鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解的不同動(dòng)物模型形態(tài)學(xué)研究

張 晨 劉子歌 宋國(guó)瑞 李 燕 陳德勝 程萌旗

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，銀川 750004； 4. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，上海 200011)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是現(xiàn)階段治療終末期骨性關(guān)節(jié)炎的重要方法，它不僅能有效緩解關(guān)節(jié)疼痛，還能重建關(guān)節(jié)功能。隨著中國(guó)老齡化人口正以比總?cè)丝谠鲩L(zhǎng)更快的速度增加，中國(guó)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)也呈遞增趨勢(shì)。僅2018年，國(guó)內(nèi)共完成近70萬(wàn)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)[1]。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的假體無(wú)菌性松動(dòng)是此類手術(shù)主要的并發(fā)癥之一，松動(dòng)失效的人工關(guān)節(jié)需要行翻修手術(shù)治療，給患者帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)壓力[2]?，F(xiàn)階段，假體無(wú)菌性松動(dòng)的機(jī)制未知，而研究[3-4]顯示假體磨損產(chǎn)生的磨損顆粒會(huì)誘導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)，促進(jìn)假體周圍骨吸收及假體無(wú)菌性松動(dòng)?？紤]到臨床現(xiàn)狀及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)限制，研究人員難以獲得早期假體松動(dòng)標(biāo)本，因此，制作能夠真實(shí)模擬假體松動(dòng)周圍病理生理環(huán)境的動(dòng)物模型對(duì)研究其病理機(jī)制至關(guān)重要。本研究用鈦顆粒誘導(dǎo)3種動(dòng)物模型，模擬不同的假體松動(dòng)病理生理環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)的近交系雌性BALB/c小鼠共55只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量(22.6±3.4) g，健康狀況良好,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0008。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，5只/籠。將45只小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為顱骨模型組(A組)、氣囊模型組(B組)及氣囊植骨模型組(C組)，每組各15只，另外10只作為氣囊植骨模型組顱骨骨片供體。本實(shí)驗(yàn)獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)審批通過。

1.2 鈦顆粒準(zhǔn)備

鈦顆粒購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司(Ward Hill, MA)，選用商品化純鈦顆粒，顆粒直徑<20 μm。實(shí)驗(yàn)前鈦顆粒進(jìn)行去除內(nèi)毒素測(cè)試和內(nèi)毒素處理，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海潤(rùn)成生物科技有限公司。去內(nèi)毒素處理后鈦顆粒浸泡于100%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)水乙醇，之后將鈦顆粒與無(wú)水乙醇混合液置于離心管離心出鈦顆粒；去除漂浮在上層的無(wú)水乙醇，加入磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline, PBS)液洗滌3遍，最后加入無(wú)菌PBS液，將鈦顆粒制成濃度為300 g/L的顆粒懸液。

1.3 試劑與儀器

蘇木精-伊紅(HE)染色、乙醇、PBS 液購(gòu)自銀川潤(rùn)研生物技術(shù)有限公司；光鏡采用日本Olympus DP70電子顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，離心加速機(jī)購(gòu)自Sal-feadent公司；真空烘箱、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片購(gòu)自日本Olympus公司；透射電子顯微鏡采用的是日本Hitachi Kyoto透射電子顯微鏡(型號(hào)Hitachi H-7650)下觀察。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物模型的建立

(1)鈦顆粒刺激顱骨骨溶解模型組(A組)：用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛，按照0.11 mL/kg對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉成功后對(duì)小鼠頭部充分脫毛、碘伏消毒、鋪無(wú)菌巾，沿小鼠顱頂矢狀線(小鼠外耳道連線中點(diǎn)的垂線)將小鼠頂部皮膚切開1.0～1.5 cm，充分暴露小鼠顱頂1 cm2范圍骨膜，用小鑷子或小刀分離顱骨外膜，在外膜下注射0.3 mL鈦顆粒懸液，并使其均勻分布于骨膜表面(圖1A)。無(wú)菌線縫合傷口，術(shù)后常規(guī)給予青霉素抗炎2 d，預(yù)防感染。

