基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的侯氏黑散抗缺血性腦卒中機制研究

王 璇 馬重陽 張雅文 程宏發(fā) 張秋霞

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)學(xué)系 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

腦卒中作為世界范圍的三大疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”的范疇，《金匱要略》首次設(shè)置“中風(fēng)歷節(jié)病脈證治第四”專篇論述中風(fēng)病[2]。侯氏黑散為仲景治療缺血性中風(fēng)的“第一方”，體現(xiàn)了“補不足，損有余”的治療法則[3]。目前，已有大量的臨床研究[4-6]顯示，侯氏黑散在缺血性腦卒中的預(yù)防及治療中具有的顯著療效，而侯氏黑散的實驗研究[7-10]聚焦的治療靶點和信號通路主要集中在抗凋亡、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和促進(jìn)血管新生等方面。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是整合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容的一門新興學(xué)科，基于“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體的角度去探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，系統(tǒng)地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響。這與復(fù)方中藥組方配伍的整體觀相契合，反映了大數(shù)據(jù)時代復(fù)方中藥系統(tǒng)性研究的新趨勢[11-12]。本文將從侯氏黑散的藥效成分和靶點的篩選展開，通過建立“成分-靶標(biāo)-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)，探究其治療缺血性腦卒中的作用機制，為后續(xù)實驗提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究思路

本實驗關(guān)于侯氏黑散治療缺血性腦卒中的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗思路可概括為侯氏黑散活性成分、活性成分作用靶點、腦缺血靶點數(shù)據(jù)庫建立，“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)建立與分析兩部分，詳見圖1。

圖1 侯氏黑散抗腦缺血的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路Fig.1 Network pharmacology research processes of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeTCMSP: traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

1.2 數(shù)據(jù)庫建立

1.2.1 侯氏黑散活性成分挖掘與篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)提供了中藥成分中化合物的吸收、分布、代謝、排泄(absorption, distribution, metabolism, excretion, ADME)參數(shù)，通過設(shè)置口服吸收利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、血-腦脊液屏障(blood-brain barriers, BBB)≥-0.3和藥物相似性(drug likeness, DL)≥0.18參數(shù)，篩選出侯氏黑散方中的主要活性成分。利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Shemsrc數(shù)據(jù)庫(https://www.chemsrc.com/en/)檢索相關(guān)化學(xué)成分的CAS編號和分子式信息。

1.2.2 侯氏黑散活性成分作用靶點預(yù)測

TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索侯氏黑散活性成分對應(yīng)的靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件[13]構(gòu)建侯氏黑散活性成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治觯诰W(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表活性成分或靶點，邊代表活性成分與靶基因間的相互作用關(guān)系，Degree值是每一個節(jié)點連接的邊，一個節(jié)點與更多其他節(jié)點產(chǎn)生相互作用，這個節(jié)點的Degree值也就越高。因此Degree值能夠反映節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，Degree值大的節(jié)點被認(rèn)為是中心節(jié)點[11,14]。利用軟件中的Network Analyzer工具計算Degree值來評價網(wǎng)絡(luò)中成分和靶點的重要性。將不同來源的靶標(biāo)輸入UniProt數(shù)據(jù)庫 (http://www. uniprot. org)中檢索，限定物種為人，得到靶點對應(yīng)的Gene Symbol，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

1.2.3 缺血性腦卒中靶點挖掘

在OMIM(https://www.omim.org/)、Drug bank(http://www.drugbank.ca/)、GAD(http://geneticassociation-db.nih.gov/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫中檢索“cerebral ischemia/ischemic stroke”關(guān)鍵詞，得到腦缺血相關(guān)靶點信息。

1.3 侯氏黑散抗缺血性腦卒中的“成分-靶點-通路”分析

1.3.1 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分靶點與疾病靶點的Gene Symbol信息導(dǎo)入Venny 2.1在線工具 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，交集部分認(rèn)為是侯氏黑散抗缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(藥效靶點)。利用Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建侯氏黑散抗缺血性腦卒中成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用軟件中的Network Analyzer工具計算Degree值來評價網(wǎng)絡(luò)中成分和靶點的重要性。

