18F-硼氨酸細(xì)胞攝取機(jī)制研究

李 詝 李 囡 劉志博 楊 志*

(1. 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所核醫(yī)學(xué)科 惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142； 2. 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

氨基酸、糖類以及核酸是人類三大最基本的營養(yǎng)物質(zhì)。正因如此，氨基酸轉(zhuǎn)運載體(amino acid transporter, AAT)也成為人體內(nèi)最為重要的營養(yǎng)物質(zhì)與神經(jīng)信號分子的轉(zhuǎn)運體系之一[1]。多年的研究[2-3]表明，某些氨基酸轉(zhuǎn)運體，如L型氨基酸轉(zhuǎn)運體-1(large-neutral amino acid transporter-1,LAT-1)在惡性腫瘤細(xì)胞表面有著特異性的高表達(dá)，且它們的表達(dá)程度與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。因此，通過無創(chuàng)性的PET影像對轉(zhuǎn)運體的表達(dá)進(jìn)行評測，對癌癥的診斷有著重大的臨床價值，同時也是發(fā)展新一代PET影像探針的重要途徑[4-5]。

本研究所用的新型分子探針——F-18標(biāo)記的苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)是一系列全新的化合物——硼氨酸中的一種[6]。硼氨酸中的三氟化硼(-BF3)的引入，在基本不改變其體內(nèi)活性的同時，一方面顯著地提高了硼氨酸的生物穩(wěn)定性，另一方面為F-18的標(biāo)記帶來了極大的便捷。相比于傳統(tǒng)的放射性氨基酸的標(biāo)記，生產(chǎn)步驟大大簡化[7]。此外，細(xì)胞實驗[8-9]證實，硼氨酸經(jīng)由對應(yīng)的氨基酸的轉(zhuǎn)運載體進(jìn)入細(xì)胞，并在特異性上和天然氨基酸相似。且既往的動物實驗[10]證實：18F-BF3-Phe在活體內(nèi)有良好的穩(wěn)定性，而在腫瘤內(nèi)有很高的特異性攝取，且在炎癥中的攝取較低，與傳統(tǒng)的氨基酸分子探針相比，優(yōu)勢明顯。

本研究采用半自動方法對18F-BF3-Phe進(jìn)行了標(biāo)記，并完善了LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞放射性攝取實驗，通過系統(tǒng)的細(xì)胞實驗，建立18F-硼氨酸細(xì)胞攝取與LAT-1轉(zhuǎn)運體表達(dá)的定量關(guān)系，初步闡述了18F-硼氨酸在癌細(xì)胞中的攝取機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

二氯甲基甲基醚、三氟甲磺酸甲酯、二異丙胺基鋰、苯基硅烷、無水乙腈、四丁基氟化銨(北京化工廠)；Sep-pak C18柱(美國Waters公司)；Muhiscreem抽濾板(美國Millipore公司)；氟多功能模塊(北京派特公司)；RM905型放射性活度儀(中國計量科學(xué)研究院)；FT-163γ井型計數(shù)器(北京核儀器廠)；pH測量計(意大利Hanna公司)；伽馬計數(shù)儀(美國Packard公司)。

293T細(xì)胞、人肺腺癌PC9細(xì)胞、人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌BXPC3細(xì)胞、人前列腺癌PC3細(xì)胞、人肝細(xì)胞癌HEPG2細(xì)胞(國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶、青霉素鏈霉素溶液(美國Hyclone公司)；Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；Lipofectin試劑(美國Invitrogen公司)。

1.2 18F-BF3-Phe的放射性標(biāo)記

BF3-Phe的化學(xué)合成參照Liu等[6]的文獻(xiàn)報道完成。

放射性標(biāo)記采用18F-19F同位素交換法(圖1)，使用氟多功能模塊進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記條件為：0.5 mg苯丙硼氨酸(BF3-Phe)，反應(yīng)溫度80 ℃，反應(yīng)pH=2.0～2.5，反應(yīng)時間10 min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物使用Sep-pak C18柱純化，產(chǎn)物最終經(jīng)Millipore無菌針頭式過濾器除菌后使用。