(2)鈦顆粒刺激氣囊模型組(B組)：第1天，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛腹腔注射麻醉后，小鼠背部剃毛備皮、消毒、無(wú)菌鋪單，無(wú)菌注射器在背部正中注射2 mL 無(wú)菌空氣，形成氣囊。第2天，在同一部位向氣囊中注射1 mL 無(wú)菌空氣，第3、4、5、6天，連續(xù)向氣囊中注射0.5 mL無(wú)菌空氣，維持氣囊中存氣量。1周后小鼠背部注射部位無(wú)紅腫、硬結(jié)、滲出及炎性水腫等反應(yīng)，氣囊建立。第8天在無(wú)菌操作下將0.3 mL鈦顆粒懸液注射進(jìn)小鼠背部氣囊(圖1B)，術(shù)后常規(guī)給予青霉素抗炎2 d，預(yù)防感染。

(3)鈦顆粒刺激氣囊植骨模型組(C組)：將顱骨供體的10只小鼠麻醉后脫頸處死，取出約0.5 cm2顱骨骨片，剔除周圍多余軟組織后從中一分為二。15只小鼠氣囊建立成功后，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛腹腔注射麻醉，背部消毒、鋪巾，將已形成的氣囊切開，向內(nèi)植入一塊顱骨組織，并在顱骨周圍注射0.3 mL鈦顆粒懸液(圖1C)。無(wú)菌線縫合傷口，術(shù)后常規(guī)給與青霉素2 d，預(yù)防感染。

圖1 3組鈦顆粒誘導(dǎo)模型建模過程Fig.1 Modeling process of three groups of titanium particles induced modelA: Titanium particles stimulate skull osteolysis model; B: Titanium particles stimulate balloon model group；C: Titanium particles stimulate balloon model of bone graft.

1.4.2 標(biāo)本采集及處理

建模完成14 d后，小鼠麻醉后脫頸處死，分別取出顱骨模型組的顱骨骨片、氣囊模型組的囊壁組織及氣囊植骨組的顱骨骨片和囊壁組織，分為兩份。一份標(biāo)本用PBS緩沖液體沖洗，浸泡固定于0.1 mol/L中性多聚甲醛24 h。A組與B組將骨片組織置于10%(體積分?jǐn)?shù))EDTA脫鈣液2～3周，每隔4 d需要更換一次脫鈣液，待針刺組織無(wú)明顯阻力感時(shí)取出。骨片及囊壁組織采用不同乙醇梯度按順序進(jìn)行脫水處理，并且予二甲苯透明處理，浸泡于液體石蠟中，待石蠟?zāi)贪窈筮B續(xù)6 μm厚度切片，撈片到載玻片中，烤片后待用。一份標(biāo)本保存在預(yù)冷的PBS緩沖液中，以供掃描電鏡觀察。

1.4.3 蘇木精-伊紅(HE)染色

將切片置于37 ℃恒溫箱中過夜，后分別經(jīng)過二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min，70%、80%、90%、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇各5 min，超純水5 min脫蠟入水。隨后蘇木精染色2.5 min，超純水沖洗干凈，然后在1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸乙醇中分化3 s后自來水沖洗干凈，ddH2O中反藍(lán)20 min，伊紅染色3～5 s，風(fēng)干后用中性樹脂封固, 顯微鏡下觀察。

1.4.4 透射電子顯微鏡

將PBS中的標(biāo)本經(jīng)0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)沖洗3遍后，置于4%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定2 h，再用0.1 mmol/L二甲砷酸鈉緩沖液沖洗3次，固定過夜，生理鹽水沖洗3遍，2%(體積分?jǐn)?shù))鋨酸固定2 h以上，依次用乙醇、叔丁醇逐級(jí)脫水，各15 min。后在4 ℃環(huán)境放置24 h以上，放入液氮冷凍，干燥后鍍金，掃描電子顯微鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本截取5個(gè)不同視野，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)圖像中骨吸收面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果