1.3.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，選擇multiple proteins選項，將關(guān)鍵靶點的Gene Symbol信息導(dǎo)入，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果以.tsv文件格式導(dǎo)出。得到的.tsv文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，進(jìn)一步繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用軟件中的Centiscape 2.2插件對網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行中心性分析。將節(jié)點邊的大小和顏色設(shè)置用于分別反映Degree值和Combine score值的大小，獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.3 “靶點-功能-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點的Gene Symbol信息導(dǎo)入KOBAS在線服務(wù)器[15](http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)，設(shè)定物種為人，進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，得到侯氏黑散抗腦缺血的重要信號通路及相關(guān)參數(shù)，結(jié)果保存為.txt文件。利用Omicshare網(wǎng)站(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble)對相關(guān)KEGG信號通路進(jìn)行可視化處理，按照網(wǎng)站提供的模版導(dǎo)入包含通路信息的文件，繪制KEGG結(jié)果的高級氣泡圖。利用KEGG Mapper工具(https://www.genome.jp/kegg/mapper.html)分析相關(guān)靶點在重要信號通路中的具體作用，得到侯氏黑散調(diào)控信號通路的模式圖。

2 結(jié)果

2.1 侯氏黑散與缺血性腦卒中共同靶標(biāo)確定

由于無法在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到牡蠣、礬石的相關(guān)信息，本文分析了侯氏黑散中其他十二味藥物(菊花、白術(shù)、防風(fēng)、桔梗、黃芩、細(xì)辛、干姜、人參、茯苓、當(dāng)歸、川芎、桂枝)的成分信息，篩選出了侯氏黑散方中的81個不重復(fù)活性成分，按照OB值大小排列，排名前20的有黃芩新素(neobaicalein)、苯代南蛇堿(celabenzine)、隱品堿(cryptopin)、二甲氧基黃酮(panicolin)、黃芩黃酮Ⅱ(skullcapflavone Ⅱ)等，具體成分信息詳見表1。

表1 侯氏黑散OB值排名前20活性成分信息Tab.1 Informations of the top 20 active components in OB value of Houshiheisan

續(xù)表1

數(shù)據(jù)庫檢索得到活性成分的相關(guān)靶點112個，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，得到了一個包含184個點和1 315條邊的網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。其中，Degree值排名前5的靶點有雌激素受體1(estrogen receptor, ESR1)、雄激素受體(androgen receptor, AR)、前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4)、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase, inducible,NOS2)，它們的Degree值分別是63、61、49、47、44。

圖2 侯氏黑散的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Active component-target network of Houshiheisan

通過關(guān)鍵詞檢索Drug bank、OMIM、GAD、TTD 4個在線數(shù)據(jù)庫，得到了316個缺血性腦卒中的相關(guān)靶點。韋恩圖(圖3)構(gòu)建出活性成分-靶點和疾病-靶點的交集部分，共有22個交集靶點用于后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

圖3 侯氏黑散抗腦缺血靶點韋恩圖Fig.3 Venn diagram of targets of Houshiheisan for treatment of ischemic stroke

2.2 侯氏黑散治療腦卒中藥效成分篩選

將得到的交集靶點作為藥效靶點，利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建藥效靶點-成分相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4)。Degree值排名前10的藥效靶點及相關(guān)信息詳見表2。Degree值排名前5的藥效成分分別為β-谷甾醇、隱品堿、原阿片堿、豆甾醇、山姜素，它們的Degree值分別是49、45、44、43、36。

圖4 侯氏黑散抗腦缺血成分-藥效靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Active component-effective target network of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeESR1： estrogen receptor1； AR： androgen receptor； NR3C1： glucocorticoid receptor； PTGS2： prostaglandin G/H synthase 2； F2： prothrombin； NOS3：nitric oxide synthase, endothelial； F7： coagulation factor Ⅶ； KDR：vascular endothelial growth factor receptor 2.

表2 Degree值排名前10的侯氏黑散抗腦缺血靶點Tab.2 Top 10 anti-cerebral ischemia targets in degree value of Houshheisan

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將侯氏黑散抗腦缺血的關(guān)鍵靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫分析，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件處理后，得到了一個有22個節(jié)點和82條連線構(gòu)成的關(guān)聯(lián)網(wǎng)(圖5) 。圖中的節(jié)點代表蛋白，邊表示蛋白和蛋白間的關(guān)聯(lián)，節(jié)點越大，顏色越深表示關(guān)聯(lián)度越高。處于網(wǎng)絡(luò)中心的靶點有血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、腫瘤抑制蛋白(cellular tumor antigen p53, TP53)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase， endothelial,NOS3)、PTGS2等，他們的節(jié)點度分別為14、14、14、13、12、12。

圖5 侯氏黑散抗腦缺血藥效靶點的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein-protein interaction network of effective targets of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeVEGFA: vascular endothelial growth factor A; TP53: cellular tumor antigen p53; IL-6: interleukin-6; TNF: tumor necrosis factor;PTGS2: prostaglandin G/H synthase 2; NOS3: nitric oxide synthase, endothelial.