圖1 18F-19F同位素交換法標(biāo)記苯丙硼氨酸Fig.1 18F-BF3-Phe is radio-synthesized via one-step 18F-19F isotope exchange

1.3 質(zhì)量控制

1.3.1 化學(xué)純度及放化純度的檢測

采用高效液相色譜法作化學(xué)純度與放化純度分析。液相系統(tǒng)由Waters515、Waters486紫外檢測器和γ-RAM檢測器構(gòu)成。采用Waters C18色譜柱，檢測波長262 nm，以乙腈∶醋酸/醋酸銨緩沖溶液(pH=4)=15∶85為流動相。

1.3.2 pH值的測定

標(biāo)記反應(yīng)pH值及終產(chǎn)物pH值由pH計測定。

1.3.3 安全性與異常毒性實驗

18F-BF3-Phe溶液經(jīng)Millipore無菌針頭式過濾器除菌后送細(xì)菌室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。細(xì)菌內(nèi)毒素實驗采用鱟試驗法，參照《中華人民共和國藥典》(2015年版，四部)[11]規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，依次完成鱟試劑靈敏度的復(fù)核、注射液的干擾實驗和樣品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

異常毒性實驗：選取4～6周齡ICR小鼠5只，體質(zhì)量為19～21 g，按正常飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。每只尾靜脈注射18F-BF3-Phe注射液0.2 mL，劑量為37 MBq，其劑量相當(dāng)于體質(zhì)量為60 kg的人用劑量的300倍。注射前后稱小鼠體質(zhì)量，觀察注射后48 h小鼠生存、飲食、活動及體質(zhì)量變化及1周后生存情況。

1.4 LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝取實驗

1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗

提前24 h將用DMEM培養(yǎng)基[10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清]培養(yǎng)的293T細(xì)胞消化后種植在12孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞懸液濃度為5×105mL，每孔體積1.0 mL。批量配制人LAT-1基因質(zhì)粒DNA稀釋液，對于每孔細(xì)胞，使用50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋0.5 μgDNA。其中兩孔使用插入mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA，使其同時表達(dá)熒光蛋白，用于在熒光顯微鏡下間接評估轉(zhuǎn)染效率。批量配制Lipofectin試劑稀釋液，對于每孔細(xì)胞，使用50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋1.5 μL Lipofectin試劑。Lipofectin 稀釋后，在5 min內(nèi)同稀釋的DNA混合?；旌舷♂尯蟮腄NA和Lipofectin復(fù)合物在室溫保溫20 min。將提前鋪好板的293T細(xì)胞換液后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，然后直接將復(fù)合物100 μL加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。加入復(fù)合物后的293T細(xì)胞置入37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下觀察加有插入mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA的細(xì)胞孔，評估轉(zhuǎn)染效率。

1.4.2 LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝取實驗

提前24 h將已轉(zhuǎn)染人LAT-1基因質(zhì)粒DNA的293T細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染細(xì)胞占0%、20%、40%、60%、80%及100%的比例混合接種于24孔板，每種比例設(shè)置4個復(fù)孔，每孔體積0.5 mL，細(xì)胞數(shù)量為5×105mL，置入37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，小心吸掉培養(yǎng)基，每孔用1 mL事先預(yù)熱(37 ℃)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，包含0.9 mol/L Ca2+和1.05 mol/L Mg2+)清洗3次。每孔中加入0.5 mL PBS配制的18F-BF3-Phe 37kBq(1.0 μCi)，放入37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。30 min后取出培養(yǎng)板，小心吸掉PBS，每孔用1 mL不含Ca2+和Mg2+的冷PBS清洗3次。每孔加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH收集細(xì)胞，將每孔中液體移入EP管中，使用伽馬計數(shù)儀計量放射性計數(shù)。