A組可見顱骨表面有鈦顆粒浸潤(rùn)，顱骨骨面不光整，部分骨面有侵蝕缺損。B組氣囊組織中有鈦顆粒浸潤(rùn)，色灰暗，氣囊囊壁增厚，有炎性水腫，表面較光滑，質(zhì)地脆，易剝離。C組可見植骨顱骨塊與周圍的氣囊組織之間有單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)，有鈦顆粒包裹，且炎性反應(yīng)明顯，并伴有新生血管增生(圖2)。

圖2 三組鈦顆粒誘導(dǎo)模型取材過程Fig.2 Material extraction process of three groups of titanium particles induction modelA: Titanium particles stimulate skull osteolysis model； B： Titanium particles stimulate balloon model group； C： Titanium particles stimulate balloon model of bone graft.

2.2 HE染色結(jié)果

A組可見顱骨表面鈦顆粒周圍有部分炎性反應(yīng)，少許團(tuán)簇狀巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，骨溶解較少，骨面欠平整(圖3A)。在B組可見氣囊囊壁厚，囊壁內(nèi)有多種巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，周圍炎性反應(yīng)顯著，成纖維細(xì)胞少見，氣囊壁組織可有鈦顆粒聚集，并由巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)包繞而結(jié)節(jié)樣增生，夾雜著成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管組織(圖3B)。C組可見鈦顆粒周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維結(jié)締組織增生，引起顱骨骨片表面廣泛骨溶解發(fā)生，骨面有塌陷(圖3C)。

圖3 三組鈦顆粒誘導(dǎo)模型Fig.3 HE staining results of three groups of titanium particles induced modelA: Titanium particles stimulate skull osteolysis model(HE staining,20×). Red arrows are labeled titanium particles, green arrows are labeled inflammatory cells; B: Titanium particles stimulate balloon model group(HE staining,40×); C: Titanium particles stimulate balloon model of bone graft (HE staining,20×).

2.3 透射電子顯微鏡結(jié)果

A組可見破骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見到鈦顆粒，細(xì)胞周圍基質(zhì)可見膠原蛋白及骨樣基質(zhì)等，鈦顆粒下有部分片狀骨溶解，數(shù)量較少，大小不一。B組可見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有鈦顆粒浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞變形，呈皺縮狀，細(xì)胞核固縮、核碎裂及核仁消失，細(xì)胞內(nèi)可見大量大小不等的空泡，周圍的細(xì)胞外散在有基質(zhì)組織，基質(zhì)組織中含水量減少。C組小鼠顱骨骨面缺失，殘缺的骨面下可見有大片骨溶解，骨片周圍有增生的破骨細(xì)胞，在其周圍散落著部分活躍的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)含有大量骨樣基質(zhì)，細(xì)胞胞質(zhì)可見大小不等的團(tuán)簇狀鈦顆粒及完整的高爾基體(圖4)。用IPP軟件分析圖像，A組骨溶解面積為(190.67±26.33)nm2，C組骨溶解面積為(228.67±30.06)nm2，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.217，P<0.05)。

圖4 3組鈦顆粒誘導(dǎo)模型掃描電子顯微鏡結(jié)果(5 000×)Fig.4 Scanning electron microscope results of three groups of titanium particles induced modelA: Titanium particles stimulate skull osteolysis model; B: Titanium particles stimulate balloon mode group; C: Titanium particles stimulate balloon model of bone graft. Red arrows are labeled titanium particles, yellow arrows are labeled osteolysis areas.

