據(jù)NCBI上Vinculin已知序列，用premier5設(shè)計(jì)引物，所用引物序列如下：Vinculin Forward AACCAGTATTGCTCGTCGGG，Vinculin Reverse GAGGCGGCGGGAAGTC；desmin Forward AGCCAACAAGAACAACGACG，desmin Reverse TTCCCGCATCTGCCTCAT；α-SMA Forward GGGGTGATGGTGGGAATG，α-SMA Reverse GCAG-GGTGGGATGCTCTT。

(三)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 一抗稀釋液稀釋兔抗Vinculin 124 kDa(1∶10 000), 鼠抗DESMIN 50-55 kDa(1∶50)，兔抗α-SMA 50-55kDa(1∶50)，兔抗GAPDH 37 kDa(1∶2000)，獲取圖片后以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白GADPH的灰度比作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)值。

(四)ELISA檢測(cè) 按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液人Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)含量。以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品A值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，用相關(guān)軟件繪制曲線，并取得直線回歸方程，將樣品的A值代入方程，計(jì)算出樣品待測(cè)指標(biāo)濃度。

(五)小鼠肝纖維化模型 清潔級(jí)健康成年雄性昆明小鼠30只，體質(zhì)量25～28 g，購(gòu)于廣東省動(dòng)物中心。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=5)和實(shí)驗(yàn)組(n=15)。實(shí)驗(yàn)組皮下注射四氯化碳-粟米油混合液(6 mL/kg)，2次/周，對(duì)照組皮下注射同等劑量的粟米油。于造模8周后取小鼠中葉肝組織，置預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，制備蠟塊、切片。

(六)DESMIN及Vinculin免疫組化檢測(cè) 石蠟切片經(jīng)加熱融蠟、二甲苯脫蠟、常規(guī)梯度酒精水化、枸櫞酸抗原修復(fù)、過(guò)氧化物酶封閉，山羊血清封閉后加入一抗(抗Vinculin 1∶50，鼠抗DESMIN1∶100或兔抗α-SMA1∶100)孵育過(guò)夜，PBS溶液洗3遍，二抗(山羊抗兔1∶200，山羊抗鼠1∶200)孵育30 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片鏡檢。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用 SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。配對(duì)樣本均數(shù)間的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠肝臟組織病理學(xué)

HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)壞死，炎癥浸潤(rùn)等其他病理狀態(tài)(圖1A)，CCL4處理組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀，肝小葉周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生(圖1B)。Masson染色結(jié)果顯示對(duì)照組僅在中央靜脈壁周圍可見(jiàn)少量綠色纖維(圖1C)，CCL4組小鼠肝組織內(nèi)及肝小葉間出現(xiàn)大量纖維增生，部分切片有纖維包繞分割肝小葉的趨勢(shì)(圖1D)。

A.對(duì)照組小鼠肝組織HE染色；B.CCl4誘導(dǎo)8周小鼠肝組織HE染色；C.對(duì)照組小鼠肝組織Masson 染色；D.CCl4誘導(dǎo)8周組小鼠肝組織Masson 染色

二、Vinculin、DESMIN 及α-SMA免疫組化

對(duì)照組肝組織內(nèi)可見(jiàn)散在的Vinculin陽(yáng)性細(xì)胞，定位于肝星型細(xì)胞胞膜下，CCL4組Vinculin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(圖2A,2B)。免疫組化顯示對(duì)照組DESMIN散在表達(dá)于肝血竇周圍的肝星型細(xì)胞，CCL4組陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯增多(圖2C,2D)。對(duì)照組α-SMA為陰性表達(dá)，CCL4組陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，彌漫于胞質(zhì)(圖2E,2F)。

A、C、E：對(duì)照組小鼠肝組織；B、D、F：CCl4誘導(dǎo)8周小鼠肝組織

三、肝星形細(xì)胞系LX-2 desmin 及 α-SMA表達(dá)

人源性肝星形細(xì)胞系LX-2瞬轉(zhuǎn)si Vinculin 48 h后提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后qPCR檢測(cè)Vinculin、desmin 及 α-SMA，結(jié)果顯示下調(diào)Vinculin后desmin與α-SMA mRNA表達(dá)隨之下調(diào)(表1)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA干擾Vinculin后其蛋白水平明顯下調(diào)，DESMIN 與α-SMA表達(dá)水平也隨之下降(圖3)。

表1 qPCR法檢測(cè)LX-2細(xì)胞Desmin 及α-SMA基因表達(dá)(2-CT，±s)

圖3 肝星形細(xì)胞系LX-2 Desmin 及 α-SMA蛋白表達(dá)檢測(cè)

四、ELISA檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白

收集Vinculin及對(duì)照siRNA瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白含量，結(jié)果顯示下調(diào)Vinculin后Ⅰ型膠原蛋白的分泌量[Vinculin siRNA1組(3.59±0.006)ng/mL，Vinculin siRNA2組(3.67±0.009)ng/mL]與對(duì)照組(3.48±0.03)ng/mL相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞時(shí)，可發(fā)現(xiàn)門脈區(qū)域的擴(kuò)增以及Vinculin的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，也被證明可以作為門脈區(qū)域成纖維細(xì)胞被活化的標(biāo)記[8]。本研究通過(guò)肝組織HE染色及Masson染色、HSC的標(biāo)志性分子Desmin及HSC活化標(biāo)記分子α-SMA免疫組化染色等方法證實(shí)腹腔注射CCl48周后成功誘導(dǎo)小鼠肝纖維化[9]。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)纖維化肝組織中Vinculin表達(dá)量明顯增高，定位于HSC細(xì)胞膜。用siRNA敲減小鼠HSC細(xì)胞株內(nèi)Vinculin可導(dǎo)致Desmin與α-SMA的表達(dá)下調(diào)，表明Vinculin與HSC的活化有關(guān)。肝纖維化的病理機(jī)制是活化的HSC產(chǎn)生過(guò)量的膠原纖維。有研究表明，隨著肝纖維化的進(jìn)程至晚期，正常含非纖維形成膠原的低密度基底膜膠原(Ⅳ、Ⅴ型)轉(zhuǎn)換為富含纖維形成膠原的高密度間質(zhì)膠原(Ⅰ、Ⅲ型)，Ⅰ型不溶性膠原纖維顯著增加，取代Ⅲ型膠原纖維合成為肝內(nèi)主要膠原，導(dǎo)致纖維化加重[10]。由此猜測(cè)Vinculin可能抑制Ⅰ型膠原纖維的生成，從而阻斷肝纖維化進(jìn)程。采用ELISA方法檢測(cè)敲除Vinculin后細(xì)胞上清中Ⅰ型膠原纖維和Ⅳ型膠原纖維量，結(jié)果顯示兩種膠原纖維的表達(dá)量比值未產(chǎn)生明顯改變，提示Vinculin介導(dǎo)的肝纖維化可能存在新機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)Vinculin在神經(jīng)元早期分化過(guò)程中高表達(dá)，與其他細(xì)胞骨架協(xié)同通過(guò)改變神經(jīng)元形態(tài)而使其向不同方向分化[11-13]。在肝纖維化過(guò)程中，肝星形細(xì)胞的活化同樣伴隨著細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，損傷刺激誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)Vinculin可能通過(guò)細(xì)胞形態(tài)變化介導(dǎo)肝星形細(xì)胞活化過(guò)程，但其分子機(jī)制需進(jìn)一步探明。本研究結(jié)果表明Vinculin過(guò)表達(dá)與肝纖維化有關(guān)，下調(diào)Vinculin有望抑制肝纖維化進(jìn)程。