1.5 多種腫瘤細(xì)胞攝取實驗

提前24 h將PC9、 BXPC3、PC3、HEPG2細(xì)胞分別用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶消化，離心后去掉上清，用RPMI-1640培養(yǎng)基[10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清]制成單個細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)儀測定細(xì)胞數(shù)量為1×106mL，將各細(xì)胞株接種于24孔培養(yǎng)板上，每孔體積0.5 mL，置入37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每種細(xì)胞株設(shè)置15、30、60 min 3個時間點，每個時間點設(shè)置4個復(fù)孔。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，小心吸掉培養(yǎng)基，每孔用1 mL 37 ℃預(yù)熱的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，含0.9 mol/L Ca2+和1.05 mol/L Mg2+)清洗3次。每孔中加入0.5 mL PBS配制的18F-BF3-Phe 37 kBq(1.0 μCi)，放入37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于15、30、60 min后取出培養(yǎng)板，小心吸掉PBS，每孔用1 mL不含Ca2+和Mg2+的冷PBS清洗3次。每孔加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH收集細(xì)胞，將每孔中液體移入EP管中，使用伽馬計數(shù)儀計量放射性計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)記及質(zhì)控實驗

BF3-Phe的模塊化標(biāo)記呈現(xiàn)良好的可重復(fù)性，標(biāo)記產(chǎn)率可達(dá)到30%～40%，標(biāo)記后的硼氨酸無須高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)純化，穩(wěn)定性好。HPLC質(zhì)控結(jié)果可見，標(biāo)記所得的硼氨酸有較高的放射化學(xué)純度與化學(xué)純度(圖2)。標(biāo)記后終產(chǎn)物pH值為中性7.0。細(xì)菌培養(yǎng)及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均為陰性。異常毒性實驗小鼠活動正常，無死亡。18F-BF3-Phe注射液無菌、安全無毒性，符合醫(yī)用放射性探針基本要求。

圖2 標(biāo)記后的苯丙硼氨酸具有很高的化學(xué)純度和放射性純度Fig.2 18F-BF3-Phe with high chemical purity and radiochemical purity was obtained

2.2 LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝取實驗

2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗

有兩孔293T細(xì)胞使用了插入mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使其可同時表達(dá)mCherry熒光蛋白，這樣轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會同時在細(xì)胞膜表達(dá)LAT-1及mCherry熒光蛋白，即在熒光顯微鏡下可見，可間接反映用人LAT-1基因質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率。轉(zhuǎn)染插有mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA的293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，轉(zhuǎn)染效率約為40%～50%(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染插有mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA的293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后在熒光顯微鏡下觀察(40×)Fig.3 The fluorescent image of 293T cells transfected by human LAT-1 gene plasmid DNA inserted with mCherry sequence after 24 h culture LAT-1：large-neutral amino acid transporter-1.

2.2.2 LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝取實驗

加入37kBq18F-BF3-Phe培養(yǎng)30 min后，可見細(xì)胞的放射性攝取隨著LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例的增加而逐漸增加，基本呈線性關(guān)系(表1，圖4)。

表1 各比例轉(zhuǎn)染LAT-1的293T細(xì)胞攝取18F-BF3-Phe情況Tab.1 Uptake of 18F-BF3-Phe in LAT-1-293T with different transfection level

圖4 18F-BF3-Phe攝取值與轉(zhuǎn)染LAT-1的293T細(xì)胞的比例呈正相關(guān)Fig.4 The uptake of 18F-BF3-Phe was positively correlated with the proportion of LAT-1-293TLAT-1： large-neutral amino acid transporter-1; %AD： the percentage of cell uptake in total radioactivity.