3 討論

隨著人工假體置換術(shù)發(fā)展，假體的材料有很多，最常見的是以鈦為原料的金屬類假體，不但耐磨耐腐蝕，而且容易與人的自體骨相適應(yīng)，但長(zhǎng)期的磨損造成的磨損顆粒是導(dǎo)致人工假體松動(dòng)的重要原因之一[5]。磨損顆粒在人體內(nèi)到底會(huì)引起什么樣的病理生理變化，目前為止并沒有一個(gè)確切的答案，由于人體標(biāo)本取材困難，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型成為研究此類問題的關(guān)鍵。1996年Allen等[6]就開始在大鼠體內(nèi)植入特制人工假體建立了骨溶解動(dòng)物模型，證實(shí)假體會(huì)與周圍的骨組織發(fā)生炎性反應(yīng)，出現(xiàn)了異形細(xì)胞。

近年來越來越多的實(shí)驗(yàn)[7-8]選用小鼠制作骨溶解動(dòng)物模型，采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)在于能近似準(zhǔn)確地模仿無(wú)菌性松動(dòng)引起的人工假體周圍骨溶解的病理反應(yīng)過程，簡(jiǎn)便、快捷地對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)；更易于研究無(wú)菌性松動(dòng)中破骨細(xì)胞增生、成熟、分化；實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，操作步驟簡(jiǎn)化。更重要的是，研究[9]顯示，小鼠模型的背部氣囊組織中囊壁組織的細(xì)胞組成與人體內(nèi)滑膜等軟組織類似，為建立真實(shí)的人工關(guān)節(jié)術(shù)后模型提供了理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)選用的純鈦顆粒作為磨損顆粒，主要由于純鈦顆粒在純度和顆粒大小都能符合實(shí)驗(yàn)用條件[10]。此外，顆粒需要通過內(nèi)毒素檢測(cè)方可用于實(shí)驗(yàn)，純鈦顆粒在這方面的實(shí)驗(yàn)要求條件已經(jīng)成熟。合金顆粒由多種金屬材料構(gòu)成，組成比較復(fù)雜，顆粒大小及純度不容易掌控，對(duì)于內(nèi)毒素的內(nèi)毒素檢測(cè)比較困難，單因素控制難以實(shí)現(xiàn)[11]。

鈦顆粒刺激小鼠顱骨骨溶解的動(dòng)物模型是將鈦顆放置于顱骨骨膜缺損區(qū)，與骨膜緊密接觸，出現(xiàn)的骨溶解病理環(huán)境，可以更好地模擬假體周圍無(wú)菌性松動(dòng)骨組織的病理改變，是一種急性溶骨性病理模型范疇，能快速簡(jiǎn)介建立的一種無(wú)菌性松動(dòng)動(dòng)物模型[12]。與氣囊植骨組相比，骨溶解面積小，且在骨溶解區(qū)域外可見破骨細(xì)胞，細(xì)胞基質(zhì)有散在的膠原蛋白和骨樣基質(zhì)，可能是由于有骨重建過程的參與，在鈦顆粒刺激的炎性刺激下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)向成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化[13]。鈦顆粒刺激顱骨模型中，誘導(dǎo)的骨組織有神經(jīng)、營(yíng)養(yǎng)和血供支持，可以比較真實(shí)地還原磨損顆粒在體內(nèi)關(guān)節(jié)腔誘導(dǎo)骨溶解的病理生理環(huán)境，可以反映出骨重建過程中成骨細(xì)胞的成骨作用與破骨細(xì)胞的溶骨反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡[14]。而且此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建可以有利于縮短實(shí)驗(yàn)周期。然而，其缺點(diǎn)為磨損顆粒在骨膜外，多引起皮下組織較強(qiáng)的炎性反應(yīng)，而溶骨時(shí)間短，且在皮下組織缺乏關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境中相應(yīng)的組織諸如滑膜組織及其相應(yīng)的分泌功能[15]。