2.4 核心PPI網(wǎng)絡(luò)的KEGG信號通路富集分析

利用KOBAS在線服務(wù)器和Omicshare 工具對22個關(guān)鍵靶點進(jìn)行KEGG富集分析，得到侯氏黑散抗腦缺血的重要信號通路。按P值大小對排名前20的信號通路進(jìn)行可視化處理(圖6)，根據(jù)P值大小、富集因子大小和抗腦缺血相關(guān)性，認(rèn)為重要的信號通路包括流體剪切應(yīng)力通路、晚期糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(advanced glycation end products/receptor for advanced glycation end products, AGE-RAGE)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1-α/血管內(nèi)皮生長因子(hypoxia inducible factor1-α/vascular endothelial growth factor, HIF1-α/VEGF)通路等。利用KEGG Mapper工具，分析侯氏黑散靶點在流體剪切應(yīng)力通路、AGE-RAGE信號通路中的具體作用，得到侯氏黑散調(diào)控上述信號通路的模式圖(圖7、8)。

圖6 侯氏黑散抗腦缺血藥效靶點的KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of effective targets of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeKEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

圖7 流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路Fig.7 Fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathwayNOS3： nitric oxide synthase, endothelial； TP53： cellular tumor antigen p53； AP-1： activator protein 1； TNF： tumor necrosis factor； VEGFA： vascular endothelial growth factor A； KDR： vascular endothelial growth factor receptor 2； BCL2： apoptosis regulator Bcl-2.

圖8 晚期糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體信號通路Fig.8 Advanced glycation end products-advanced glycation end product receptor (AGEs-RAGE) signaling pathwayNOS3： nitric oxide synthase, endothelial；AP-1： activator protein 1； IL-6： interleukin-6； TNF： tumor necrosis factor； VEGFA： vascular endothelial growth factor A； BCL2： apoptosis regulator Bcl-2.

3 討論

缺血性腦卒中占全部腦血管病患者的70%～80%，主要包括腦血栓形成和腦栓塞，腦組織缺血再灌注后的損傷與血流減少、能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡等眾多因素有密切關(guān)系[16-17]。缺血性腦卒中病理機制復(fù)雜多樣，涉及大量信號通路網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)。醫(yī)圣張仲景在《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病篇》中記載“侯氏黑散治大風(fēng)，四肢煩重，心中惡寒不足者”,“大風(fēng)”指風(fēng)邪直中臟腑，即中醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)病”;“四肢煩重”即四肢沉重，活動不利而煩悶;“心中惡寒不足”點明了侯氏黑散治療的中風(fēng)類型是陽氣不足為主要病機的證型[2,18]。侯氏黑散由人參、白術(shù)、茯苓、干姜、當(dāng)歸、川芎、防風(fēng)、菊花、桂枝、桔梗、細(xì)辛、牡蠣、礬石十四味藥組成，具有補益氣血，祛風(fēng)通絡(luò)的功效。前期研究[7-10]結(jié)果顯示，侯氏黑散具有抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和保護神經(jīng)血管等作用。為進(jìn)一步探究侯氏黑散抗腦缺血的藥效物質(zhì)及作用靶點，筆者通過藥效成分篩選、靶標(biāo)預(yù)測、蛋白相互作用分析和KEGG富集分析得出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)結(jié)果。

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫以及Cytoscape構(gòu)建藥效靶點-成分相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出侯氏黑散抗缺血性腦卒中的5個主要藥效成分為β-谷甾醇、隱品堿、原阿片堿、豆甾醇、山姜素[14，19-20]。β-谷甾醇是菊花、防風(fēng)、干姜、黃芩、人參、當(dāng)歸、桂枝的共同成分；豆甾醇是人參、當(dāng)歸、黃芩的共同成分；隱品堿為細(xì)辛的成分； 山姜素為黃芩的成分；原阿片堿為人參的成分。其中，β-谷甾醇和豆甾醇是植物甾醇類成分[21]，均具有抗感染、抗氧化和改善神經(jīng)功能的潛在作用[21-23]；隱品堿和原阿片堿為異喹啉生物堿一類化合物，能夠作用于血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，靶向PTGS2、凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ, F7)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, KDR)起到抗感染、抗氧化、抗血小板聚集、保護血管等作用[24-25]；山姜素具有激動過氧化物酶體增殖物激活受體遏制炎性反應(yīng)介質(zhì)的合成，從而起到抑制炎性反應(yīng)的作用[26]。