2.3 多種腫瘤細(xì)胞攝取實驗

如表2所示為不同腫瘤細(xì)胞分別在加入18F-BF3-Phe 15、30、60 min后的 %AD值，圖5為相應(yīng)的曲線圖?？梢?8F-BF3-Phe在PC9、BXPC3、PC3、HEPG2 4種腫瘤細(xì)胞中均有攝取，并隨時間推移呈逐漸增加趨勢。其中PC9及BXPC3細(xì)胞對18F-BF3-Phe的攝取更為顯著，隨時間推移攝取明顯增加。

表2 不同腫瘤細(xì)胞在加入18F-BF3-Phe 15、30、60 min后的%AD值Tab.2 The uptake of 18F-BF3-Phe in different cell lines after 15, 30 and 60 min 18F-BF3-Phe incubation %AD

圖5 不同腫瘤細(xì)胞在不同時間點18F-BF3-Phe攝取值Fig.5 The uptake of 18F-BF3-Phe in various cell lines with different incubating time%AD： the percentage of cell uptake in total radioactivity.

3 討論

本研究采用半自動方法對苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)進(jìn)行標(biāo)記，相較于18F-FDG、11C-MET等傳統(tǒng)的放射性分子探針，硼氨酸的放射性標(biāo)記無須共沸干燥與HPLC純化，一步即可完成標(biāo)記，且標(biāo)記產(chǎn)率較高、純度好、比活度高，所生產(chǎn)的18F-BF3-Phe注射液無菌、安全、無毒性，較11C-MET等其他氨基酸放射性分子探針有明顯優(yōu)勢，將更易于今后進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化。

LAT-1是一種不依賴鈉離子的氨基酸轉(zhuǎn)運體。主要存在于腦、結(jié)腸、肺、肝臟、胸腺、卵巢、皮膚及腫瘤細(xì)胞中，跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運例如酪氨酸、苯丙氨酸這類大分子中性氨基酸。所有氨基酸均是親水的，因此必須在選擇性轉(zhuǎn)運蛋白的幫助下才能通過細(xì)胞膜。大部分氨基酸轉(zhuǎn)運體可以識別不止一種氨基酸。因為腫瘤細(xì)胞對氨基酸的需要量很大，其細(xì)胞表面的選擇性氨基酸轉(zhuǎn)運體的數(shù)量自然會上調(diào)以滿足對氨基酸的需要。因此，LAT-1在多種腫瘤中高表達(dá)，包括惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌等，其表達(dá)與腫瘤的增殖、血管生成及較差的預(yù)后密切相關(guān)。并且LAT-1隨著腫瘤的進(jìn)展表達(dá)相應(yīng)增高，在高級別腫瘤及已有轉(zhuǎn)移的腫瘤中均可見其表達(dá)更高。特別是，LAT-1在腫瘤相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色，向腫瘤細(xì)胞生長提供必需氨基酸和一些促進(jìn)增殖的信號分子，比如可以激活mTOR旁路的分子。并且，抑制LAT-1的功能可以減少腫瘤細(xì)胞的增殖，這使其可以成為一個新型的抗腫瘤治療的可行靶點?；贚AT-1上述在腫瘤組織中高表達(dá)的特點，用放射性標(biāo)記對應(yīng)氨基酸進(jìn)行PET顯像即可明確LAT-1表達(dá)情況，進(jìn)而進(jìn)行腫瘤顯像并了解其增殖、預(yù)后等情況。

硼氨酸擁有與天然氨基酸完全一致的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，它們是天然氨基酸的等電子體[6]。經(jīng)細(xì)胞實驗[6]證實，硼氨酸經(jīng)由對應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運載體進(jìn)入細(xì)胞，并在渠道選擇性上和天然氨基酸基本一致。本研究中所用顯像劑苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)，即為一種苯丙氨酸類似物，通過LAT-1轉(zhuǎn)運，可較特異性的被腫瘤攝取，并且不參與蛋白質(zhì)代謝，是一種很有用的氨基酸顯像劑。

LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝取實驗意在明確18F-BF3-Phe與LAT-1轉(zhuǎn)運體表達(dá)的相關(guān)性，以證實其確實經(jīng)LAT-1轉(zhuǎn)運并可顯示LAT-1的表達(dá)情況。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗中，有兩孔293T細(xì)胞使用了插入mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使其可同時表達(dá)mCherry熒光蛋白，這樣轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會同時在細(xì)胞膜表達(dá)LAT-1及mCherry熒光蛋白，即在熒光顯微鏡下可見，可間接反映用人LAT-1基因質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率。24 h后在熒光顯微鏡下觀察插入mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的效率約為40%～50%，可推測用人LAT-1基因質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率與之相似或高于插入mCherry序列的人LAT-1基因質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率(新插入多余的序列并不一定在原質(zhì)粒DNA中均成功插入，可能使轉(zhuǎn)染效率被低估)，因此293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染人LAT-1基因質(zhì)粒DNA成功，其細(xì)胞膜表面高表達(dá)LAT-1，可用于后續(xù)細(xì)胞攝取實驗。而在18F-BF3-Phe細(xì)胞攝取實驗中，細(xì)胞所攝取的放射性隨著LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增多而增多，呈現(xiàn)出明顯的18F-BF3-Phe攝取與LAT-1表達(dá)的正相關(guān)性。證實了18F-BF3-Phe同苯丙氨酸一樣經(jīng)LAT-1轉(zhuǎn)運，并且可體現(xiàn)LAT-1的表達(dá)高低，這是后續(xù)一系列實驗的基本理論依據(jù)，為后續(xù)的腫瘤細(xì)胞實驗，以及未來的動物以及人體實驗打下了良好的基礎(chǔ)。

雖有研究[12]表明LAT-1在各種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，但其在不同腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)程度卻也不盡相同，并且在同一種腫瘤中，由于不同的分化或分級程度以及是否轉(zhuǎn)移等因素,LAT-1的表達(dá)會有所差異[13]。本研究選擇了PC9(人肺腺癌細(xì)胞)、BXPC3(人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌細(xì)胞)、PC3(人前列腺癌細(xì)胞)、HEPG2(人肝細(xì)胞癌細(xì)胞)4株人常見腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行腫瘤細(xì)胞攝取實驗，以了解18F-BF3-Phe在不同腫瘤中的攝取情況。在加入18F-BF3-Phe15、30、60 min后，可見PC9、BXPC3、PC3、HEPG2 4種腫瘤細(xì)胞中均有放射性攝取，并且隨時間推移均呈逐漸增加趨勢。其中PC9及BXPC3細(xì)胞對18F-BF3-Phe的攝取更為顯著，隨時間推移攝取明顯增加。雖然這4株細(xì)胞只是肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌及肝細(xì)胞癌的一個細(xì)胞株，但也還是具有一定的代表性，根據(jù)這個細(xì)胞攝取結(jié)果可以預(yù)測18F-BF3-Phe在肺癌及胰腺癌顯像中會有更好的效果，未來的動物實驗可選擇PC9及BXPC3細(xì)胞建立腫瘤動物模型。另外，根據(jù)既往研究[6]結(jié)果，18F-BF3-Phe在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG中亦有較高攝取，適于進(jìn)行腫瘤動物模型顯像。并可以推測在人體內(nèi)相關(guān)腫瘤也會有較好顯像效果，為未來的臨床轉(zhuǎn)化提供了理論基礎(chǔ)。

結(jié)論:1)本研究首先對新型分子探針18F-BF3-Phe進(jìn)行了模塊化成功標(biāo)記，方法簡便高效。通過LAT-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝取實驗顯示18F-BF3-Phe攝取與LAT-1轉(zhuǎn)運體表達(dá)之間呈正相關(guān)，明確了18F-BF3-Phe經(jīng)由LAT-1進(jìn)入細(xì)胞的攝取機(jī)制，為進(jìn)一步的體內(nèi)實驗提供了重要的理論基礎(chǔ)。2)多種腫瘤細(xì)胞攝取實驗顯示18F-BF3-Phe在多種腫瘤細(xì)胞中均有高攝取，顯示該探針在腫瘤顯像方面進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的良好前景。