氣囊模型是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下注射無(wú)菌空氣，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部形成穩(wěn)定的氣囊組織后，氣囊內(nèi)部的纖維結(jié)締組織不斷成熟，囊壁細(xì)胞和囊腔內(nèi)部基本滲液的有效成分與人關(guān)節(jié)的滑膜組織相比，具有明顯的相似性[16]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠氣囊的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，選用鈦顆粒作為磨損顆粒注入氣囊內(nèi)，直接刺激氣囊囊腔出現(xiàn)無(wú)菌性炎性反應(yīng)，用以模擬假體松動(dòng)病理過程中磨損顆粒對(duì)關(guān)節(jié)周圍軟組織的直接刺激，這也是本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新之處。通過大體觀察，模型組小鼠的氣囊囊壁存在明顯的炎性反應(yīng)，并伴有新生血管增生，在組織病理學(xué)觀察中，氣囊囊壁在鈦顆粒的直接刺激下，有巨噬細(xì)胞增生、變性及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性反應(yīng)明顯，部分囊壁細(xì)胞核固縮、裂解，細(xì)胞基質(zhì)中含水量減少，此病理變化和人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的翻修手術(shù)中所取滑膜組織炎性反應(yīng)病理過程具有明顯的相似性，Park等[17]研究顯示，膝關(guān)節(jié)假體周圍的軟組織彈性減弱、膠原纖維的炎性變是導(dǎo)致假體松動(dòng)的重要因素之一。通過氣囊模型與氣囊植骨組的對(duì)比，可以觀察到骨溶解的發(fā)生對(duì)囊壁的炎性反應(yīng)的影響，以模擬人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解的發(fā)生對(duì)關(guān)節(jié)周圍滑膜的影響[18]。

鈦顆粒刺激氣囊植骨模型組是在氣囊建立的前提下，在氣囊內(nèi)植入骨片及鈦顆粒懸液，以觀察氣囊內(nèi)出現(xiàn)一系列溶骨病理改變，是一種慢性溶骨性病理模型[19]，最大程度還原了關(guān)節(jié)內(nèi)磨損顆粒對(duì)骨溶解及滑膜炎產(chǎn)生影響的病理生理環(huán)境。本組模型大體觀察可見植入骨塊與囊壁組織之間的炎性反應(yīng)明顯，周圍組織紅腫、滲出并伴有血管增生，組織病理學(xué)結(jié)果可見在顱骨骨塊表面骨吸收現(xiàn)象明顯，骨塊周圍有增生活躍的破骨細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)下可觀察到團(tuán)狀鈦顆粒周圍部分破骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)高爾基體豐富，這些改變與臨床上人工關(guān)節(jié)翻修手術(shù)中的所取的關(guān)節(jié)滑膜標(biāo)本組織的炎性表現(xiàn)類似[20]，驗(yàn)證了氣囊植骨模型中既能保留氣囊囊壁對(duì)刺激顆粒的敏感性，又可以模擬人工關(guān)節(jié)術(shù)后晚期顆粒誘導(dǎo)的骨溶解反應(yīng)的病理過程[21]。但此模型中的骨組織由于缺少血供、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持，不能將骨溶解中骨組織的自體修復(fù)體現(xiàn)出來，不能還原破骨細(xì)胞溶骨及成骨細(xì)胞修復(fù)的動(dòng)態(tài)平衡[22]，這一點(diǎn)在研究討論時(shí)還需與顱骨誘導(dǎo)模型的骨溶解病理過程相結(jié)合。

綜上所述，3種鈦顆粒刺激下的小鼠骨溶解動(dòng)物模型各有利弊，可以反映不同情況下假體周圍骨溶解的病理變化，同時(shí)建立不同的動(dòng)物模型可以各取所長(zhǎng)，更有利于探討人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)不同階段的病理進(jìn)程。這3種動(dòng)物模型中，氣囊植骨模型組不僅能模擬出磨損顆粒刺激產(chǎn)生的界膜組織，也能模擬磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解反應(yīng)，在磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解病理過程中模擬度更高。