利用STRING數(shù)據(jù)庫以及Cytoscape軟件預(yù)測侯氏黑散抗腦缺血可能作用的靶點有ERS1、AR、PTGS2、凝血酶原(prothrombin, F2)、NOS3等。此外，Degree值排名前5的藥效成分共同靶向ERS1、AR、PTGS2這些抗腦缺血靶點。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的雌激素和雌激素受體能夠通過核和非核作用參與運動協(xié)調(diào)、認(rèn)知功能、突觸可塑性、記憶和學(xué)習(xí)以及社會行為的調(diào)節(jié)過程，還可以通過減輕氧化應(yīng)激和降低炎性反應(yīng)因子(如腫瘤壞死因子等)表達(dá)發(fā)揮血管舒張和神經(jīng)保護作用[27-28]。PTGS2又稱環(huán)氧化酶2，是炎性反應(yīng)因子的下游因子之一，在包括腦組織的人體各組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，它的活性產(chǎn)物(如前列環(huán)素)參與了包括炎性反應(yīng)、疼痛、內(nèi)皮抗血栓的眾多生理和病理過程中，能夠參與介導(dǎo)腦缺血后的炎性反應(yīng)[29]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，流體剪切應(yīng)力通路、AGE-RAGE通路、HIF1-α/VEGF通路等是侯氏黑散發(fā)揮抗腦缺血作用的排名靠前的信號通路。流體剪切應(yīng)力是血管內(nèi)因血流摩擦管壁產(chǎn)生的平行于血流方向的切線應(yīng)力，對維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要意義[30]。研究[30-31]證實，內(nèi)皮細(xì)胞上的機械感應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是相互聯(lián)系的，細(xì)胞膜上的很多生物分子(如整合素、酪氨酸激酶受體、G蛋白偶聯(lián)受體等)都可以作為剪切應(yīng)力改變的機械傳感器。例如，血栓發(fā)生或動脈斑塊形成時，血流方向受擾呈湍流狀態(tài)，持續(xù)的低剪切應(yīng)力下，激活子蛋白-1(activator protein 1, AP-1)和核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的激活，內(nèi)皮細(xì)胞中促炎、促凋亡的基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮功能受損，NOS3和KDR表達(dá)下調(diào)，炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激激活從而使血管新生受到抑制。AGEs是大分子物質(zhì)糖基化形成的不可逆終末產(chǎn)物，其受體之一RAGE屬于免疫球蛋白超家族[32]。在炎性反應(yīng)、缺血再灌注損傷和缺氧等病理狀態(tài)下，AGE-RAGE軸活化，一方面，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活而AP-1受到抑制，刺激炎性反應(yīng)因子和凝血因子激活導(dǎo)致炎性反應(yīng)擴大，內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重，VEGF等促血管新生因子合成減少，血管新生受到抑制；另一方面，NF-κB表達(dá)增加又能上調(diào)RAGE，形成正反饋環(huán)[32-33]，使上述情況進(jìn)一步加重。研究[8,10]顯示，侯氏黑散能通過調(diào)節(jié)腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)VEGF/HIF-1α軸活性而發(fā)揮抗腦缺血的作用，這與分析結(jié)果相吻合?？傊钍虾谏⒖赡苁峭ㄟ^對流體剪切應(yīng)力、AGE-RAGE、HIF-1α/VEGF等通路能夠聯(lián)動地起到抗感染、抗氧化、抗凋亡作用，從而起到抗腦缺血損傷的作用。

結(jié)果顯示，方中成分或作用于多個靶標(biāo)、通路，或多個成分作用于同一個靶標(biāo)、通路，這正體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)、多通路的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系。調(diào)控通路涉及炎性反應(yīng)、凋亡及血管新生等各個環(huán)節(jié)，各通路群間通過共有靶標(biāo)連接，顯示出不同成分間的多靶標(biāo)協(xié)同作用。侯氏黑散的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果初步驗證了其抗腦缺血的相關(guān)機制，而這一結(jié)果尚需進(jìn)一步實驗數(shù)據(jù)的支持。